Name: affinity purification of chloroplast translocon protein complexes using the tap tag
Uploaded: 2018-11-01T15:00:00
Duration: 7 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Affinity Purification of Chloroplast Translocon Protein Complexes Using the TAP Tag at JoVE.com

Het werk werd gesteund door subsidies van de Zwitserse National Science Foundation (31003A_156998 en 31003A_176191) en de Universiteit van Neuchâtel.

1. bereiding van Arabidopsis planten
<ol><li>Bereiden 1 L van halve sterkte van Murashige en Skoog (MS) middellange inclusief vitaminen met 1% sacharose en breng de pH op 5.7 met kaliumhydroxide (KOH). Toevoegen van 0,8% van het phytoagar en autoclaaf gedurende 20 minuten op 120 ° C.</li>
	<li>Giet 75 mL MS voedingsbodem per plaat Petri (diameter 14,5 cm, hoogte 3 cm) en laat het stollen gedurende 1 uur.</li>
	<li>30 mg van Arabidopsis thaliana zaden toevoegen aan een 1,5 mL microfuge buis, en oppervlak steriliseren met 70% (v/v) ethanol met 0,05% (v/v) Triton X-100 gedurende 5 minuten, gevolgd door 100% (v/v) ethanol voor 10 min. verwijderen de ethanol.</li>
	<li>Overbrengen steriel filter papier voor het drogen van de zaden. Strooi de gesteriliseerde zaden gelijkmatig op een bord van de MS (elk genotype vereist ten minste 8-10 platen), en elke plaat met chirurgische tape zegel.</li>
	<li>Incubeer de platen bij 4 ° C voor twee dagen in het donker te synchroniseren kieming van het zaad. Overdracht aan een groei-kamer met de volgende cyclus van licht: 8 h van 120 µmol m−2 s−1 licht en 16 h van dark bij 22-20 ° C.</li>
</ol>2. voorbereiding van HsIgG Agarose kralen
<ol><li>Schorten CNBr-geactiveerde agarose kralen (4 g) in 100 mL 1 mM HCl en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Breng de agarose kralen in een filter van gesinterd glas, wassen onder vacuüm met 100 mL 100 mM HCl en 2 - 3 keer herhalen. Opmerking: Precool de oplossing van de wash tot 4 ° C.</li>
	<li>Resuspendeer de agarose kralen in 1 mL koude 100 mM HCl en overdracht aan een tube van 50 mL conische centrifuge. Wassen van de filter van gesinterd glas met 3 mL 100 mM HCl en overbrengen van de vloeistof naar de dezelfde buis.</li>
	<li>Spin bij 400 × g gedurende 5 min bij 4 ° C en verwijder de bovendrijvende vloeistof met een pipet. Opmerking: Geen decanteren in de buis.</li>
	<li>Resuspendeer de kralen in 50 mL koppeling buffer (tabel 1); Meng kort en draai vervolgens aan bij 400 × g gedurende 5 min bij 4 ° C.</li>
	<li>Los 50 mg gelyofiliseerd Homo sapiens IgG (Hs-IgG) in 10 mL buffer koppeling, meng de agarose-parels voorzichtig en incubeer in roteerapparaat 's nachts bij 4 ° C.</li>
	<li>Spin bij 400 × g gedurende 5 min bij 4 ° C en verwijder de bovendrijvende vloeistof met een pipet.</li>
	<li>Wassen van de IgG-agarose kralen met 50 mL koppeling buffer en spin bij 400 × g gedurende 5 min bij 4 ° C.</li>
	<li>Resuspendeer de IgG-agarose kralen met 50 mL blokkeerbuffer (tabel 1) en spin bij 400 × g gedurende 5 min bij 4 ° C. Eenmaal herhaald.</li>
	<li>Resuspendeer IgG-agarose kralen in 50 mL blokkeerbuffer, draai het mengsel voor 2 h bij RT en spin bij 400 × g gedurende 5 min bij 4 ° C.</li>
	<li>Verwijder het supernatant en resuspendeer de IgG-agarose kralen in 200 mL NaCl koppeling buffer (tabel 1).</li>
	<li>Wassen als u wilt blokkeren alle resterende cross-linking CNBr groepen, de IgG-agarose kralen met 100 mL 0,1 M glycine-HCl, pH 2,8. Spin bij 400 × g gedurende 5 min bij 4 ° C en verwijder de bovendrijvende substantie. Wassen met 0,2 M glycine-HCl, pH 2,8, spin op 400 × g gedurende 5 minuten bij 4 ° C en verwijder de bovendrijvende substantie. Tot slot wassen de IgG-agarose kralen met 200 mL ultrazuiver water.</li>
	<li>Wassen van de IgG-agarose kralen met 200 mL ultrazuiver water en vervolgens 200 mL PBS buffer (tabel 1).</li>
	<li>Resuspendeer de IgG-agarose kralen in 20 mL PBS buffer met 0,01% NaN3 (natriumazide) en bewaren bij 4 ° C.</li>
</ol>3. isolatie en solubilisatie van de membraan-breuk
<ol><li>Het malen van 10 g van drie weken oud A. thaliana zaailingen in vloeibare stikstof met behulp van een koude mortier en een stamper met zand.</li>
	<li>Voeg 20 mL koude slijpen buffer (tabel 1) tot en met 10 g weefsel van de grond en meng goed op ijs ontdooien.</li>
	<li>Filtreer het homogenaat door twee lagen van snelle filtratie materiaal in een tube van 50mL conische centrifuge. Geniet van de snelle filtratie materiaal met het slijpen van de buffer voor filtratie.</li>
	<li>Centrifugeer het filtraat gedurende 10 min bij 1500 × g bij 4 ° C en breng het supernatant een gekoeld 50 mL conische centrifugebuis, herhaal hetzelfde nog een keer stap en het verzamelen van de bovendrijvende substantie. Een 200 µL monster van de "totale breuk" te behouden en op te slaan bij-80 ° C voor een latere anayse</li>
