Name: isolation, fixation, and immunofluorescence imaging of mouse adrenal glands
Uploaded: 2018-10-02T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Fixation, and Immunofluorescence Imaging of Mouse Adrenal Glands at JoVE.com

Vi takker Dr. Mohamad Zubair for hans forslag og teknisk assistanse i etableringen av denne protokollen. Dette arbeidet ble støttet av National Institute Diabetes og fordøyelsesenzymer og nyre sykdommer, nasjonale institutter for helse Research Grant 2R01-DK062027 (til G.D.H).

Alle metodene ble utført i samsvar med institusjonelt godkjent protokoller under auspice av University på bruk og vare på dyrene på University of Michigan.
1. forberedelse til operasjon
<ol><li>På dagen før kirurgi, forberede 4% paraformaldehyde (PFA) / fosfat bufret saltvann (PBS). Ved frossen dele, fortsette å tine en og lagre på 4 ° C. NOTE 4% PFA er ikke stabil for mer enn 48 timer. FORSIKTIG: PFA er giftig, unngå kontakt med hud og øyne, og kast i en egnet beholder.</li...

<ol>
	<li>Brandtzaeg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+increasing+power+of+immunohistochemistry+and+immunocytochemistry.">The increasing power of immunohistochemistry and immunocytochemistry.</a> Journal of Immunological Methods. 216 (1-2), 49-67 (1998).</li><li>Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G., da Silva Pinhal, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+as+an+important+tool+in+biomarkers+detection+and+clinical+practice.">Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice.</a> Biomark Insights. 5, 9-20 (2010).</li><li>Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+properties+of+an+antibody+containing+a+fluorescent+group.">Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).</li><li>Lerario, A. M., Finco, I., LaPensee, C., Hammer, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Mechanisms+of+Stem/+Progenitor+Cell+Maintenance+in+the+Adrenal+Cortex.">Molecular Mechanisms of Stem/ Progenitor Cell Maintenance in the Adrenal Cortex.</a> Frontiers in Endocrinology. 8, (2017).</li><li>Yates, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adrenocortical+Development,+Maintenance,+and+Disease.">Adrenocortical Development, Maintenance, and Disease.</a> Endocrine Gland Development and Disease. 106, 239-312 (2013).</li><li>Jones, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+the+Mouse+Adrenal+Cortex+with+Special+Reference+to+the+Zona+Reticularis+and+to+Brown+Degeneration,+Together+with+a+Discussion+of+the+Cell+Migration+Theory.">Variation in the Mouse Adrenal Cortex with Special Reference to the Zona Reticularis and to Brown Degeneration, Together with a Discussion of the Cell Migration Theory.</a> Quarterly Journal of Microscopical Science. 89 (1), 53 (1948).</li><li>Sucheston, M. E. C., Samuel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Transient-Zone+in+the+Human+and+Mouse+Adrenal+Gland.">The Transient-Zone in the Human and Mouse Adrenal Gland.</a> The Ohio Journal of Science. 72, 120-126 (1972).</li><li>Guasti, L., Paul, A., Laufer, E., King, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+Sonic+hedgehog+secreting+and+receiving+cells+in+the+developing+and+adult+rat+adrenal+cortex.">Localization of Sonic hedgehog secreting and receiving cells in the developing and adult rat adrenal cortex.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 336 (1-2), 117-122 (2011).</li><li>Pihlajoki, M., Dorner, J., Cochran, R. S., Heikinheimo, M., Wilson, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adrenocortical+zonation,+renewal,+and+remodeling.">Adrenocortical zonation, renewal, and remodeling.</a> Frontiers in Endocrinology. 6, 27 (2015).</li><li>Farese, R. V., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+Droplets+Finally+Get+a+Little+R-E-S-P-E-C-T.">Lipid Droplets Finally Get a Little R-E-S-P-E-C-T.</a> Cell. 139 (5), 855-860 (2009).</li><li>Shen, W. J., Azhar, S., Kraemer, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplets+and+steroidogenic+cells.">Lipid droplets and steroidogenic cells.</a> Experimental Cell Research. 340 (2), 209-214 (2016).</li><li>Finco, I., LaPensee, C. R., Krill, K. T., Hammer, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+signaling+and+steroidogenesis.">Hedgehog signaling and steroidogenesis.</a> Annual Review of Physiology. 77, 105-129 (2015).</li><li>Paul, A., Laufer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+biotin+as+a+marker+of+adrenocortical+cells+with+steroidogenic+potential.">Endogenous biotin as a marker of adrenocortical cells with steroidogenic potential.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 336 (1-2), 133-140 (2011).</li><li>Lowe, J., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Stevens &amp; Lowe's Human Histology, 4th Edition. , 263-285 (2015).</li><li>Nagatsu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+for+human+catecholamine-synthesizing+enzymes.">Genes for human catecholamine-synthesizing enzymes.</a> Neuroscience Research. 12 (2), 315-345 (1991).</li><li>Berthon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+effects+of+Armc5+haploinsufficiency+on+adrenocortical+function.">Age-dependent effects of Armc5 haploinsufficiency on adrenocortical function.</a> Human Molecular Geneticst. 26 (18), 3495-3507 (2017).</li><li>Brown, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+retrieval+methods+for+immunohistochemistry.">Antigen retrieval methods for immunohistochemistry.</a> Toxicologic Pathology. 26 (6), 830-831 (1998).</li><li>Billinton, N., Knight, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+the+wood+through+the+trees:+a+review+of+techniques+for+distinguishing+green+fluorescent+protein+from+endogenous+autofluorescence.">Seeing the wood through the trees: a review of techniques for distinguishing green fluorescent protein from endogenous autofluorescence.</a> Analytical Biochemistry. 291 (2), 175-197 (2001).</li><li>Hirsch, R. E., San George, R. C., Nagel, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+fluorometric+determination+of+the+stable+state+of+aggregation+in+hemoglobins.">Intrinsic fluorometric determination of the stable state of aggregation in hemoglobins.</a> Analytical Biochemistry. 149 (2), 415-420 (1985).</li><li>Whittington, N. C., Wray, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+Red+Blood+Cell+Autofluorescence+for+Immunocytochemistry+on+Fixed+Embryonic+Mouse+Tissue.">Suppression of Red Blood Cell Autofluorescence for Immunocytochemistry on Fixed Embryonic Mouse Tissue.</a> Current Protocols in Neuroscience. 81, 28 (2017).</li><li>Watson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppressing+autofluorescence+of+erythrocytes.">Suppressing autofluorescence of erythrocytes.</a> Biotechnic &amp; Histochemistry. 86 (3), 207 (2011).</li><li>Epp, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+CLARITY+for+Clearing+Whole-Brain+and+Other+Intact+Organs.">Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs.</a> eNeuro. 2 (3), (2015).</li><li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO.">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).</li></ol>

