Name: isolation, fixation, and immunofluorescence imaging of mouse adrenal glands
Uploaded: 2018-10-02T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Fixation, and Immunofluorescence Imaging of Mouse Adrenal Glands at JoVE.com

Vi tackar Dr. Mohamad Zubair för hans användbara förslag och tekniskt bistånd för inrättandet av detta protokoll. Detta arbete stöds av nationella institutet för Diabetes- och mag- och njursjukdomar, nationella institut för hälsa forskningsbidrag 2R01-DK062027 (till G.D.H).

Alla metoder har utförts i enlighet med institutionellt godkända protokoll under auspicen av universitet utskottet för användning och skötsel av djur vid University of Michigan.
1. förberedelser inför kirurgi
<ol><li>Dagen före operationen, förbereda 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) / fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Händelse av frysta portioner, Fortsätt att Tina en och förvaras vid 4 ° C. Obs: 4% PFA är inte stabila i mer än 48 h. FÖRSIKTIGHET: PFA är giftiga, Undvik kontak...

<ol>
	<li>Brandtzaeg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+increasing+power+of+immunohistochemistry+and+immunocytochemistry.">The increasing power of immunohistochemistry and immunocytochemistry.</a> Journal of Immunological Methods. 216 (1-2), 49-67 (1998).</li><li>Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G., da Silva Pinhal, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+as+an+important+tool+in+biomarkers+detection+and+clinical+practice.">Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice.</a> Biomark Insights. 5, 9-20 (2010).</li><li>Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+properties+of+an+antibody+containing+a+fluorescent+group.">Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).</li><li>Lerario, A. M., Finco, I., LaPensee, C., Hammer, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Mechanisms+of+Stem/+Progenitor+Cell+Maintenance+in+the+Adrenal+Cortex.">Molecular Mechanisms of Stem/ Progenitor Cell Maintenance in the Adrenal Cortex.</a> Frontiers in Endocrinology. 8, (2017).</li><li>Yates, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adrenocortical+Development,+Maintenance,+and+Disease.">Adrenocortical Development, Maintenance, and Disease.</a> Endocrine Gland Development and Disease. 106, 239-312 (2013).</li><li>Jones, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+the+Mouse+Adrenal+Cortex+with+Special+Reference+to+the+Zona+Reticularis+and+to+Brown+Degeneration,+Together+with+a+Discussion+of+the+Cell+Migration+Theory.">Variation in the Mouse Adrenal Cortex with Special Reference to the Zona Reticularis and to Brown Degeneration, Together with a Discussion of the Cell Migration Theory.</a> Quarterly Journal of Microscopical Science. 89 (1), 53 (1948).</li><li>Sucheston, M. E. C., Samuel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Transient-Zone+in+the+Human+and+Mouse+Adrenal+Gland.">The Transient-Zone in the Human and Mouse Adrenal Gland.</a> The Ohio Journal of Science. 72, 120-126 (1972).</li><li>Guasti, L., Paul, A., Laufer, E., King, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+Sonic+hedgehog+secreting+and+receiving+cells+in+the+developing+and+adult+rat+adrenal+cortex.">Localization of Sonic hedgehog secreting and receiving cells in the developing and adult rat adrenal cortex.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 336 (1-2), 117-122 (2011).</li><li>Pihlajoki, M., Dorner, J., Cochran, R. S., Heikinheimo, M., Wilson, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adrenocortical+zonation,+renewal,+and+remodeling.">Adrenocortical zonation, renewal, and remodeling.</a> Frontiers in Endocrinology. 6, 27 (2015).</li><li>Farese, R. V., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+Droplets+Finally+Get+a+Little+R-E-S-P-E-C-T.">Lipid Droplets Finally Get a Little R-E-S-P-E-C-T.</a> Cell. 139 (5), 855-860 (2009).</li><li>Shen, W. J., Azhar, S., Kraemer, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplets+and+steroidogenic+cells.">Lipid droplets and steroidogenic cells.</a> Experimental Cell Research. 340 (2), 209-214 (2016).</li><li>Finco, I., LaPensee, C. R., Krill, K. T., Hammer, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+signaling+and+steroidogenesis.">Hedgehog signaling and steroidogenesis.</a> Annual Review of Physiology. 77, 105-129 (2015).</li><li>Paul, A., Laufer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+biotin+as+a+marker+of+adrenocortical+cells+with+steroidogenic+potential.">Endogenous biotin as a marker of adrenocortical cells with steroidogenic potential.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 336 (1-2), 133-140 (2011).</li><li>Lowe, J., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Stevens &amp; Lowe's Human Histology, 4th Edition. , 263-285 (2015).</li><li>Nagatsu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+for+human+catecholamine-synthesizing+enzymes.">Genes for human catecholamine-synthesizing enzymes.</a> Neuroscience Research. 12 (2), 315-345 (1991).</li><li>Berthon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+effects+of+Armc5+haploinsufficiency+on+adrenocortical+function.">Age-dependent effects of Armc5 haploinsufficiency on adrenocortical function.</a> Human Molecular Geneticst. 26 (18), 3495-3507 (2017).</li><li>Brown, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+retrieval+methods+for+immunohistochemistry.">Antigen retrieval methods for immunohistochemistry.</a> Toxicologic Pathology. 26 (6), 830-831 (1998).</li><li>Billinton, N., Knight, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+the+wood+through+the+trees:+a+review+of+techniques+for+distinguishing+green+fluorescent+protein+from+endogenous+autofluorescence.">Seeing the wood through the trees: a review of techniques for distinguishing green fluorescent protein from endogenous autofluorescence.</a> Analytical Biochemistry. 291 (2), 175-197 (2001).</li><li>Hirsch, R. E., San George, R. C., Nagel, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+fluorometric+determination+of+the+stable+state+of+aggregation+in+hemoglobins.">Intrinsic fluorometric determination of the stable state of aggregation in hemoglobins.</a> Analytical Biochemistry. 149 (2), 415-420 (1985).</li><li>Whittington, N. C., Wray, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+Red+Blood+Cell+Autofluorescence+for+Immunocytochemistry+on+Fixed+Embryonic+Mouse+Tissue.">Suppression of Red Blood Cell Autofluorescence for Immunocytochemistry on Fixed Embryonic Mouse Tissue.</a> Current Protocols in Neuroscience. 81, 28 (2017).</li><li>Watson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppressing+autofluorescence+of+erythrocytes.">Suppressing autofluorescence of erythrocytes.</a> Biotechnic &amp; Histochemistry. 86 (3), 207 (2011).</li><li>Epp, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+CLARITY+for+Clearing+Whole-Brain+and+Other+Intact+Organs.">Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs.</a> eNeuro. 2 (3), (2015).</li><li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO.">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).</li></ol>