	<li>Breng het supernatant koud 38.50 mL ultracentrifuge buizen en bovenaan maximaal 35 mL met koude slijpen buffer. Centrifugeer gedurende 1 uur bij 100.000 × g bij 4 ° C in een ultracentrifuge.</li>
	<li>Het supernatant overbrengen in een tube van 50 mL conische centrifuge. Behouden 200 µL eenmonstervan de "oplosbare fractie" en de winkel bij-80 ° C voor een latere anayse.</li>
	<li>Resuspendeer de groene pellet een glas teflon homogenizer, met slijpen buffer. Centrifugeer gedurende 1 uur bij 100.000 × g bij 4 ° C in een ultracentrifuge en verwijder het supernatant.</li>
	<li>Resuspendeer de pellet van groen in 18,75 mL 1 x Buffer met behulp van een glas teflon homogenizer slijpen en voeg 9.375 mL 1 x slijpen buffer.</li>
	<li>Voeg 9.375 mL 4 x solubilisation-oplossing (tabel 1) (met het wasmiddel TX-100) te geven 37,5 mL en incubeer gedurende 30 minuten op een "roterende shaker" bij 4 ° C.</li>
	<li>Centrifugeer gedurende 1 uur bij 100.000 × g bij 4 ° C in een ultracentrifuge. Het supernatant overbrengen in een tube van 50 mL conische centrifuge. Het behouden van een steekproef van 200 µL van de bovendrijvende substantie (toekomst "load fractie") en de winkel bij-80 ° C voor een latere anayse.</li>
	<li>Resuspendeer de pellet in 37,5 mL buffer slijpen. Behouden van het monster van onoplosbare deel en winkel bij-80 ° C</li>
</ol>4. Immunoprecipitation
<ol><li>Equilibreer 100 µL van verpakte IgG-agarose hars in Buffer A (tabel 1) en spin bij 100 × g gedurende 5 min bij 4 ° C.</li>
	<li>Verwijder het supernatant en resuspendeer de IgG-agarose hars in 100 µL van Buffer A bij 4 ° C.</li>
	<li>Breng de gewassen IgG-agarose-hars aan de 37,5 mL ontbindend membranen en na een nacht bebroeden op een roterende shaker in een 50 mL conische centrifugebuis bij 4 ° C.</li>
	<li>Sediment de IgG-agarose hars bij 100 × g gedurende 5 min bij 4 ° C en verwijder de bovendrijvende vloeistof met een pipet. Behouden van 200 µL eenmonstervan de "stroom door" en opslaan bij-80 ° C voor een latere anayse.</li>
	<li>Wassen van de IgG-agarose hars in 37,5 mL Buffer A en incubeer gedurende 10 min op een roterende shaker.</li>
	<li>Sediment de IgG-agarose hars bij 100 × g gedurende 5 min bij 4 ° C, verwijder de bovendrijvende vloeistof met een pipet, voeg 5 mL Buffer A slijpen naar een centrifuge tube van 15 mL en centrifuge op 100 × g, 4 ° C, 5 min. behouden 200 µL eenmonstervan de "Wash 1" en opslaan bij-80 ° C voor een latere anayse.</li>
	<li>Herhaal de 5 mL wassen van stap drie keer met Buffer A.</li>
	<li>Uitvoeren van de laatste twee stappen van het wassen zonder de remmers (NaF, Protease Inhibitor van de omwenteling en PMSF) Opmerking:-Remmers zijn niet langer nodig is in dit stadium en weggelaten om kosten te verminderen. Het behouden van een steekproef van 200 µL van de laatste wassen stap "definitieve wash (W6)" en de winkel bij-80 ° C voor een latere anayse.</li>
	<li>De IgG-agarose hars overbrengen in een 500 µL spin kolom met een 35 µm filter en wassen van de kralen tweemaal met 300 µL van TEV elutie buffer (tabel 1) (niet dat AcTEV bevat) voor de evenwichtsinstelling. Sluit de spin-kolom.</li>
	<li>Voeg 300 µL van TEV elutie buffer met 50 eenheden (10 µL) van AcTEV. De mix in een buis voor te bereiden voordat u toevoegt aan de hars.</li>
	<li>Incubeer de spin-kolom met kralen in een thermomixer bij 16 ° C, 350 rpm voor 2 h. omkeren de kolom zachtjes meerdere malen om 30 min.</li>
	<li>Open de spin-kolom, plaatst u deze in een nieuwe schone 1,5 mL-buis en de spin bij 100 × g gedurende 5 min bij 4 ° C voor het verzamelen van het eluaat.</li>
	<li>Droog (bijvoorbeeld) 10% (v/v) van het eluted monster (~ 25 µL) in een centrifugale verdamper en gebruiken voor massaspectrometrie of andere nadere analyse.</li>
	<li>Aliquot de resterende eluaat (~ 275 µL) verdeeld elf 1,5 mL centrifuge buizen (25 µL elk), drogen in een centrifugale verdamper en opslaan bij-80 ° C.</li>
	<li>Analyseer de monsters bewaard gedurende de procedure, alsmede de eluaten standaard SDS-pagina gevolgd door immunoblotting. Voor de bereiding van de monsters, overhaaste 50 µg voor totale (T), wassen Load (L), stromen door (FT), 1 (W1) en 200 µL van Wash 6 (W6) door de chloroform/methanol extractie16.</li>
	<li>Voeg 10 µL van 2 x SDS-pagina laden buffer (tabel 1) aan de geprecipiteerde samples en 25 µL van gedroogde monster geëlueerd. Vortex en kook gedurende 10 minuten bij 95 ° C in een blok van de warmte.</li>