Denne protokollen beskriver en metode for isolering av musen binyrene sammen med utarbeidelse og flekker av appa parafin-innebygd mus binyrene.
Sammenlignet med andre protokoller vi testet, har denne immunofluorescence protokollen bevist egnet for fleste av antistoffer i vårt laboratorium. I enkelte tilfeller kan det imidlertid krever noen justeringer for å forbedre flekker resultatene. En variabel som lett kan endres og testet er lengden på fiksering. I vårt laboratorium, inkubasjon i 4% ...

Immunohistochemistry er en teknikk for å oppdage vev komponenter med bruk av antistoffer mot bestemte mobilnettet molekyler og påfølgende flekker teknikker for å oppdage den konjugert antistoffer1. Denne immunohistochemical prosedyren krever bestemte fiksering og behandling av vev som bestemmes ofte empirisk for spesifikke antigen, vev og antistoff utnyttet2. Fixation er avgjørende for å bevare "originale" staten av vev og dermed opprettholde intakte mobilnettet og subcellular strukturer og uttrykk mønstre. Videre er behandling og innebygging prosedyrer pålagt å utarbeide vevet snitting i tynne skiver som brukes for histologic studier som involverer immunohistochemistry.
Immunostaining kan utføres med enten kromogent eller fluorescerende oppdagelsen. Kromogent oppdagelsen krever bruk av et enzym å konvertere et løselig substrat i en uløselig farget produkt. Mens dette enzymet kan være bøyd til antistoffer gjenkjenner antigen (primære antistoffer) er det oftere konjugert til antistoffer erkjenner det primære antistoffet (dvs., sekundær antistoffer). Denne teknikken er svært følsom; farget produktet som følge av den enzymatiske reaksjonen er photostable og krever bare et brightfield mikroskop for bildebehandling. Imidlertid kan kromogent immunostaining ikke være egnet når prøver å visualisere to proteiner som co Lokaliser, siden avsetning i én farge kan maskere avsettelsen av den andre. Ved co flekker, har immunofluorescence vist seg for å være mer fordelaktig. Ankomsten av immunofluorescence tilskrives Albert Svartfugl og kolleger, som har utviklet et system for å identifisere vev antigener med antistoffer merket med fluorescein og vise dem i inndelte vev under ultrafiolett lys3. Fluorescens gjenkjenning er basert på et antistoff konjugert med en fluorophore som sender ut lys etter eksitasjon. Fordi det finnes flere fluorophores med utslipp ved forskjellige bølgelengder (med ingen eller lite overlapp), denne oppdagelsen metoden er ideell for studiene i flere proteiner.
Binyrene er et par organ ligger over nyrene og preget av to embryologically forskjellige komponenter omgitt av en mesenchymal kapsel. Ytre binyrebarken, avledet fra det mesonephric mellomliggende mesoderm, utskiller steroidhormoner mens den indre margen, avledet fra neural toppen, produserer katekolaminer inkludert adrenalin, noradrenalin og dopamin. Binyrebarken er histologisk og funksjonelt delt i tre konsentriske soner, med hver sone sekresjon forskjellige klasser av steroidhormoner: ytre zona glomerulosa (zG) produserer mineralkortikoider som regulerer elektrolytt homeostase og intravascular volum; den midterste zona fasciculata (zF), utskiller direkte under zG, glukokortikoider som megle stressrespons gjennom mobilisering av energi butikker å øke plasma glukose; og de indre zona reticularis (zR), som syntetiserer sex steroid prekursorer (dvs. Dehydroepiandrosteron (DHEAS))4.
Noe variasjon i adrenocortical zonation finnes mellom arter: for eksempel Mus musculus mangler zR. Det unike postnatal X-sonen av M. musculus er rester av fetal cortex preget av små lipid-fattige celler med syre cytoplasms5. X-sonen forsvinner i puberteten i mannlige mus og etter det første svangerskapet i kvinnelige mus eller utarter gradvis i ikke-avlet kvinner6,7. Videre merket tortuosity og tykkelsen av zG utstillinger variasjon mellom arter som gjør organiseringen av eksterne stammen og stamfar celler i og ved siden av zG. Rotte, i motsetning til andre gnagere, har en synlig udifferensierte sone (zU) mellom zG og zF som fungerer som en stilk cellen sone eller en sone av forbigående forsterke progenitors. Om på zU er unik for rotter eller bare en mer fremtredende organisert klyngen av celler er ukjent8,9.
Celler av binyrebarken inneholder lipid dråper som lagrer kolesterol estere som tjener som forløperen til alle steroidhormoner10,11.  Begrepet "steroidogenesis" definerer prosessen med produksjon av steroid hormoner fra kolesterol via en rekke enzymatiske reaksjoner som involverer aktiviteten til steroidogenic faktor 1 (SF1), hvis uttrykket er en steroidogenic potensial. I binyrene finnes Sf1 uttrykk bare i celler av cortex12. En interessant studie fant uttrykket av endogene biotin i adrenocortical celler med steroidogenic potensielle13. Mens dette kan være årsaken til høyere bakgrunn i biotin/streptavidin-baserte flekker metoder, på grunn av gjenkjenning av endogene biotin av antistoff konjugert med streptavidin, kan denne karakteristiske brukes også til å skille de steroidogenic celler fra andre populasjoner i binyrene, dvs. endothelial, capsular og forlengede celler.
Innerveres av sympatiske preganglionic nerveceller, er adrenal medulla preget av basophilic celler med en detaljert cytoplasma som inneholder adrenalin og noradrenalin. Forlengede celler kalles "chromaffin" på grunn av det høye innholdet av katekolaminer som danner en brun pigment etter oksidering14. Tyrosin hydroksylase (TH) er enzymet som gir hastighetsbegrensning trinnet i syntesen av katekolaminer og i binyrene, uttrykkes bare i medulla15.