Det här protokollet beskriver en metod för isolering av mus binjurarna tillsammans med beredning och färgning av sektionerad paraffin-inbäddat mus binjurar.
Jämfört med andra protokoll som vi testade, immunofluorescens protokollet har visat sig lämplig för majoriteten av antikroppar används i vårt laboratorium. I vissa fall kan det dock kräva vissa justeringar förbättra färgning resultaten. En variabel som kan enkelt ändras och testade är längden av fixering. I vårt laborator...

Immunhistokemi är en teknik för att upptäcka vävnad komponenter med hjälp av antikroppar mot specifika cellulära molekyler och efterföljande färgning tekniker för att upptäcka den konjugera antikroppar1. Proceduren immunhistokemisk kräver specifika fixering och bearbetning av vävnader som bestäms ofta empiriskt för specifika antigenet, vävnad och antikropp används2. Fixering är avgörande för att bevara det ”ursprungliga” tillståndet för vävnaden och därigenom bibehålla intakt cellulär och subcellulär strukturer och uttrycksmönster. Ytterligare krävs bearbetning och inbäddning förfaranden för att förbereda vävnaden för snittning i tunna skivor som används för histologiska studier med immunhistokemi.
Immunfärgning kan utföras med antingen kromogen eller fluorescerande upptäckt. Kromogen upptäckt kräver utnyttjandet av ett enzym att konvertera ett lösligt substrat i en olöslig färgade produkt. Medan detta enzym kan vara konjugerat med den antikropp som känner igen antigenet (primär antikropp), är det mer ofta konjugerat till antikroppen erkänner den primär antikroppen (dvs, den sekundära antikroppen). Denna teknik är mycket känsliga; färgade orsakats av den enzymatiska reaktionen är fotostabil och kräver endast ett brightfield Mikroskop för avbildning. Kromogen immunfärgning kan dock inte lämplig när man försöker visualisera två proteiner som tillsammans lokaliserar, eftersom nedfall av en färg kan maskera nedfall av annan. När det gäller samtidig färgning, har immunofluorescens visat sig vara mer fördelaktiga. Tillkomsten av immunofluorescens tillskrivs Albert Coons och kollegor, som utvecklat ett system för att identifiera vävnad antigener med antikroppar märkta med fluorescein och visualisera dem i sektionerad vävnader under ultraviolett ljus3. Fluorescens upptäckt är baserad på en antikropp konjugerat med en fluorophore som avger ljus efter magnetisering. Eftersom det finns flera fluorophores med utsläpp vid olika våglängder (med ingen eller liten överlappning), är denna detektionsmetod idealisk för studier av flera proteiner.
Binjuren är en Parade organ sitter ovanför njurarna och kännetecknas av två embryologically distinkta komponenter omgiven av en mesenkymala kapsel. Yttre binjurebarken, härrör från mesonephric intermediate mesoderm, utsöndrar steroidhormoner medan inre medulla, härrör från neural crest, producerar katekolaminer inklusive adrenalin, noradrenalin och dopamin. Binjurebarken är histologiskt och funktionellt uppdelad i tre koncentriska zoner, med varje zon som utsöndrar olika klasser av steroidhormoner: den yttre zona glomerulosa (zG) tillverkar mineralkortikoider som reglerar elektrolyter homeostas och intravaskulär volym; den mellersta zona fasciculata, zF, utsöndrar direkt under zG, glukokortikoider som medlar stress svar genom mobilisering av energidiversehandel att öka plasmaglukos; och de inre zona reticularis (zR), som syntetiserar kön steroid prekursorer (dvs dehydroepiandrosteron (DHEAS))4.
Viss variation i adrenokortikal Colouir finns mellan arter: exempelvis Mus musculus saknar zR. Unik födsel X-zonen av M. musculus är en kvarleva av fostrets cortex kännetecknas av små lipid-fattiga celler med acidofiler cytoplasms5. X-zonen försvinner vid puberteten hos hanmöss och efter den första graviditeten hos honmöss, eller urartar gradvis i inte-uppfödda honor6,7. Dessutom märkt den tortuosity och tjocklek av zG utställningsföremålen variation mellan arter som gör organisationen av perifera stamceller och stamceller celler i och intill zG. Råtta, till skillnad från andra gnagare, har en synlig odifferentierade zon (zU) mellan zG och zF som fungerar som en stamcell zon eller en zon av övergående förstärkande stamfäder. Huruvida zU är unik för råttor eller helt enkelt en mer tydligt organiserade kluster av celler är okänd8,9.
Celler i binjurebarken innehåller lipid droppar som lagra kolesterol estrar som fungerar som föregångare till alla steroidhormoner10,11.  Termen ”Steroidsyntes” definierar processen för produktion av steroidhormoner från kolesterol via en serie enzymatiska reaktioner som involverar aktiviteten av steroidogena faktor 1 (SF1), vars uttryck är en markör för steroidogena potential. I binjuren förekommer Sf1 uttryck endast i celler i cortex12. En intressant studie hittade uttrycket av endogena biotin i adrenokortikal celler med steroidogena potentiella13. Medan detta kan vara orsaken till en högre bakgrund i biotin/streptividin-baserade färgning metoder, på grund av upptäckten av endogena biotin av antikropp konjugerat med streptividin, kunde detta kännetecken också användas för att skilja de steroidogena celler från andra populationer inom binjuren, dvs endothelial, kapsulära och märgen celler.
Binjuremärgen är innerveras av sympatiska preganglionära nervceller, och kännetecknas av basofila celler med ett granulat cytoplasman innehåller adrenalin och noradrenalin. Märgen celler namnges ”chromaffin” på grund av det höga innehållet av katekolaminer som bildar ett brunt pigment efter oxidation14. Tyrosin hydroxylas (TH) är det enzym som katalyserar det hastighetsbegränsande steget i syntesen av katekolaminer och i binjuren, uttrycks endast i medulla15.