	<li>Analyseren van de totale (T), Load (L), stromen door (FT), Wash 1 (W1), 6 (W6) en elutie (E) wassen door immunoblotting met anti-TOC159 antilichamen om te bepalen van de doeltreffendheid van de procedure van de isolatie.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Jarvis, P., L&#243;pez-Juez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+and+homeostasis+of+chloroplasts+and+other+plastids.">Biogenesis and homeostasis of chloroplasts and other plastids.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 787-802 (2013).</li><li>Kessler, F., Schnell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloroplast+biogenesis:+diversity+and+regulation+of+the+protein+import+apparatus.">Chloroplast biogenesis: diversity and regulation of the protein import apparatus.</a> Current opinion in cell biology. 21 (4), 494-500 (2009).</li><li>Schnell, D. J., Kessler, F., Blobel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+components+of+the+chloroplast+protein+import+machinery.">Isolation of components of the chloroplast protein import machinery.</a> Science. 266 (5187), 1007-1012 (1994).</li><li>Kessler, F., Blobel, G., Patel, H. A., Schnell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+two+GTP-binding+proteins+in+the+chloroplast+protein+import+machinery.">Identification of two GTP-binding proteins in the chloroplast protein import machinery.</a> Science. 266 (5187), 1035-1039 (1994).</li><li>Jarvis, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Arabidopsis+mutant+defective+in+the+plastid+general+protein+import+apparatus.">An Arabidopsis mutant defective in the plastid general protein import apparatus.</a> Science. 282 (5386), 100-103 (1998).</li><li>Bauer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+role+of+the+G-domain+in+targeting+of+the+protein+import+receptor+atToc159+to+the+chloroplast+outer+membrane.">Essential role of the G-domain in targeting of the protein import receptor atToc159 to the chloroplast outer membrane.</a> The Journal of cell biology. 159 (5), 845-854 (2002).</li><li>Kovacs-Bogdan, E., Soll, J., Bolter, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+import+into+chloroplasts:+the+Tic+complex+and+its+regulation.">Protein import into chloroplasts: the Tic complex and its regulation.</a> Biochimica et biophysica acta. 1803 (6), 740-747 (2010).</li><li>Nakai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+TIC+complex+uncovered:+The+alternative+view+on+the+molecular+mechanism+of+protein+translocation+across+the+inner+envelope+membrane+of+chloroplasts.">The TIC complex uncovered: The alternative view on the molecular mechanism of protein translocation across the inner envelope membrane of chloroplasts.</a> Biochimica et biophysica acta. 1847 (9), 957-967 (2015).</li><li>Kikuchi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncovering+the+protein+translocon+at+the+chloroplast+inner+envelope+membrane.">Uncovering the protein translocon at the chloroplast inner envelope membrane.</a> Science. 339 (6119), 571-574 (2013).</li><li>Kohler, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+chloroplast+protein+import+without+Tic56,+a+component+of+the+1-megadalton+translocon+at+the+inner+envelope+membrane+of+chloroplasts.">Characterization of chloroplast protein import without Tic56, a component of the 1-megadalton translocon at the inner envelope membrane of chloroplasts.</a> Plant physiology. 167 (3), 972-990 (2015).</li><li>Zufferey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+novel+chloroplast+outer+membrane+kinase+KOC1+is+a+required+component+of+the+plastid+protein+import+machinery.">The novel chloroplast outer membrane kinase KOC1 is a required component of the plastid protein import machinery.</a> The Journal of biological chemistry. 292 (17), 6952-6964 (2017).</li><li>Rigaut, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+generic+protein+purification+method+for+protein+complex+characterization+and+proteome+exploration.">A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration.</a> Nature biotechnology. 17 (10), 1030-1032 (1999).</li><li>Rohila, J. S., Chen, M., Cerny, R., Fromm, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+tandem+affinity+purification+tag+and+methods+for+isolation+of+protein+heterocomplexes+from+plants.">Improved tandem affinity purification tag and methods for isolation of protein heterocomplexes from plants.</a> The Plant journal. 38 (1), 172-181 (2004).</li><li>Rohila, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interactions+of+tandem+affinity+purified+protein+kinases+from+rice.">Protein-protein interactions of tandem affinity purified protein kinases from rice.</a> PloS one. 4 (8), 6685 (2009).</li><li>Agne, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acidic+A-domain+of+Arabidopsis+TOC159+occurs+as+a+hyperphosphorylated+protein.">The acidic A-domain of Arabidopsis TOC159 occurs as a hyperphosphorylated protein.</a> Plant physiology. 153 (3), 1016-1030 (2010).</li><li>Wessel, D., Flugge, U. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+quantitative+recovery+of+protein+in+dilute+solution+in+the+presence+of+detergents+and+lipids.">A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids.</a> Analytical biochemistry. 138 (1), 141-143 (1984).</li></ol>