Her presenterer vi en protokoll for isolering av musen binyrene, deres behandling for innebygging i parafin snitting og en metode for å utføre immunofluorescence flekker på adrenal deler for å identifisere hvilke mobilnettet utgjør den binyrebarken og forlengede. Denne protokollen er en standard i vårt laboratorium for immunostaining med flere antistoffer rutinemessig brukes i vår forskning.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:657px;" width="658">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">24-well cell culture plate</td>
			<td style="width:156px;">Nest Biotechnology Co.</td>
			<td style="width:119px;">0412B</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Disposable needles 25Gx5/8&#34;</td>
			<td style="width:156px;">Exel International</td>
			<td style="width:119px;">26403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Paraplast plus&#160;</td>
			<td style="width:156px;">McCormik scientific</td>
			<td style="width:119px;">39502004</td>
			<td>Paraffin for tissue embedding</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Shandon biopsy cassettes II with attached lid</td>
			<td style="width:156px;">Thermo scientific</td>
			<td style="width:119px;">1001097</td>
			<td>Cassettes for tissue processing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">High Profile Microtome Blades</td>
			<td style="width:156px;">Accu-Edge</td>
			<td style="width:119px;">4685</td>
			<td>Disposable stainless steel blades</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Peel-a-way disposable plastic tissue embedding molds</td>
			<td style="width:156px;">Polysciences Inc.</td>
			<td style="width:119px;">18986</td>
			<td>Truncated,22mm square top tapered to 12mm bottom</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td style="width:156px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">12-550-15</td>
			<td>75x25x1 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Xylene</td>
			<td style="width:156px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:119px;">X5P1GAL&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">200 Proof Ethanol</td>
			<td style="width:156px;">Decon Labs, Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Certi-Pad Gauze pads&#160;</td>
			<td style="width:156px;">Certified Safety Mfg, Inc</td>
			<td style="width:119px;">231-210</td>
			<td>3&#34;x3. Sterile latex free gauze pads</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">M.O.M kit&#160;</td>
			<td style="width:156px;">Vector laboratories</td>
			<td style="width:119px;">BMK-2202</td>
			<td>For detecting mouse primary antibodies on mouse tissue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KimWipes</td>
			<td style="width:156px;">Kimtech</td>
			<td style="width:119px;">34155</td>
			<td>Wipes 4.4x8.4 inch</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Super PAP PEN</td>
			<td style="width:156px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:119px;">00-8899</td>
			<td>Pen to draw on slides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microscope cover glass&#160;</td>
			<td style="width:156px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">12-544-D</td>
			<td>Size: 22x50x1.5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DAPI</td>
			<td style="width:156px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D9542&#160;</td>
			<td>(Prepared in 20mg/mL stock)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ProLong Gold antifade reagent</td>
			<td style="width:156px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">P36930</td>
			<td>Mounting agent for immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">X-cite series 120Q</td>
			<td style="width:156px;">Lumen Dynamics</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Light source</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Coolsnap Myo</td>
			<td style="width:156px;">Photometrics</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Camera</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Optiphot-2&#160;</td>
			<td style="width:156px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">microtome</td>
			<td style="width:156px;">Americal Optical</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tissue embedder</td>
			<td style="width:156px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">EG1150 H&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tissue processor&#160;</td>
			<td style="width:156px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">ASP300S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Normal goat serum</td>
			<td style="width:156px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Mouse anti-TH</td>
			<td style="width:156px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">MAB318</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rabbit anti-SF1</td>
			<td>Ab proteintech group (PTGlabs)</td>
			<td style="width:119px;">&#160;custom made</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Alexa-488 Mouse IgG&#160; raised goat</td>
			<td style="width:156px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-545-003&#160;</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dylight-549 Rabbit IgG raised goat</td>
			<td style="width:156px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>111-505-003</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Citrate acid anhydrous</td>
			<td style="width:156px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:119px;">A940-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NIS-Elements Basic Research&#160;</td>
			<td style="width:156px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Software for imaging</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, fixation, and immunofluorescence imaging of mouse adrenal glands