Här presenterar vi ett protokoll för isolering av mus binjurarna, deras bearbetning för ingjutning i paraffin och snittning, och en metod att utföra immunofluorescens färgning på adrenal sektioner för att identifiera cellulära typer som utgör den adrenal cortex och medulla. Detta protokoll är en standard i vårt laboratorium för immunfärgning med flera antikroppar som rutinmässigt används i vår forskning.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:657px;" width="658">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">24-well cell culture plate</td>
			<td style="width:156px;">Nest Biotechnology Co.</td>
			<td style="width:119px;">0412B</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Disposable needles 25Gx5/8&#34;</td>
			<td style="width:156px;">Exel International</td>
			<td style="width:119px;">26403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Paraplast plus&#160;</td>
			<td style="width:156px;">McCormik scientific</td>
			<td style="width:119px;">39502004</td>
			<td>Paraffin for tissue embedding</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Shandon biopsy cassettes II with attached lid</td>
			<td style="width:156px;">Thermo scientific</td>
			<td style="width:119px;">1001097</td>
			<td>Cassettes for tissue processing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">High Profile Microtome Blades</td>
			<td style="width:156px;">Accu-Edge</td>
			<td style="width:119px;">4685</td>
			<td>Disposable stainless steel blades</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Peel-a-way disposable plastic tissue embedding molds</td>
			<td style="width:156px;">Polysciences Inc.</td>
			<td style="width:119px;">18986</td>
			<td>Truncated,22mm square top tapered to 12mm bottom</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td style="width:156px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">12-550-15</td>
			<td>75x25x1 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Xylene</td>
			<td style="width:156px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:119px;">X5P1GAL&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">200 Proof Ethanol</td>
			<td style="width:156px;">Decon Labs, Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Certi-Pad Gauze pads&#160;</td>
			<td style="width:156px;">Certified Safety Mfg, Inc</td>
			<td style="width:119px;">231-210</td>
			<td>3&#34;x3. Sterile latex free gauze pads</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">M.O.M kit&#160;</td>
			<td style="width:156px;">Vector laboratories</td>
			<td style="width:119px;">BMK-2202</td>
			<td>For detecting mouse primary antibodies on mouse tissue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KimWipes</td>
			<td style="width:156px;">Kimtech</td>
			<td style="width:119px;">34155</td>
			<td>Wipes 4.4x8.4 inch</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Super PAP PEN</td>
			<td style="width:156px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:119px;">00-8899</td>
			<td>Pen to draw on slides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microscope cover glass&#160;</td>
			<td style="width:156px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">12-544-D</td>
			<td>Size: 22x50x1.5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DAPI</td>
			<td style="width:156px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D9542&#160;</td>
			<td>(Prepared in 20mg/mL stock)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ProLong Gold antifade reagent</td>
			<td style="width:156px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">P36930</td>
			<td>Mounting agent for immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">X-cite series 120Q</td>
			<td style="width:156px;">Lumen Dynamics</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Light source</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Coolsnap Myo</td>
			<td style="width:156px;">Photometrics</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Camera</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Optiphot-2&#160;</td>
			<td style="width:156px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">microtome</td>
			<td style="width:156px;">Americal Optical</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tissue embedder</td>
			<td style="width:156px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">EG1150 H&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tissue processor&#160;</td>
			<td style="width:156px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">ASP300S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Normal goat serum</td>
			<td style="width:156px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Mouse anti-TH</td>
			<td style="width:156px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">MAB318</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rabbit anti-SF1</td>
			<td>Ab proteintech group (PTGlabs)</td>
			<td style="width:119px;">&#160;custom made</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Alexa-488 Mouse IgG&#160; raised goat</td>
			<td style="width:156px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-545-003&#160;</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dylight-549 Rabbit IgG raised goat</td>
			<td style="width:156px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>111-505-003</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Citrate acid anhydrous</td>
			<td style="width:156px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:119px;">A940-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NIS-Elements Basic Research&#160;</td>
			<td style="width:156px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Software for imaging</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, fixation, and immunofluorescence imaging of mouse adrenal glands

