Name: isolation, fixation, and immunofluorescence imaging of mouse adrenal glands
Uploaded: 2018-10-02T14:45:00
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Damos las gracias por sus sugerencias y asistencia técnica en el establecimiento de este protocolo Dr. Mohamad Zubair. Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Diabetes y digestivo y enfermedades del riñón, institutos nacionales de salud Research Grant 2R01-DK062027 (para G.D.H).

Todos los métodos fueron realizados según protocolos aprobados institucionalmente bajo el auspicio de la Comisión de la Universidad sobre el uso y cuidado de animales en la Universidad de Michigan.
1. preparación para la cirugía
<ol><li>El día antes de la cirugía, preparar 4% paraformaldehido (PFA) / fosfato tampón salino (PBS). En el caso de alícuotas congeladas, proceder a descongelar uno y almacenar a 4 ° C. Nota: 4% PFA no es estable por más de 48 h. PRECAUCIÓN: PFA es ...

<ol>
	<li>Brandtzaeg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+increasing+power+of+immunohistochemistry+and+immunocytochemistry.">The increasing power of immunohistochemistry and immunocytochemistry.</a> Journal of Immunological Methods. 216 (1-2), 49-67 (1998).</li><li>Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G., da Silva Pinhal, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+as+an+important+tool+in+biomarkers+detection+and+clinical+practice.">Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice.</a> Biomark Insights. 5, 9-20 (2010).</li><li>Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+signaling+and+steroidogenesis.">Hedgehog signaling and steroidogenesis.</a> Annual Review of Physiology. 77, 105-129 (2015).</li><li>Paul, A., Laufer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+biotin+as+a+marker+of+adrenocortical+cells+with+steroidogenic+potential.">Endogenous biotin as a marker of adrenocortical cells with steroidogenic potential.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 336 (1-2), 133-140 (2011).</li><li>Lowe, J., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Stevens &amp; Lowe's Human Histology, 4th Edition. , 263-285 (2015).</li><li>Nagatsu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+for+human+catecholamine-synthesizing+enzymes.">Genes for human catecholamine-synthesizing enzymes.</a> Neuroscience Research. 12 (2), 315-345 (1991).</li><li>Berthon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+effects+of+Armc5+haploinsufficiency+on+adrenocortical+function.">Age-dependent effects of Armc5 haploinsufficiency on adrenocortical function.</a> Human Molecular Geneticst. 26 (18), 3495-3507 (2017).</li><li>Brown, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+retrieval+methods+for+immunohistochemistry.">Antigen retrieval methods for immunohistochemistry.</a> Toxicologic Pathology. 26 (6), 830-831 (1998).</li><li>Billinton, N., Knight, A. 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Este protocolo describe un método para el aislamiento de las glándulas suprarrenales de ratón junto con la preparación y tinción de las glándulas suprarrenales seccionado ratón embebido en parafina.
Comparado con otros protocolos que hemos probado, este protocolo de la inmunofluorescencia ha sido conveniente para la mayoría de los anticuerpos utilizados en nuestro laboratorio. Sin embargo, en algunos casos puede requerir algunos ajustes para mejorar los resultados de la tinción. Una v...