De auteurs verklaren geen concurrerende belangen.

We laten zien dat een enkele stap TAP label zuivering een specifieke en efficiënte methode voor de zuivering van het Arabidopsis TOC-TIC complex is. Hoewel de TAP-tag zou twee opeenvolgende zuivering stappen (IgG-gevolgd door Calmoduline affiniteit zuivering na de TEV protease-decolleté), wij zijn van mening dat in veel gevallen de eerste affiniteit stap gevolgd door TEV protease decollete voldoende zal zijn. Ons doel, TOC159, is lage overvloedig en de opneming van de tweede stap van de Calmoduline-affiniteit overdreven verminderd de opbrengst van eiwit, dat de belangrijkste reden was voor het uitsluiten van onze huidige protocol. De TEV-elutie op zich is een zeer specifieke en zachte zuivering stap die alleen het TAP-gelabeld doel samen met bijbehorende interactie partners loslaat zal terwijl er besmetting van de eiwitten vasthouden niet-specifiek aan de IgG-hars blijft. Dus, in combinatie met de IgG-affiniteit stap, de TEV elutie resulteert in een voldoende efficiënte reiniging voor onze en waarschijnlijk vele anderen doeleinden.
Worden moet gezorgd dat de kraan-gelabeld constructie volledig functioneel in vivo is. TAP-tagging kon potentieel schadelijke effecten hebben op eiwit activiteit, stabiliteit of lokalisatie. TOC159 bestaat uit drie domeinen, het N-terminaal zure domein, de centrale GTP-bindend domein en C-terminal membraan domein, dat TOC159 wordt verankerd in de buitenste chloroplast membraan2. Om te voorkomen dat mogelijke storing met membraan inbrengen, gesmolten we de TAP-tag aan de N-terminus van TOC159. Fusie aan de N-terminus is eerder de uitzondering dan de regel. Veel eiwitten bevatten N-terminale gericht op informatie en moeten daarom door tagged op de C-terminus. Ons verzekerd dat TOC159 is functionele in vivo door complementeren van de mutant ppi2 (een albino mutant ontbreekt TOC159) met TAP-TOC159. De redding van het groen, wild type fenotype aangegeven dat TAP-TOC159 functionele15was.
De zuivering-protocol is gebruikt voor het identificeren van nieuwe partners van de interactie van TOC159, die KOC1 en TIC5610,11opgenomen. In totaal werden er ongeveer 30 eiwitten geassocieerd met het complex suggereren dat nieuwe interactie partners zal worden geïsoleerd en in de nabije toekomst gekenmerkt. Terwijl we raden sterk aan de TAP-tag voor complexe zuivering, wil wij nog op wijzen dat extra versies aan de hier gepresenteerde bestaan en zeer nuttig zijn voor sommige toepassingen kunnen.