Immunofluorescens är en väl etablerad teknik för detektion av antigen i vävnader med anställning av fluorokrom-konjugerade antikroppar och har ett brett spektrum av applikationer. Påvisande av antigen tillåter för karakterisering och identifiering av flera celltyper. Ovanför njurarna och inkapslade av ett lager av mesenkymala celler, är binjuren ett endokrina organ som består av två olika vävnader med olika embryologiska ursprung, mesonephric intermediate mesoderm-derived yttre cortex och den neurala Crest-derived inre medulla. Binjurebarken utsöndrar steroider (dvs mineralkortikoider, glukokortikoider, könshormoner), medan binjuremärgen producerar katekolaminer (dvs, adrenalin, noradrenalin). Samtidigt bedriva adrenal forskning, är det viktigt att kunna skilja mellan unika celler med olika funktioner. Här tillhandahåller vi ett protokoll som utvecklats i vårt laboratorium som beskriver en serie sekventiella steg krävs för att få immunofluorescens färgning att karakterisera celltyper i binjuren. Vi fokuserar först på dissektion av mus binjurarna, mikroskopiska borttagande av periadrenal fett följt av fixering, bearbetning och paraffin inbäddning av vävnad. Sedan beskriver vi snittning av vävnad blocken med en roterande mikrotom. Slutligen, detalj vi ett protokoll för Immunofluorescerande färgning av binjurarna som vi har utvecklat för att minimera både icke-specifik antikropp bindande och autofluorescens för att uppnå en optimal signal.