Inmunohistoquímica es una técnica para la detección de componentes del tejido con el uso de anticuerpos contra moléculas celulares específicas y posteriores técnicas de tinción para detectar los anticuerpos conjugados1. Este procedimiento de inmunohistoquímica requiere fijación específica y procesamiento de los tejidos que están determinados a menudo empírico para el antígeno específico, tejidos y anticuerpos utilizados2. La fijación es crucial para preservar el estado "original" de los tejidos y manteniendo así intacta celular y estructuras subcelulares y patrones de expresión. Se necesitan adicionales de procesamiento y procedimientos de inclusión para preparar el tejido seccionado en rebanadas que se usan para estudios histológicos con inmunohistoquímica.
Inmunotinción puede realizarse con detección chromogenic o fluorescente. Detección cromógena requiere la utilización de una enzima para convertir un sustrato soluble en un producto coloreado insoluble. Mientras que esta enzima puede ser conjugada con el anticuerpo reconoce al antígeno (anticuerpo primario), más a menudo es conjugado con el anticuerpo que reconoce el anticuerpo primario (es decir, el anticuerpo secundario). Esta técnica es muy sensible; el producto coloreado que resultan de la reacción enzimática es Fotoestables y requiere sólo un microscopio de campo luminoso para la proyección de imagen. Sin embargo, immunostaining cromogénico puede no ser conveniente cuando se intenta visualizar dos proteínas que co localización, ya que la deposición de un solo color puede enmascarar la deposición de la otra. En el caso de coloración Co, inmunofluorescencia ha demostrado para ser más ventajosos. El advenimiento de la inmunofluorescencia se atribuye a Albert Coons y colegas, que desarrolló un sistema para identificar antígenos de tejidos con anticuerpos marcados con fluoresceína y visualizarlas en los tejidos seccionados bajo luz ultravioleta3. Detección de fluorescencia se basa en un anticuerpo conjugado con un fluoróforo que emite luz después de la excitación. Porque hay varios fluoróforos con emisiones en diferentes longitudes de onda (con poca o ninguna superposición), este método de detección es ideal para los estudios de múltiples proteínas.
La glándula suprarrenal es un órgano vinculado situado encima del riñón y caracterizado por dos componentes embriológicamente distintos rodeados por una cápsula mesenquimal. La corteza suprarrenal externa, derivada del mesodermo intermedio mesonephric, secretan hormonas esteroides mientras que la médula interna, derivada de la cresta neural, produce catecolaminas como adrenalina, noradrenalina y dopamina. La corteza suprarrenal se divide histológicamente y funcionalmente en tres zonas concéntricas, con cada zona secretoras de diferentes clases de hormonas esteroides: el exterior de la zona glomerular (zG) produce mineralocorticoides que regulan la homeostasis de electrolitos y volumen intravascular; la media de la zona fasciculada (zF), directamente debajo de la zG, segrega glucocorticoides que median la respuesta de estrés a través de la movilización de los almacenes de la energía para aumentar la glucosa en plasma; y la zona interna reticular (zR), que sintetiza precursores de esteroides (es decir, dehidroepiandrosterona (DHEAS))4.
Alguna variación en la zonación adrenocortical está presente entre las especies: por ejemplo, Mus musculus carece de la zR. La única zona X postnatal del M. musculus es un remanente de la corteza fetal caracterizado por pequeñas células pobres en lípidos con citoplasmas acidófilos5. La zona X desaparece en la pubertad en ratones machos y después del primer embarazo en ratones femeninos o degenera gradualmente en las hembras no crían6,7. Por otra parte, la tortuosidad y el espesor de los objetos expuestos de zG marcan variación entre las especies como la organización de las células madre y progenitoras periféricas en y adyacente a la zG. La rata, a diferencia de otros roedores, dispone de una zona indiferenciada visible (zU) entre la zG y zF que funciona como una zona de la célula de vástago o una zona de transitorios amplificando progenitores. El zU es único a las ratas o simplemente más prominente organizan grupo de células es desconocido8,9.
Las células de la corteza suprarrenal contienen gotitas de lípidos que almacenan los ésteres de colesterol que servir como el precursor de todas las hormonas esteroides10,11.  El término "steroidogenesis" define el proceso de producción de las hormonas esteroides de colesterol a través de una serie de reacciones enzimáticas que involucran la actividad del factor steroidogenic 1 (SF1), cuya expresión es un marcador de potencial steroidogenic. En la glándula suprarrenal, Sf1 expresión sólo está presente en las células de la corteza12. Un interesante estudio encuentra la expresión de la biotina endógena en las células adrenocorticales con potencial steroidogenic13. Mientras que esto puede ser la causa de una mayor experiencia en métodos de tinción basada en biotina/estreptavidina, debido a la detección de la biotina endógena por el anticuerpo conjugado con estreptavidina, esta característica podría emplearse también para distinguir el steroidogenic células de otras poblaciones dentro de la glándula suprarrenal, es decir, endoteliales, capsular y las células de la médula.
Inervado por neuronas simpáticas preganglionares, la médula suprarrenal se caracteriza por células basófilas con un citoplasma granular que contiene epinefrina y norepinefrina. Las células de la médula se denominan "cromafines" debido al alto contenido de catecolaminas que forma un pigmento marrón después de oxidación14. Tirosina hidroxilasa (TH) es la enzima que cataliza el paso tarifa-limitador en la síntesis de catecolaminas y en la glándula suprarrenal, se expresa solamente en la médula15.
