Name: affinity purification of chloroplast translocon protein complexes using the tap tag
Uploaded: 2018-11-01T15:00:00
Duration: 7 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Affinity Purification of Chloroplast Translocon Protein Complexes Using the TAP Tag at JoVE.com

Le travail a été soutenu par des subventions de la Swiss National Science Foundation (31003A_156998 et 31003A_176191) et par l’Université de Neuchâtel.

1. préparation des plantes Arabidopsis
<ol><li>Préparer 1 L de force la moitié du milieu de Murashige et Skoog (MS) moyen y compris vitamines contenant 1 % de sucrose et ajuster le pH à 5,7 avec l’hydroxyde de potassium (KOH). Ajouter 0,8 % du phytoagar et stériliser pendant 20 min à 120 ° C.</li>
	<li>Verser 75 mL de milieu MS par boîte de Petri (diamètre 14,5 cm, hauteur 3 cm) et de permettre la solidification pendant 1 h.</li>
	<li>Ajouter 30 mg de graines d’Arabidopsis thaliana à un tube de microtubes de 1,5 mL et surface de stériliser avec de l’éthanol 70 % (v/v) contenant 0,05 % (v/v) X-100 Triton pendant 5 min, suivie de 100 % (v/v) d’éthanol pendant 10 min. Retirez l’éthanol.</li>
	<li>Transférer les graines stérile papier filtre pour le séchage. Saupoudrer les graines stérilisées uniformément sur une plaque de MS (chaque génotype nécessite au moins 8 à 10 plaques) et sceller chaque plaque avec ruban chirurgical.</li>
	<li>Incuber les plaques à 4 ° C pendant deux jours dans l’obscurité pour synchroniser la germination des graines. Transfert vers une chambre de croissance avec le cycle de lumière suivant : 8 h de 120 µmol m−2 s−1 léger et 16 h d’obscurité à 22-20 ° C.</li>
</ol>2. préparation de la HsIgG d’Agarose perles
<ol><li>Suspendre le CNBr activés d’agarose perles (4 g) dans 100 mL d’HCl à 1 mM et incuber 30 min à température ambiante.</li>
	<li>Transférer les perles d’agarose dans un filtre en verre fritté, laver sous vide avec 100 mL d’HCl à 100 mM et répéter 2 - 3 fois. NOTE : Refroidir la solution de lavage à 4 ° C.</li>
	<li>Remettre en suspension l’agarose perles dans 1 mL de HCl à 100 mM froid et les transférer dans un tube à centrifuger conique 50 mL. Laver le filtre en verre fritté avec 3 mL de HCl à 100 mM et transférer le liquide dans le même tube.</li>
	<li>Tournant à 400 × g pendant 5 min à 4 ° C et retirer le surnageant avec une pipette. Remarque : Ne pas décanter le tube.</li>
	<li>Remettre en suspension les perles dans 50 mL de tampon de couplage (tableau 1) ; mélanger brièvement et ensuite tourner à 400 × g pendant 5 min à 4 ° C.</li>
	<li>Dissoudre 50 mg de l’Homo sapiens lyophilisée IgG (Hs-IgG) dans 10 mL de tampon de couplage, mélanger doucement les talons d’agarose et incuber dans un agitateur rotatif pendant une nuit à 4 ° C.</li>
	<li>Tournant à 400 × g pendant 5 min à 4 ° C et retirer le surnageant avec une pipette.</li>
	<li>Laver les perles IgG-agarose avec 50 mL de couplage tampon et un essorage à 400 × g pendant 5 min à 4 ° C.</li>
	<li>Remettre en suspension les perles IgG-agarose avec 50 mL de tampon de blocage (tableau 1) et un essorage à 400 × g pendant 5 min à 4 ° C. Répéter une fois.</li>
	<li>Remettre en suspension les IgG-agarose perles dans 50 mL de tampon de blocage, tournez le mélange pendant 2 h à RT et un essorage à 400 × g pendant 5 min à 4 ° C.</li>
	<li>Retirez le surnageant et remettre en suspension les IgG-agarose perles dans 200 mL de tampon de couplage de NaCl (tableau 1).</li>