Figur 1 representerar en schematisk av hela protokollet beskrivs ovan. Binjurarna skördas från möss, intilliggande fettvävnad tas bort under en dissekera Mikroskop och adrenal korrigeras sedan i 4% PFA. Efter detta steg, binjurar bearbetas och inbäddade i paraffin, och sektioneras med en mikrotom skär orgeln i tunna skivor som deponeras på objektglas. Efter torkning av avsnitten, immunofluorescens utförs och avsnitten är avbildade på mikroskopet.</p...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Fixation, and Immunofluorescence Imaging of Mouse Adrenal Glands at JoVE.com

Isolation, Fixation, and Immunofluorescence Imaging of Mouse Adrenal Glands

Här presenterar vi en metod för att isolera binjurarna från möss, fixa vävnader, avsnitt dem och utföra immunofluorescens färgning.

Isolering, fixering och immunofluorescens avbildning av mus binjurarna

Immunofluorescence is a well-established technique for detection of antigens in tissues with the employment of fluorochrome-conjugated antibodies and has ...

Immunofluorescens är en grundläggande metod som kan hjälpa till att besvara nyckelfrågor i adrenalfältet om adrenal zonation, cellidentitet och funktion. Den största fördelen med denna teknik är att det tillåter studier av flera proteiner samtidigt bevara morfologi av binjurevävnaden. För att ta bort murin binjuren, skär runt den omgivande fettvävnaden och placera körteln i en brunn av en 24-multiwell platta som innehåller färska PBS på is.Överför körteln på en petriskål eller glasstöd under ett dissekerande mikroskop och använd två 25 gauge nålar för att ta bort den intilliggande fettvävnaden. När allt fett har tagits bort, fixa vävnaden i 4%paraformaldehyd vid fyra grader Celsius med gunga i två timmar. Vid slutet av inkubationen sköljer du körteln med tre 15-minuterstvättar i fyra grader Celsius i en till två milliliter färsk PBS per tvätt.Efter den sista tvätten, torka av körteln i två sekventiella etanol nedsänkningar vid fyra grader Celsius med gunga i två timmar per inkubation. För att förbereda binjurevävnaden för bearbetning, linda körtel i gasbindning och innesluta binjuren i en vävnadsinbäddningskassett. Sedan, placera kassetten i en burk fylld med 70%etanol för fyra grader Celsius lagring tills bearbetning.För att bearbeta vävnaden, sätt in kassetten i vävnadsbehandlaren för bearbetning som anges i tabellen. I slutet av programmet, överför kassetten till en inbäddningsstation fylld med smält 65 graders paraffin och använd ett par tyve för att packa upp gasbindningen. För försiktigt över binjuren i lämplig position i mitten av inbäddningsformens bas och häll den smälta paraffinen på körteln.Flytta sedan försiktigt inbäddningsformen till ett kylbricka för att underlätta härdning av paraffin. Före snittning efter roterande mikrotom, märka en serie mikroskop diabilder och lägg bilderna på en 37 grader Celsius diabild varmare. Dispensera ca 450 mikroliter av autoklaverad typ ett ultra rent vatten på varje bild och ställ in sektionen skärtjocklek av mikrotomen till fem mikrometer.Ladda den inbäddade vävnaden på skärblocket och sänk paraffinblocket tills provet är i ansiktets nivå med kanten på mikrotombladet. Roterande handhjulet med en stadig rytm, utföra en inledande trimning för att ta bort paraffinen och exponera binjurevävnaden. Sedan, förvärva fem mikrometer sektioner genom slutet av binjuren med hjälp av tövövär för att överföra varje avsnitt i vattendroppe på en av de förmärkta diabilder som det samlas in.Efter att ha bekräftat närvaron av vävnad i