Immunofluorescence er en veletablert teknikk for påvisning av antigener i vev med ansettelse av fluorochrome-konjugerte antistoffer og har et bredt spekter av programmer. Påvisning av antigener gir karakterisering og identifikasjon av flere celletyper. Ligger ovenfor nyrer og innkapslet av en lag av mesenchymal celler, er binyrene en endokrine organ består av to ulike vev med forskjellige embryologiske opprinnelse, mesonephric mellomliggende mesoderm-avledet ytre cortex og den nevrale kam-avledet indre marg. Binyrebarken utskiller steroider (dvs. mineralkortikoider, glukokortikoider, sex hormoner), mens adrenal medulla produserer katekolaminer (dvs. adrenalin, noradrenalin). Mens drive adrenal forskning, er det viktig å kunne skille unike celler med ulike funksjoner. Her gir vi en protokoll utviklet i vårt laboratorium som beskriver en rekke sekvensielle trinn kreves for å få immunofluorescence flekker som karakteriserer i celletyper av det adrenalin kjortelen. Vi fokusere på Disseksjon av musen binyrene, mikroskopiske fjerning av periadrenal fett etterfulgt av fiksering, behandling og parafin innebygging av vev. Vi beskriver snitting av vev blokker med en roterende mikrotom. Til slutt, detalj vi en protokoll for immunofluorescent farging av binyrene som vi har utviklet for å redusere både ikke-spesifikke antistoffer bindende og autofluorescence for å oppnå en optimal signal.