	<li>Pour bloquer les groupes restants de CNBr réticulation, laver les perles IgG-agarose avec 100 mL de glycine-HCl 0,1 M pH 2,8. Tournant à 400 × g pendant 5 min à 4 ° C et éliminer le surnageant. Laver avec 0,2 M glycine-HCl, pH 2,8, essorage à 400 × g pendant 5 min à 4 ° C et éliminer le surnageant. Enfin, laver les perles IgG-agarose avec 200 mL d’eau ultrapure.</li>
	<li>Laver les perles IgG-agarose avec 200 mL d’eau ultrapure et ensuite 200 mL de tampon PBS (tableau 1).</li>
	<li>Remettre en suspension les IgG-agarose perles dans 20 mL de tampon PBS avec 0,01 % NaN3 (azoture de sodium) et de conserver à 4 ° C.</li>
</ol>3. isolement et solubilisation de la Fraction de Membrane
<ol><li>Broyer 10 g de semis a. thaliana âgé de trois semaines dans l’azote liquide en utilisant un froid mortier et un pilon avec du sable.</li>
	<li>Ajouter 20 mL de froid meulage tampon (tableau 1) à 10 g de tissu fondamental, bien mélanger et fondre sur la glace.</li>
	<li>Filtrer l’homogénat deux couches de matériau de filtration rapide dans un tube à centrifuger conique 50mL. Faire tremper le matériel de filtration rapide avec mouture tampon avant la filtration.</li>
	<li>Centrifuger le filtrat pendant 10 min à 1 500 × g à 4 ° C et transfert le surnageant dans un tube à centrifuger conique réfrigérés 50 mL, répétez la même étape une fois de plus et récupérer le surnageant. Conserver un échantillon de 200 µL de la « fraction totale » et conserver à-80 ° C pour une analyse ultérieure</li>
	<li>Transférer le surnageant à tubes ultracentrifugeuse mL 38,50 froide et garnir à 35 mL avec tampon de meulage froid. Centrifuger pendant 1 h à 100 000 × g à 4 ° C dans une ultracentrifugeuse.</li>
	<li>Transférer le surnageant dans un tube à centrifuger conique 50 mL. Conserver un échantillon de 200 µL de la « fraction soluble » et les conserver à-80 ° C pour une analyse ultérieure.</li>
	<li>Resuspendre le culot vert en utilisant un homogénéisateur de téflon de verre, dans un tampon de meulage. Centrifuger pendant 1 h à 100 000 × g à 4 ° C dans une ultracentrifugeuse et éliminer le surnageant.</li>
	<li>Resuspendre le culot vert dans 18,75 mL 1 x tampon à l’aide d’un homogénéisateur de téflon verre de meulage et ajouter 9,375 mL 1 x tampon de meulage.</li>
	<li>Ajouter 9,375 mL de la solution de x solubilisation 4 (tableau 1) (contenant le détergent TX-100) pour donner 37,5 mL et incuber pendant 30 minutes sur un « agitateur rotatif » à 4 ° C.</li>
	<li>Centrifuger pendant 1 h à 100 000 × g à 4 ° C dans une ultracentrifugeuse. Transférer le surnageant dans un tube à centrifuger conique 50 mL. Conserver un échantillon de 200 µL du surnageant (futur « fraction de charge ») et conserver à-80 ° C pour une analyse ultérieure.</li>
	<li>Resuspendre le culot dans 37,5 mL de tampon de meulage. Conserver l’échantillon de la partie insoluble et conserver à-80 ° C</li>
</ol>4. immunoprécipitation
<ol><li>Equilibrer les 100 µL de panier résine IgG-agarose en tampons A (tableau 1) et un essorage à 100 × g pendant 5 min à 4 ° C.</li>
	<li>Retirez le surnageant et remettre en suspension dans la résine IgG-agarose dans 100 µL de tampons A à 4 ° C.</li>
	<li>Transférer la résine IgG-agarose lavée à 37,5 mL des membranes solubilisées et incuber pendant la nuit sur un agitateur rotatif dans un tube à centrifuger conique 50 mL à 4 ° C.</li>
	<li>Sédiments l’IgG-agarose en résine à 100 × g pendant 5 min à 4 ° C et retirer le surnageant avec une pipette. Conserver un échantillon de 200 µL du flux « à travers » et conserver à-80 ° C pour une analyse ultérieure.</li>