Planten zijn afhankelijk van chloroplasten voor fotosynthese en photoautotrophic groei1. De overgrote meerderheid van chloroplast eiwitten worden gecodeerd in de kern, in het cytosol gesynthetiseerd en in de chloroplast via de TIC en TOC complexen in de envelop membranen2geïmporteerd. De kern van de inhoudsopgave complex bestaat uit het Toc75 eiwit-geleidend kanaal en de twee receptor GTPases Toc33 en Toc1593,4,5. TOC159 is essentieel voor de biogenese van chloroplasten en bemiddelt de massale ophoping van fotosynthese-geassocieerde eiwitten6. De TIC-complex bestaat uit de TIC20 eiwit-geleidend kanaal, evenals TIC110 en TIC407,8. Onlangs, een 1MD eiwit translocatie complex op de binnenste enveloppe membraan werd geïsoleerd en bevatte eerder geïdentificeerde onderdelen9, een daarvan TIC56 was. We onlangs samen TIC56 van het complex via het TAP-TOC159 affiniteit zuivering protocol 1 MDa geïsoleerd. De gegevens aangegeven een structurele overlapping tussen de "canonieke" TOC/TIC-complexen en de 1 MDa complexe10. Onbekende componenten zoals KOC1 waren eerder ook geïdentificeerd als nieuwe partners van de interactie van de TOC en TIC complexen met de TAP-methode hier10,11 beschreven.
Dus, de zuivering van de TAP-tag is een efficiënte methode voor de isolatie van eiwitcomplexen en de identificatie van interagerende partners door latere massaspectrometrische analyse12. De kraan tag bestaat uit twee IgG bindende herhalingen van een Calmoduline-bindend peptide (CBP) gescheiden door een tabak etch virus (TEV) protease breukzijde. De originele methode, bestaande uit een IgG-affiniteit zuivering stap gevolgd door TEV decollete en latere Calmoduline-affiniteitchromatografie toegestaan de inheemse zuivering van grote en zeer zuiver eiwit complexen13,14 . Wij hebben de procedure vereenvoudigd en aangetoond dat de TOC159-bevattende eiwitcomplexen ook gezuiverd kunnen worden efficiënt met behulp van alleen de IgG-affiniteit zuivering gevolgd door TEV-splitsing voor elutie15. In onze ervaring, de weglating van de Calmoduline-affiniteit stap resulteerde in hogere opbrengsten en wellicht daarom geschikt voor lage overvloed eiwitten.
Kortom, wij stabiele transgene A. thaliana ontworpen lijnen uiten TAP-TOC159 in de ppi2 (toc159 KO mutant) achtergrond en opgericht als een betrouwbare bron voor de zuivering van TOC-TIC complexen. Het protocol voor de isolatie van de TOC-TIC complex begint met de homogenisering van de plantaardig materiaal in een buffer wasmiddel-gratis. Na het centrifugeren, wordt het supernatant verwijderd. De pellet met de Fractie van de totale membraan is ontbindend met behulp van een wasmiddel-bevattende buffer. Na een ultra-centrifugeren stap, is het supernatant ontbindend TOC-TIC complexen met toegepast op de IgG-hars voor affiniteit zuivering. Na verscheidene stappen wassen, elutie is uitgevoerd met een TEV protease-bevattende buffer selectief klieven stroomafwaarts van de IgG-bindende domeinen en zachtjes vrijlating van inheemse TOC159-bevattende complexen. Het eluaat TEV kan direct door westelijke bevlekken of Spectrometrie van de massa te identificeren van de partners van de interactie van TOC15910,11,15worden geanalyseerd. De methode is ook gebruikt om te identificeren posttranslationele modificaties van TOC15915. Inheemse TOC159-bevattende complexen kunnen in de toekomst worden gebruikt voor structurele studies met cryoelectron microscopie.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:783px;" width="783">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:312px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:185px;">PanReac&#160; AppliChem</td>
			<td style="width:119px;">A0384</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Tris</td>
			<td style="width:185px;">Biosolve</td>
			<td style="width:119px;">0020092391BS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:312px;">Na2HPO4</td>
			<td style="width:185px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S7909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:312px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:185px;">PanReac&#160; AppliChem</td>
			<td style="width:119px;">A2946</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">NaCl</td>
			<td style="width:185px;">PanReac&#160; AppliChem</td>
			<td style="width:119px;">A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">NaF</td>
			<td style="width:185px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S1509</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">PMSF</td>
			<td style="width:185px;">PanReac&#160; AppliChem</td>
			<td style="width:119px;">A0999</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Plant protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:185px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P9599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Glycerol</td>
			<td style="width:185px;">PanReac&#160; AppliChem</td>
			<td style="width:119px;">A0970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Triton X100</td>
			<td style="width:185px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">10789704001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Glycine</td>
			<td style="width:185px;">PanReac&#160; AppliChem</td>
			<td style="width:119px;">A1067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">EDTA</td>
			<td style="width:185px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:119px;">8043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:185px;">PanReac&#160; AppliChem</td>
			<td style="width:119px;">A1101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">SDS</td>
			<td style="width:185px;">PanReac&#160; AppliChem</td>
			<td style="width:119px;">A0675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Bromophenol blue</td>
			<td style="width:185px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">B0126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">HCl</td>
			<td style="width:185px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">20252-290</td>
			<td>Corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Sucrose</td>
			<td style="width:185px;">PanReac&#160; AppliChem</td>
			<td style="width:119px;">A3935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:312px;">Murashige and Skoog medium with vitamins</td>
			<td style="width:185px;">Duchefa Biochemie</td>
			<td style="width:119px;">M0222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Phytoagar</td>
			<td style="width:185px;">Duchefa Biochemie</td>
			<td style="width:119px;">P1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Petri plate</td>
			<td style="width:185px;">Greiner Bio-one</td>
			<td style="width:119px;">639102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">1.5 mL microfuge tubes</td>
			<td style="width:185px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:119px;">72.706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Ethanol</td>
			<td style="width:185px;">Fisher chemical</td>
			<td style="width:119px;">E/0600DF/15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Filter paper&#160;</td>
			<td style="width:185px;">Whatman</td>
			<td style="width:119px;">10311804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Surgical tape</td>
			<td style="width:185px;">3M</td>
			<td style="width:119px;">1530-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:312px;">CNBr-Activated agarose beads (sepharose 4B)</td>
			<td style="width:185px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">17-0430-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Sintered glass filter</td>
			<td style="width:185px;">DURAN</td>
			<td style="width:119px;">2515703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Centrifuge tube 50 mL</td>
			<td style="width:185px;">TPP</td>
			<td style="width:119px;">91050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Purified immunoglobulin G (HsIgG)</td>
			<td style="width:185px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:119px;">855908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Rotating shaker</td>
			<td style="width:185px;">IKA</td>
			<td>4016000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:312px;">NaN3 (sodium azide)</td>
			<td style="width:185px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">71290</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Quick filtration material (Miracloth)</td>
			<td style="width:185px;">Merk-Millipore</td>
			<td style="width:119px;">475855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Ultracentrifube XNP-80</td>
			<td style="width:185px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">A99839</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Rotor SW 32 Ti</td>
			<td style="width:185px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">369650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Ultracentrifuge tubes</td>
			<td style="width:185px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">326823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Glass teflon homogenizer (Potter)</td>
			<td style="width:185px;">Wheaton</td>
			<td style="width:119px;">357426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Spin column (Mobicol)</td>
			<td style="width:185px;">Mo Bi Tec</td>
			<td style="width:119px;">M1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Filter 35&#181;m for spin column (Mobicol)</td>
			<td style="width:185px;">Mo Bi Tec</td>
			<td style="width:119px;">M513515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">AcTEV</td>
			<td style="width:185px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">12575-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Centrifugal evaporator (Speed Vac)</td>
			<td style="width:185px;">Eppendorf</td>
			<td>5305000100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">FBN1A(PGL35) antibody</td>
			<td style="width:185px;">AgriSera</td>
			<td>AS06 116</td>
			<td>RRID:AB_2247012</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sand, Fontainebleau</td>
			<td style="width:185px;">VWR</td>
			<td>27460.295</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

affinity purification of chloroplast translocon protein complexes using the tap tag