Figur 1 representerer en skjematisk hele protokollen beskrevet ovenfor. Binyrene høstes fra mus tilstøtende fettvev fjernes under dissecting mikroskop og adrenalin er så fast i 4% PFA. Etter dette trinnet er binyrene behandlet og innebygd i parafin, og delt med en mikrotom å kutte orgelet i tynne skiver som settes på objektglass. Etter tørking av delene, immunofluorescence utføres og delene er fotografert i mikroskopet.
<p class="jove_content" fo:k...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Fixation, and Immunofluorescence Imaging of Mouse Adrenal Glands at JoVE.com

Isolation, Fixation, and Immunofluorescence Imaging of Mouse Adrenal Glands

Her presenterer vi en metode for å isolere binyrene fra mus, fikse vev, del dem og utføre immunofluorescence flekker.

Isolasjon, fiksering og Immunofluorescence avbildning av musen binyrene

Immunofluorescence is a well-established technique for detection of antigens in tissues with the employment of fluorochrome-conjugated antibodies and has ...

Immunofluorescence er en grunnleggende metode som kan bidra til å svare på viktige spørsmål i binyrefeltet om binyreregulering, celleidentitet og funksjon. Den største fordelen med denne teknikken er at den tillater studiet av flere proteiner samtidig som morfologien til binyrevevet bevares. For å fjerne murine binyrene, kutt rundt det omkringliggende fettvevet og legg kjertelen i en brønn av en 24-multiwell plate som inneholder fersk PBS på is.Overfør kjertelen på en petriskål eller glassstøtte under et dissekeringsmikroskop og bruk to 25 gauge nåler for å fjerne det tilstøtende fettvevet. Når alt fettet er fjernet, fikse vevet i 4% paraformaldehyd ved fire grader Celsius med gynge i to timer. På slutten av inkubasjonen, skyll kjertelen med tre 15-minutters vasker ved fire grader Celsius i en til to milliliter frisk PBS per vask.Etter den siste vasken dehydrerer kjertelen i to sekvensielle etanolsenking ved fire grader Celsius med gynge i to timer per inkubasjon. For å forberede binyrvevet til behandling, pakk kjertelen i gasbind og legg binyrene i en vevsinnbyggende kassett. Deretter plasserer du kassetten i en krukke fylt med 70% etanol i fire grader Celsius-lagring til behandling.For å behandle vevet, sett kassetten inn i vevsprosessoren for behandling som angitt i tabellen. På slutten av programmet, overføre kassetten til en innebygging stasjon fylt med smeltet 65 graders parafin og bruke et par tang for å pakke ut gasbind. Overfør forsiktig binyrene i riktig posisjon i midten av bunnen av innebyggingsformen og hell den smeltede parafinen på kjertelen.Deretter flytter du forsiktig innebyggingsformen til et kjølebrett for å lette herding av parafinen. Før snitting med roterende mikrotom, merk en serie mikroskop lysbilder og legg lysbildene på en 37 grader Celsius lysbilde varmere. Dispenser ca 450 mikroliter autoklavet type en ultra rent vann på hver lysbilde og sett seksjonen kutte tykkelsen av mikrotomen til fem mikrometer.Legg det innebygde vevet på skjæreblokken og senk parafinblokken til prøven er på ansiktsnivå med kanten av mikrotombladet. Rotere håndhjulet med en jevn rytme, utføre en innledende trimming for å fjerne parafin og utsette binyrevevet. Deretter får du fem mikrometerseksjoner gjennom enden av binyrene ved hjelp av tang for å overføre hver seksjon til vanndråpen på en av de forhåndsmerkede lysbildene som det samles inn.Etter å ha bekreftet tilstedeværelsen