Aquí presentamos un protocolo para el aislamiento de las glándulas suprarrenales de ratón, su proceso de inclusión en parafina de seccionamiento y un método para realizar la inmunofluorescencia que manchaba en suprarrenales secciones con el fin de identificar los tipos celulares que constituyen el corteza suprarrenal y la médula. Este protocolo es un estándar en nuestro laboratorio para la inmunotinción con anticuerpos múltiples rutinariamente utilizados en nuestra investigación.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:657px;" width="658">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">24-well cell culture plate</td>
			<td style="width:156px;">Nest Biotechnology Co.</td>
			<td style="width:119px;">0412B</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Disposable needles 25Gx5/8&#34;</td>
			<td style="width:156px;">Exel International</td>
			<td style="width:119px;">26403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Paraplast plus&#160;</td>
			<td style="width:156px;">McCormik scientific</td>
			<td style="width:119px;">39502004</td>
			<td>Paraffin for tissue embedding</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Shandon biopsy cassettes II with attached lid</td>
			<td style="width:156px;">Thermo scientific</td>
			<td style="width:119px;">1001097</td>
			<td>Cassettes for tissue processing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">High Profile Microtome Blades</td>
			<td style="width:156px;">Accu-Edge</td>
			<td style="width:119px;">4685</td>
			<td>Disposable stainless steel blades</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Peel-a-way disposable plastic tissue embedding molds</td>
			<td style="width:156px;">Polysciences Inc.</td>
			<td style="width:119px;">18986</td>
			<td>Truncated,22mm square top tapered to 12mm bottom</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td style="width:156px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">12-550-15</td>
			<td>75x25x1 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Xylene</td>
			<td style="width:156px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:119px;">X5P1GAL&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">200 Proof Ethanol</td>
			<td style="width:156px;">Decon Labs, Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Certi-Pad Gauze pads&#160;</td>
			<td style="width:156px;">Certified Safety Mfg, Inc</td>
			<td style="width:119px;">231-210</td>
			<td>3&#34;x3. Sterile latex free gauze pads</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">M.O.M kit&#160;</td>
			<td style="width:156px;">Vector laboratories</td>
			<td style="width:119px;">BMK-2202</td>
			<td>For detecting mouse primary antibodies on mouse tissue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KimWipes</td>
			<td style="width:156px;">Kimtech</td>
			<td style="width:119px;">34155</td>
			<td>Wipes 4.4x8.4 inch</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Super PAP PEN</td>
			<td style="width:156px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:119px;">00-8899</td>
			<td>Pen to draw on slides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microscope cover glass&#160;</td>
			<td style="width:156px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">12-544-D</td>
			<td>Size: 22x50x1.5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DAPI</td>
			<td style="width:156px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D9542&#160;</td>
			<td>(Prepared in 20mg/mL stock)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ProLong Gold antifade reagent</td>
			<td style="width:156px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">P36930</td>
			<td>Mounting agent for immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">X-cite series 120Q</td>
			<td style="width:156px;">Lumen Dynamics</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Light source</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Coolsnap Myo</td>
			<td style="width:156px;">Photometrics</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Camera</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Optiphot-2&#160;</td>
			<td style="width:156px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">microtome</td>
			<td style="width:156px;">Americal Optical</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tissue embedder</td>
			<td style="width:156px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">EG1150 H&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tissue processor&#160;</td>
			<td style="width:156px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">ASP300S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Normal goat serum</td>
			<td style="width:156px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Mouse anti-TH</td>
			<td style="width:156px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">MAB318</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rabbit anti-SF1</td>
			<td>Ab proteintech group (PTGlabs)</td>
			<td style="width:119px;">&#160;custom made</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Alexa-488 Mouse IgG&#160; raised goat</td>
			<td style="width:156px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-545-003&#160;</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dylight-549 Rabbit IgG raised goat</td>
			<td style="width:156px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>111-505-003</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Citrate acid anhydrous</td>
			<td style="width:156px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:119px;">A940-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NIS-Elements Basic Research&#160;</td>
			<td style="width:156px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Software for imaging</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, fixation, and immunofluorescence imaging of mouse adrenal glands