Chloroplast biogenese vereist de import van duizenden proteïnen nucleus-gecodeerd in de Plastide. De invoer van deze eiwitten is afhankelijk van de translocon op de buitenste (TOC) en innerlijke (TIC) chloroplastmembranen. De TOC en TIC complexen zijn multimeric en waarschijnlijk nog onbekende componenten bevatten. Een van de belangrijkste doelstellingen op het gebied is om de volledige inventaris van TOC en TIC componenten. Voor de isolatie van TOC-TIC-complexen en de identificatie van nieuwe onderdelen bewerkt de preprotein receptor die toc159 is N-terminaal door toevoeging van de tandem affiniteit zuivering (TAP) tag resulterend in TAP-TOC159. De TAP-tag is ontworpen voor twee opeenvolgende affiniteit zuivering stappen (vandaar "tandem affiniteit"). De TAP-code die wordt gebruikt in deze studies bestaat uit een N-terminal IgG-bindend domein Staphylococcus aureus eiwit een (próta) gevolgd door een Calmoduline-bindend peptide (CBP) afgeleid. Tussen deze twee affiniteit tags, een tabak etch virus (TEV) protease decollete site is opgenomen. Daarom kan TEV protease worden gebruikt voor zachte elutie van TOC159-bevattende complexen na binding met IgG kralen. In het protocol hier gepresenteerd, werd de tweede Calmoduline-affiniteit zuivering stap weggelaten. Het protocol van de zuivering begint bij de voorbereiding en de solubilisatie van totale cellulaire membranen. Na de wasmiddel-behandeling, worden de ontbindend membraaneiwitten geïncubeerd met IgG kralen voor de immunoisolation van TAP-TOC159-bevattende complexen. Op bindende en uitgebreide wassen, zijn kraan-TOC159 met complexen gekloofd en vrijgelaten uit de IgG-kralen met behulp van de TEV protease waarbij de S. aureus IgG-bindend domein is verwijderd. Westelijke bevlekken van de afgelegen TOC159-bevattende complexen kunnen worden gebruikt ter bevestiging van de aanwezigheid van bekende of veronderstelde TOC en TIC eiwitten. Wat nog belangrijker is, de TOC159-bevattende complexen hebben met succes gebruikt om nieuwe onderdelen van de TOC en TIC complexen te identificeren door massaspectrometrie. Het protocol dat we mogelijk presenteren maakt de efficiënte isolatie van een membraan-gebonden eiwit complex om te worden gebruikt voor de identificatie van nog onbekende componenten door massaspectrometrie.