av vev i seksjonene ved mikroskopi, tørk lysbildene på kokeplaten i omtrent to timer og stek dem minst over natten på et lysbildebrett ved 37 grader Celsius til ikke mer vann er synlig. Når de er tørre, oppbevarer du lysbildene i en glideboks ved romtemperatur. For immunofluorescence antigen gjenfinning, de-parafinisere lysbildene med to fem-minutters 100% xylen nedsenking, etterfulgt av rehydrering i en synkende etanol og vann nedsenking serien.Etter nedsenking av vannet, overfør lysbildene til en metallsklieholder og legg holderen i et beger med kokende 0,01 molarsitrat på en kokeplate i 10 minutter. På slutten av inkubasjonen, fjern begeret fra kokeplaten og la det avkjøles i 20 minutter, pass på at alle binyreksjonene fortsatt er dekket med buffer. Når begeret er avkjølt, overfører du skliene til en Coplin-krukke i tre 10-minutters vasker i frisk PBS med skånsom gynge.Etter den siste vasken tørker du forsiktig overflaten av hvert lysbilde uten å skade vevsseksjonene og bruker en hydrofob markør for å lage en sirkel rundt hver seksjon. Plasser lysbildene i et fuktet kammer og tilsett raskt minst 50 mikroliter med blokkeringsløsning i hver seksjon for en times inkubasjon ved romtemperatur. På slutten av blokkeringsinkubasjonen vasker du lysbildene tre ganger i frisk PBS i fem minutter per vask med gynge og returnerer lysbilder til kammeret.Deretter legger du til den primære antistoffcocktailen av interesse for hver seksjon for en overnattingsinkubasjon ved fire grader Celsius. Neste morgen vask prøvene med tre 15-minutters vasker i fersk PBS per vask og merk lysbildene med riktig sekundær antistoffløsning i en time beskyttet mot lys. På slutten av inkubasjonen vask prøvene med tre 15-minutters vasker på en rocker beskyttet mot lys, og merker kjernene i seksjonene med DAPI i syv minutter ved romtemperatur beskyttet mot lys etter siste vask.Etter tre fem minutters PBS vasker med gynge, tilsett 60 mikroliter monteringsmiddel egnet for immunofluorescence langs overflaten av ett dekkglass per prøve og trykk lett hver lysbildevevsseksjon side ned på et dekkglass, og ta vare på å unngå bobler. Legg deretter hvert lysbilde flatt i en mørk beholder for herding ved romtemperatur i minst 24 timer før bildebehandling. Under fettfjerningsprosessen er det viktig å ikke la binyrene tørke ut, da dehydrering kan skade vevsstrukturen.Etter en vellykket fjerning av det omkringliggende fettvevet, bør binyrene lett oppdages uten ekstra synlig fett. Immunstaining av binyreksjoner som demonstrert avslører kjernefysisk steroidogen faktor en farging av adrenocortiske celler, tyrosinhydroksylase farging av medullære celler, DAPI farging av kjernene av ikke-steroidogene celler i den ytre kapselen, og co-farging med adrenocortiske og medullære celler. Når du prøver denne prosedyren, er det viktig å huske at muse binyrene er små og at deres posisjoner er noe variabel gjør deres deteksjon vanskelig.Derfor er det avgjørende å ha et klart syn på området under disseksjonen. Disse prosedyrene er grunnleggende teknikker for studiet av binyrene in vivo. Etter disse kan ytterligere metoder for immunstaining utføres for å møte spesifikke vitenskapelige behov.Etter utviklingen banet immunstaining vei for forskere innen biomedisinsk vitenskap for å utforske in situ proteinuttrykk, et nyttig verktøy i mange disipliner og felt.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Immunology and Infection