La inmunofluorescencia es una técnica bien establecida para la detección de antígenos en los tejidos con el empleo de anticuerpos conjugados con fluorocromo y tiene un amplio espectro de aplicaciones. Detección de antígenos permite la caracterización y la identificación de múltiples tipos de células. Situado por encima de los riñones y encapsulado por una capa de células mesenquimales, la glándula suprarrenal es un órgano endocrino, compuesto por dos tejidos diferentes con diferente origen embriológico, la corteza externa de derivados del mesodermo intermediaria mesonephric y los nervios médula interna derivados de la cresta. La corteza suprarrenal segrega esteroides (es decir, mineralocorticoides, glucocorticoides, hormonas sexuales), mientras que la médula suprarrenal produce las catecolaminas (es decir, adrenalina, noradrenalina). Mientras realiza la investigación suprarrenal, es importante poder distinguir células únicas con diferentes funciones. Aquí proporcionamos un protocolo desarrollado en nuestro laboratorio que describe una serie de pasos secuenciales necesarios para obtención de tinción de inmunofluorescencia para caracterizar los tipos celulares de la glándula suprarrenal. Nos centramos primero en la disección de las glándulas suprarrenales de ratón, la eliminación microscópica del periadrenal grasa seguida de la fijación, la transformación y la inclusión en parafina de los tejidos. A continuación describimos de seccionamiento de los bloques de tejido con un micrótomo rotatorio. Por último, detallamos un protocolo para la tinción inmunofluorescente de las glándulas suprarrenales que hemos desarrollado para minimizar la Unión inespecífica del anticuerpo y autofluorescencia para obtener una señal óptima.