We beschreven hier een protocol voor de zuivering van een kraan-gelabeld chloroplast envelop eiwit complex van transgene A. thaliana planten. Zoals blijkt uit Figuur 1A, planten uiting geven aan de 35S:NTAP-TOC159 constructie werden gebruikt voor het isoleren van dit complex, terwijl planten uiting geven aan de 35S:NTAP-constructie werden gebruikt als een besturingselement. Figuur 1 B toont gedetailleerde stappen voor de zuivering van de TAP-TOC159 eiwitcomplexen gevolgd door Spectrometrie van de massa de inventarisatie van interacterende eiwitten. De analyse van de immunoblot (Figuur 2, rechterkant) bevestigt dat geïsoleerde TAP-TOC159 met TOC75 en TOC33 van de TOC-complex omgaat. De chloroplast buitenmembraan kinase KOC1 bekend bij phosphorylate TOC159 ook mede geïsoleerd met het TAP-TOC159-complex (Figuur 2B, rechterkant). De aanwezigheid van TIC110 blijkt dat de geïsoleerde TAP-TOC159-complex ook de onderdelen van het complex van de TIC bevat. Het antilichaam van de FBN1A aan de orde gesteld tegen een plastoglobule eiwit niet verwant aan eiwitten importeren herkent het TAP-TOC159 complex met vermelding van de afwezigheid van verontreinigingen niet. In de negatieve controle, immunoprecipitated NTAP eiwit deed niet mede isoleren met om het even welk van de TOC-TIC eiwitten (Figuur 2, links) en bevestigt de specificiteit van de zuivering van de TAP-TOC159.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58532/58532fig1.jpg"> Figuur 1 . Regeling van de constructies en affiniteit zuivering procedure. (A). de 35S:NTAP-constructie, codering van NTAP-TOC159 stabiel was TOC159 uitgedrukt in Arabidopsis thaliana. Negatieve controle planten uitgedrukt codering van de TAP-tag alleen constructie voor de 35S:NTAP. (B). het protocol van de reiniging van het verstandig affiniteit van stap bestaat uit membraan isolatie en solubilisatie, IgG agarose immuno-zuivering, wast, TEV protease decollete en elutie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58532/58532fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58532/58532fig2.jpg"> Figuur 2 . Tandem affiniteit zuivering van het eiwit TOC159. N-terminaal TOC159 TAP-gelabeld werd gezuiverd van NTAP-TOC15:ppi2 Arabidopsis planten en TAP eiwit gezuiverd van TAP: WT planten werd gebruikt als een negatieve controle. Eiwithoudende extracten (T), ontbindend membraaneiwitten Total = belasting breuk (L), stromen door (FT), eerste en laatste spoel breuken (W1 en W6) en 10% van het eluaat TEV werden geanalyseerd door het westelijke bevlekken. Het membraan met de antistoffen tegen TOC159 was gesondeerd (AT4G02510), TOC75 (AT3G46740), TOC33 (AT1G02280), KOC1 (AT4G32250), TIC110 (AT1G06950), en FBN1A (AT4G04020). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58532/58532fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Tabel van buffers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Koppeling Buffer</td>
			<td>NaHCO3 Aanpassen aan pH 8,5 pH met 0,1 M Na2CO3 regelen
</td>
			<td>100 mM 
			 </td>
		</tr>
<tr>
<td>Blokkeerbuffer</td>
			<td>Tris-HCl Aangepast aan de pH 8 met HCl.</td>
			<td>100 mM 
			 </td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS Buffer</td>
			<td>NB2HPO4 KH2PO4 NaCl KCl Aangepast aan de pH 7,3 met HCl.</td>
			<td>4.3 mM 1.4 mM 137 2.7 
			 </td>
		</tr>
<tr>
<td>NaCl koppeling Buffer</td>
			<td>Koppeling buffer NaCl</td>
			<td>  1 M</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 x slijpen Buffer</td>
			<td>Tris-HCl, pH 7.5 met HCl. NaCl NaF PMSF Plant protease inhibitor cocktail</td>
			<td>100 mM 200 mM 5 mM 1 mM 0,20%</td>
		</tr>
<tr>
<td>4 x oplossen oplossing</td>
			<td>Glycerol Triton-X100</td>
			<td>40% 3%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Buffer A</td>
			<td>  2 x slijpen Buffer 1 x slijpen Buffer 4 x oplossen oplossing</td>
			<td>100 ml 50 ml 25 ml 25%</td>
		</tr>
<tr>
<td>TEV elutie Buffer</td>
			<td>Tris-HCl, pH 8 met HCl EDTA, pH 8 met HCl NaCl Glycerol Triton-X100 DTT</td>
			<td>50 mM 0.5 mM 100 mM 10% 0,75% 1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 x SDS-pagina laden van de Buffer</td>
			<td>Tris-HCl pH 6.8 met HCl SDS Glycerol Bromophenol blauw DTT</td>
			<td>0,1 M 4% 20% 0,20% 0,2 M</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1. De recepten van de buffer.

Watch this Scientific Journal Video about Affinity Purification of Chloroplast Translocon Protein Complexes Using the TAP Tag at JoVE.com

Affinity Purification of Chloroplast Translocon Protein Complexes Using the TAP Tag

Hier presenteren we een bewezen en geteste protocol voor de zuivering van chloroplast importeren eiwitcomplexen (TOC-TIC complex) met behulp van de TAP-tag. Het protocol van de verwantschap-isolatie one-step potentieel kan worden toegepast op elke proteïne en worden gebruikt om nieuwe interactie partners door massaspectrometrie.

Affiniteit zuivering van Chloroplast Translocon eiwitcomplexen met behulp van de Tag van de TAP