Unit 1

The Endocrine System

SCIENTISTS IN ACTION

Isolation of Mouse Peritoneal Cavity Cells

The peritoneal cavity is a membrane-bound and fluid-filled abdominal cavity of mammals, which contains the liver, spleen, most of the gastro-intestinal ...

Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

Isolering av Mouse Lung dendrittiske celler

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the ...

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Hybridisering<em&gt; In situ</em&gt; Av spyttkjertler, eggstokker, og embryo av Vector Mygg

Mosquitoes are vectors for a diverse set of pathogens including arboviruses, protozoan parasites and nematodes.  Investigation of transcripts and gene ...

Intravital Imaging of the Mouse Popliteal Lymph Node

Intravital Imaging av Mouse popliteal lymfeknute

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign ...

Non-invasive Optical Imaging of the Lymphatic Vasculature of a Mouse

Ikke-invasiv optisk avbildning av Lymfatisk blodkar av en mus

The lymphatic  vascular system is an important component of the circulatory system that  maintains fluid homeostasis, provides immune surveillance, and ...

Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

Isolering av Lymfocytter fra Mouse kjønnsorgan Mucosa

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and ...

Time-lapse 3D Imaging of Phagocytosis by Mouse Macrophages

Tidsinnstilt 3D bildebehandling av fagocytose av musen makrofager

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of ...

Isolation and Quantitative Evaluation of Brush Cells from Mouse Tracheas

Isolasjon og kvantitativ evaluering av Brush celler fra mus Tracheas

Tracheal brush cells are cholinergic chemosensory epithelial cells poised to transmit signals from the airway lumen to the immune and nervous systems. ...

Isolation of Salivary Epithelial Cells from Human Salivary Glands for In Vitro Growth as Salispheres or Monolayers

Isolering av spytt epitelceller fra Human spyttkjertler for in vitro vekst som Salispheres eller Monolagere

The salivary glands are a site of significant interest for researchers interested in multiple aspects of human disease. One goal of researchers is to ...

Implantation and Monitoring by PET/CT of an Orthotopic Model of Human Pleural Mesothelioma in Athymic Mice

Implantation og overvåking av PET/CT av en Orthotopic modell av Human pleural mesothelioma i Athymic mus

Malignant pleural mesothelioma (MPM) is a rare and aggressive tumor arising in the mesothelium that covers the lungs, the heart, and the thoracic cavity. ...