La figura 1 representa un esquema del protocolo completo descrito anteriormente. Las glándulas suprarrenales son extraídas de ratones, tejido adiposo adyacente se quita con un microscopio de disección y el suprarrenal entonces se fijan en el 4% PFA. Después de este paso, las glándulas suprarrenales son procesadas embebidas en parafina y seccionadas con un micrótomo para cortar el órgano en rodajas finas que se depositan sobre los portaobjetos de micros...

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Isolation, Fixation, and Immunofluorescence Imaging of Mouse Adrenal Glands

Aquí presentamos un método para aislar las glándulas suprarrenales de los ratones, reparar los tejidos, les sección y realizar tinción de inmunofluorescencia.

Aislamiento, fijación y proyección de imagen de inmunofluorescencia de las glándulas suprarrenales de ratón

Immunofluorescence is a well-established technique for detection of antigens in tissues with the employment of fluorochrome-conjugated antibodies and has ...

La inmunofluorescencia es un método básico que puede ayudar a responder preguntas clave en el campo suprarrenal sobre la zonación suprarrenal, la identidad celular y la función. La principal ventaja de esta técnica es que permite el estudio de múltiples proteínas preservando la morfología del tejido suprarrenal. Para extraer la glándula suprarrenal murina, corte alrededor del tejido adiposo circundante y coloque la glándula en un pozo de una placa de 24 múltiples metros que contenga PBS fresco en hielo.Transfiera la glándula a una placa de Petri o soporte de vidrio bajo un microscopio de disección y use dos agujas de calibre 25 para eliminar el tejido graso adyacente. Cuando se haya eliminado toda la grasa, fije el tejido en 4%paraformaldehído a cuatro grados Celsius con balanceo durante dos horas. Al final de la incubación, enjuague la glándula con tres lavados de 15 minutos a cuatro grados centígrados en uno a dos mililitros de PBS fresco por lavado.Después del último lavado, deshidratar la glándula en dos inmersiones secuenciales de etanol a cuatro grados Celsius con balanceo durante dos horas por incubación. Para preparar el tejido suprarrenal para su procesamiento, envuelva la glándula en la gasa y encierre la glándula suprarrenal en un casete que incrusta tejido. A continuación, coloque el cassette en un frasco lleno de 70% de etanol para un almacenamiento de cuatro grados Centígrados hasta su procesamiento.Para procesar el tejido, inserte el cassette en el procesador de tejidos para su procesamiento como se indica en la tabla. Al final del programa, transfiera el cassette a una estación de incrustación llena de parafina derretida de 65 grados y utilice un par de fórceps para desenvolver la gasa. Transfiera suavemente la suprarrenal en la posición adecuada en el centro de la base del molde de incrustación y vierta la parafina derretida sobre la glándula.A continuación, mueva cuidadosamente el molde de incrustación a una bandeja de refrigeración para facilitar el endurecimiento de la parafina. Antes de secisar por microtoma rotativo, etiquete una serie de diapositivas de microscopio y colocar las diapositivas en un calentador de diapositivas Celsius de 37 grados. Dispensar alrededor de 450 microlitros de agua ultra pura autoclaves tipo uno en cada diapositiva y ajustar el espesor de corte de sección del microtomo a cinco micrómetros.Cargue el tejido incrustado en el bloque de corte y baje el bloque de parafina hasta que la muestra esté a la altura de la cara con el borde de la hoja del microtomo. Girando la rueda de mano con un ritmo constante, realizar un recorte inicial para eliminar la parafina y exponer el tejido suprarrenal. A continuación, adquiera cinco secciones de micrómetros hasta el final de la glándula suprarrenal utilizando fórceps para transferir cada sección a la gota de agua en uno de los portaobjetos preetiquetados a medida que se recoge.Después de confirmar la presencia de tejido en las secciones por microscopía, seque los portaobjetos en la placa caliente durante unas dos horas y hornéelos al menos durante la noche en una bandeja deslizante a 37 grados centígrados hasta que no haya más agua visible. Una vez secos, guarde los portaobjetos en una caja deslizante a temperatura ambiente. Para la recuperación de antígenos de inmunofluorescencia, desparafinar los portaobjetos con dos inmersiones de cinco minutos 100% de xileno, seguidas de rehidratación en una serie descendente de inmersión en etanol y agua.Después de la inmersión en agua, transfiera los portaobjetos a un portaobjetos metálicos y coloque el soporte en un vaso de precipitado de citrato molar 0,01 en una placa caliente durante 10 minutos. Al final de la incubación, retire el vaso de precipitados de la placa caliente y déjelo enfriar durante 20 minutos, teniendo cuidado de que todas las secciones suprarrenales todavía estén cubiertas con tampón. Cuando el vaso de precipitados se enfríe, transfiera los portaobjetos a un frasco de Coplin para tres lavados de 10 minutos en PBS fresco con un suave balanceo.Después del último lavado, limpie cuidadosamente la superficie de cada diapositiva sin dañar las secciones de tejido y utilice un marcador hidrófobo para hacer un círculo alrededor de cada sección. Coloque los portaobjetos en una cámara humidificada y agregue rápidamente al menos 50 microlitros de solución de bloqueo a cada sección para una incubación de una hora a temperatura ambiente. Al final de la incubación de bloqueo, lave los portaobjetos tres veces en PBS fresco durante cinco minutos por lavado con mecedores y de vuelta a los portaobjetos a la cámara.A continuación, agregue el cóctel de anticuerpos primario de interés a cada sección para una incubación durante la noche a cuatro grados centígrados. A la mañana siguiente, lave las muestras con tres lavados de 15 minutos en PBS fresco por lavado y etiquete los portaobjetos con la solución de anticuerpos secundaria adecuada durante una hora protegida de la luz. Al final de la incubación, lavar las muestras con tres lavados de 15 minutos en una balancín protegido de la luz, etiquetando los núcleos de las secciones con DAPI durante siete minutos a temperatura ambiente protegida de la luz después del último lavado.Después de tres lavados PBS de cinco minutos con balanceo, agregue 60 microlitros de agente de montaje adecuados para la inmunofluorescencia a lo largo de la superficie de un vidrio de cubierta por muestra y presione ligeramente cada sección de tejido deslizante hacia abajo sobre un vidrio de cubierta, teniendo cuidado de evitar burbujas. A continuación, colocar cada diapositiva plana en un recipiente oscuro para el curado a temperatura ambiente durante al menos 24 horas antes de la toma de imágenes. Durante el proceso de eliminación de grasa, es fundamental no dejar que la glándula suprarrenal se seque ya que la deshidratación puede dañar la estructura del tejido.Después de una extirpación exitosa del tejido adiposo circundante, la glándula suprarrenal debe ser fácilmente detectable sin grasa visible adicional. La inmunostaining de las secciones de la glándula suprarrenal como se ha demostrado revela la tinción del factor esteroideogénico nuclear una tinción de las células adrenocorticales, tinción de tirosina hidroxilasa de las células medulares, tinción DAPI de los núcleos de las células no esteroideogénicas de la cápsula externa, y co-tinción con células adrenocorticales y medulares. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que las suprarrenales del ratón son pequeñas y que sus posiciones son algo variables, lo que dificulta su detección.Por lo tanto, es crucial tener una visión clara de la zona durante la disección. Estos procedimientos son técnicas básicas para el estudio de la glándula suprarrenal in vivo. Después de esto, se pueden realizar métodos adicionales de inmunosuchado para satisfacer necesidades científicas específicas.Después de su desarrollo, la inmunosuferidad allanó el camino para que los investigadores en los campos de la ciencia biomédica exploraran la expresión de proteínas in situ, una herramienta útil en muchas disciplinas y campos.

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