Chloroplast biogenesis requires the import of thousands of nucleus-encoded proteins into the plastid. The import of these proteins depends on the ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het chloroplast veld, bijvoorbeeld de samenstelling van de chloroplast eiwit import machines. Het is essentieel voor vergroening en fotosynthese en dus voor de voedselproductie op de planeet. De moleculaire machine bestaat uit twee afzonderlijke complexen in het buiten- en binnenste lid van het chloroplast genaamd TOC en TIC, maar de samenstelling is niet volledig bekend.Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de zuivering van Arabidopsis TOC / TIC complex kan worden bereikt in een enkele stap zuiveringsmethode, TAP-TOC zuivering. Het is een specifieke en efficiënte methode. Over het algemeen kunnen onderzoekers die nieuw zijn bij deze methode worstelen omdat ze niet bekend zijn met de isolatie van chloroplastmembraanfracties, wasmiddel, oplosmiddel of affiniteitszuivering.Na het bereiden van de Arabidopsis planten, maal 10 gram van drie weken oude zaailingen in vloeibare stikstof, met behulp van een koude mortel en stamper met zand. Voeg 20 milliliter koude slijpbuffer toe aan de gemalen weefsels. Meng goed en laat het mengsel ontdooien op ijs.Vervolgens weken twee lagen van snelle filtratie materiaal met slijpbuffer. Filtreer het homogenaat door de twee lagen filtermateriaal in een conische centrifugebuis van 50 milliliter. Centrifugeer het filtraat op 1, 500 keer g in vier graden Celsius gedurende 10 minuten en breng de supernatant over op een verse, voorgekoelde conische centrifugebuis van 50 milliliter.Herhaal de centrifugatie nogmaals onder dezelfde omstandigheden. Breng de supernatant naar een koude 38,50 milliliter ultracentrifuge buis en vul het tot 35 milliliter met koude slijpbuffer. Gebruik een ultracentrifuge om het monster gedurende een uur te centrifugeren op 100, 000 keer g en vier graden Celsius.Met behulp van een glazen Teflon homogenisator, resuspend de groene pellet in slijpbuffer. Centrifuge op 100, 000 keer g en vier graden Celsius gedurende een uur en gooi de supernatant. Gebruik de glazen Teflon homogenisator om de groene pellet opnieuw op te hangen in 18,75 milliliter van één x slijpbuffer.Voeg vervolgens nog eens 9.375 milliliter van een x slijpbuffer toe. Voeg 9.375 milliliter van vier x oplosoplossing toe om het uiteindelijke volume op 37,5 milliliter te brengen en gedurende 30 minuten op een roterende shaker bij vier graden Celsius te laten waerpen. Gebruik hierna een ultracentrifuge om het monster gedurende een uur te centrifugeren op 100, 000 g en vier graden Celsius.Breng de supernatant met de oplosbaar membranen over naar een verse kegelvormige centrifugebuis van 50 milliliter. Na de voorbereiding van de IGG agarose hars, breng de eerder gewassen IGG agarose hars naar de 50 milliliter conische buis met de 37,5 milliliter van oplosbaar membranen. Broeden 's nachts op een roterende shaker op vier graden Celsius.De volgende dag, sediment de IGG agarose hars op 100 keer g en vier graden Celsius gedurende vijf minuten. Gebruik een pipet om de supernatant te verwijderen. Was de IGG agarose hars in 37,5 milliliter buffer A en incubbate op een roterende shaker bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.Doorgaan met sedimenteren en wassen van de hars zoals beschreven in het tekstprotocol. Breng hierna de IGG-agarose hars over naar een 500 microliter spinkolom met een filter van 35 micron. Was de kralen twee maal met 300 microliters van TEV elutie buffer voor evenwicht.Voeg vervolgens 300 microliters van TEV-elutiebuffer toe die 10 microliter TEV-protease bevatten. Broed de spinkolom met kralen in een Thermomixer bij 16 graden Celsius en 350 rpm gedurende twee uur. Open vervolgens de draaikolom en plaats deze in een nieuwe, schone buis van 1,5 milliliter.Draai deze buis op 100 keer g en vier graden Celsius gedurende vijf minuten om de eluate te verzamelen. In deze studie wordt een TAP gelabeld chloroplast envelop eiwit complex van transgene A.thaliana planten gezuiverd. Immunoblot analyse bevestigt dat isolaat TAP-TOC159 interageert met TOC75 en TOC33 van het TOC-complex.De chloroplast buitenste membraan kinase, KOC1, waarvan bekend is dat fosforylaat TOC159 is ook co-geïsoleerd. De aanwezigheid van TIC110 laat zien dat het geïsoleerde TAP-TOC159 complex ook de componenten van het TIC-complex bevat. Het FBN1A-antilichaam herkende het TAP-TOC159-complex niet, wat duidt op de afwezigheid van verontreinigingen.In de negatieve controle isoleerde NTAP-eiwit niet co-isoleren met een van de TOC-, TIC-eiwitten en bevestigt het de specificiteit van de TAP-TOC159-zuivering. Hoewel deze methode inzicht kan geven in chloroplast eiwitimport, kan het mogelijk worden toegepast op elk ander complex in het Arabidopsis thaliana-flessysteem. Na deze procedure kunnen andere methoden worden toegepast, zoals westerse blotting of massaspectrometrie om de aanwezigheid van bekende componenten aan te tonen of om nieuwe componenten van de TOC- en TIC-complexen te identificeren.Deze techniek maakte de weg vrij voor onderzoek op het gebied van chloroplast eiwitimport om de functie van nieuwe componenten van de TOC- en TIC-complexen te verkennen.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Unit 1

Intracellular Compartments and Protein Sorting

SCIENTISTS IN ACTION

Isolation of Cognate RNA-protein Complexes from Cells Using Oligonucleotide-directed Elution

Isolatie van Cognate RNA-eiwitcomplexen van cellen met behulp van oligonucleotide-gerichte Elution

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. ...

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Eiwitcomplex Affiniteit Capture uit Cryomilled zoogdiercellen

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

Tandem affiniteitszuivering van eiwitcomplexen van eukaryote cellen

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Identification of Plant Ice-binding Proteins Through Assessment of Ice-recrystallization Inhibition and Isolation Using Ice-affinity Purification

Identificatie van Plant Ice-bindende eiwitten Through Beoordeling van Ice-herkristallisatie inhibitie en isolatie met behulp van Ice-affiniteitszuivering

Ice-binding proteins (IBPs) belong to a family of stress-induced proteins that are synthesized by certain organisms exposed to subzero temperatures. In ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Het oplossen van Affiniteit gezuiverde eiwit complexen door Blue inheemse PAGE en Protein Correlatie Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

Detectie en visualisatie van DNA-schade-geïnduceerde eiwitcomplexen in suspensiecellenculturen met behulp van de proximity-liggingsassay

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Rab10 fosforylering detectie door LRRK2 activiteit met behulp van SDS-pagina met een fosfaat-bindende-Tag

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 in 1: stap zuivering van de affiniteit voor de parallelle analyse van eiwit-eiwit en eiwit-metaboliet complexen

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Preparation of Chloroplast Sub-compartments from Arabidopsis for the Analysis of Protein Localization by Immunoblotting or Proteomics

Voorbereiding van Chloroplast sub compartimenten van Arabidopsis voor de analyse van eiwit lokalisatie door Immunoblotting of Proteomics

Chloroplasts are major components of plant cells. Such plastids fulfill many crucial functions, such as assimilation of carbon, sulfur and nitrogen as ...