sektionerna genom mikroskopi, torka bilderna på värmeplattan i ca två timmar och baka dem åtminstone över natten på en ruta i 37 grader Celsius tills inget mer vatten är synligt. När du är torr förvarar du rutorna i en ruta i rumstemperatur. För immunofluorescens antigen hämtning, de-paraffinize bilderna med två fem-minuters 100%xylen nedsänkning, följt av rehydrering i en fallande etanol och vatten nedsänkning serien.Efter vattensänkningen överför du rutschkanorna till en glidhållare av metall och placerar hållaren i en bägare med kokande 0,01 molarcitrat på en värmeplatta i 10 minuter. I slutet av inkubationen, ta bort bägaren från värmeplattan och låt den svalna i 20 minuter, var noga med att alla binjuresektioner fortfarande är täckta med buffert. När bägaren är avkyld, överför du rutschkanorna till en Coplin-burk i tre 10-minuterstvättar i färsk PBS med varsam gungning.Efter den sista tvätten, torka noggrant ytan av varje objektglas utan att skada vävnadssektionerna och använd en hydrofoba markör för att göra en cirkel runt varje sektion. Placera objektglasen i en befuktad kammare och tillsätt snabbt minst 50 mikroliter av blockerande lösning till varje sektion för en timmes inkubation i rumstemperatur. I slutet av blockeringsinkubationen tvättar du objektglasen tre gånger i färsk PBS i fem minuter per tvätt med gungning och returglas till kammaren.Därefter lägger du till den primära antikroppscocktailen av intresse för varje sektion för en övernattningsinkubation vid fyra grader Celsius. Nästa morgon, tvätta proverna med tre 15-minuters tvättar i färska PBS per tvätt och märka diabilderna med lämplig sekundär antikroppslösning för en timme skyddad från ljus. Vid slutet av inkubationen, tvätta proverna med tre 15-minuters tvättar på en vippa skyddad från ljus, märkning kärnorna i sektionerna med DAPI i sju minuter vid rumstemperatur skyddad från ljus efter den sista tvätten.Efter tre fem minuters PBS tvättar med gunga, tillsätt 60 mikroliter av monteringsmedel som lämpar sig för immunofluorescens längs ytan av ett täckglas per prov och tryck lätt varje glidvävnad avsnitt sida ner på ett täckglas, var noga med att undvika bubblor. Lägg sedan varje bild platt i en mörk behållare för härdning vid rumstemperatur i minst 24 timmar före bildbehandling. Under fettborttagningsprocessen är det viktigt att inte låta binjuren torka ut som uttorkning kan skada vävnadsstrukturen.Efter en lyckad borttagning av den omgivande fettvävnaden, binjuren bör vara lätt detekterbar med inget extra synligt fett. Immunfärgning av adrenal körtel sektioner som visat avslöjar nukleära steroidogena faktor en färgning av adrenocortical cellerna, tyrosin hydroxylas färgning av medullary cellerna, DAPI färgning av atomkärnor av icke-steroidogena celler i den yttre kapseln och co-färgning med adrenocortical och medullary celler. När du försöker detta förfarande, är det viktigt att komma ihåg att mus binjurar är små och att deras positioner är något variabel gör deras upptäckt svårt.Därför är det avgörande att ha en klar bild av området under dissektionen. Dessa förfaranden är grundläggande tekniker för studiet av binjuren in vivo. Efter dessa kan ytterligare metoder för immunfärgning utföras för att möta specifika vetenskapliga behov.Efter dess utveckling banade immunfärgning vägen för forskare inom de biomedicinska vetenskapsområdena att utforska in situ proteinuttryck, ett användbart verktyg inom många discipliner och områden.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Immunology and Infection

Unit 1

The Endocrine System

SCIENTISTS IN ACTION

Isolation of Mouse Peritoneal Cavity Cells

Isolering av Mouse bukhålan celler

The peritoneal cavity is a membrane-bound and fluid-filled abdominal cavity of mammals, which contains the liver, spleen, most of the gastro-intestinal ...

Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

Isolering av Dendritiska Mouse lungceller

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the ...

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Hybridisering<em&gt; In situ</em&gt; Av spottkörtlar, äggstockar, och embryon av Vector myggor

Mosquitoes are vectors for a diverse set of pathogens including arboviruses, protozoan parasites and nematodes.  Investigation of transcripts and gene ...

Intravital Imaging of the Mouse Popliteal Lymph Node

Intravital Imaging of the Mouse knäveckslymfknutas

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign ...

Non-invasive Optical Imaging of the Lymphatic Vasculature of a Mouse

Icke-invasiv optisk avbildning av det lymfatiska vaskulaturen hos en mus

The lymphatic  vascular system is an important component of the circulatory system that  maintains fluid homeostasis, provides immune surveillance, and ...

Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

Isolering av lymfocyter från mus könsorgan Mucosa

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and ...

Time-lapse 3D Imaging of Phagocytosis by Mouse Macrophages

Time-lapse 3D Imaging av fagocytos av mus makrofager

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of ...

Isolation and Quantitative Evaluation of Brush Cells from Mouse Tracheas

Isolering och kvantitativ utvärdering av pensel celler från mus Tracheas

Tracheal brush cells are cholinergic chemosensory epithelial cells poised to transmit signals from the airway lumen to the immune and nervous systems. ...

Isolation of Salivary Epithelial Cells from Human Salivary Glands for In Vitro Growth as Salispheres or Monolayers

Isolering av saliv epitelceller från mänskliga spottkörtlar för in vitro-tillväxt som Salispheres eller Monolayers

The salivary glands are a site of significant interest for researchers interested in multiple aspects of human disease. One goal of researchers is to ...

Implantation and Monitoring by PET/CT of an Orthotopic Model of Human Pleural Mesothelioma in Athymic Mice

Implantation och övervakning av PET/CT av en ortotopisk modell av humant pleural mesoteliom i athymic möss

Malignant pleural mesothelioma (MPM) is a rare and aggressive tumor arising in the mesothelium that covers the lungs, the heart, and the thoracic cavity. ...