	<li>Laver la résine IgG-agarose à 37,5 mL de tampons A et incuber pendant 10 min sur un agitateur rotatif.</li>
	<li>Sédiments la résine IgG-agarose à 100 × g pendant 5 min à 4 ° C, retirez le surnageant avec une pipette, ajouter 5 mL de broyage des tampons A dans un tube à centrifuger de 15 mL et centrifuger à 100 × g, 4 ° C, 5 min. conserver un échantillon de 200 µL du « Lavage 1 » et conserver à-80 ° C pour une analyse ultérieure.</li>
	<li>Répéter les 5 mL étape trois fois avec le tampon A. de lavage</li>
	<li>Effectuer les deux dernières étapes de lavage sans les inhibiteurs (NaF, inhibiteur de la protéase et PMSF) NOTE : Les inhibiteurs sont n’est plus nécessaire à ce stade et omis pour réduire les coûts. Conserver un échantillon de 200 µL du dernier lavage étape « lavage final (W6) » et conserver à-80 ° C pour une analyse ultérieure.</li>
	<li>Transférer la résine IgG-agarose à une colonne 500 µL avec un filtre à 35 µm et laver les perles deux fois avec 300 µL de tampon d’élution TEV (tableau 1) (ne contenant ne pas de AcTEV) pour l’équilibration. Fermer la colonne.</li>
	<li>Ajouter 300 µL de tampon d’élution TEV contenant 50 unités (10 µL) de l’AcTEV. Préparer le mélange dans un tube avant d’ajouter à la résine.</li>
	<li>Incuber la colonne avec des perles dans un thermomixer à 16 ° C, 350 tr/min pendant 2 h. la colonne inverser doucement plusieurs fois toutes les 30 minutes.</li>
	<li>Ouvrir la colonne, placez-le dans un nouveau tube propre 1,5 mL et un essorage à 100 × g pendant 5 min à 4 ° C à recueillir l’éluat.</li>
	<li>Sec (par exemple) 10 % (v/v) de l’échantillon éluée (~ 25 µL) dans un évaporateur centrifuge et utiliser pour la spectrométrie de masse ou autre une analyse plus approfondie.</li>
	<li>Aliquote l’éluat restant (~ 275 µL) divisé en onze centrifuger de 1,5 mL tubes (25 µL chaque), sécher dans un évaporateur centrifuge et conserver à-80 ° C.</li>
	<li>Analyse des échantillons conservés tout au long de la procédure ainsi que les éluats de norme SDS-PAGE suivie par immunoblotting. Pour la préparation de l’échantillon, précipité 50 µg de Total (T), charge (L), le débit à travers (FT), laver 1 (W1) et 200 µL de lavage 6 (W6) par chloroforme/méthanol extraction16.</li>
	<li>Ajouter 10 µL de 2 x tampon de charge de SDS-PAGE (tableau 1) pour les échantillons précipités et 25 µL de l’échantillon séché éluée. Vortex et faire bouillir pendant 10 min à 95 ° C dans un bloc chauffant.</li>
	<li>Analyse totale (T), charge (L), écoulement à travers (FT), lavage 1 (W1), laver 6 (W6) et élution (E) par immunotransfert utilisant des anticorps anti-TOC159 pour déterminer l’efficacité de la technique d’isolation.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Jarvis, P., L&#243;pez-Juez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+and+homeostasis+of+chloroplasts+and+other+plastids.">Biogenesis and homeostasis of chloroplasts and other plastids.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 787-802 (2013).</li><li>Kessler, F., Schnell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloroplast+biogenesis:+diversity+and+regulation+of+the+protein+import+apparatus.">Chloroplast biogenesis: diversity and regulation of the protein import apparatus.</a> Current opinion in cell biology. 21 (4), 494-500 (2009).</li><li>Schnell, D. 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S., Chen, M., Cerny, R., Fromm, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+tandem+affinity+purification+tag+and+methods+for+isolation+of+protein+heterocomplexes+from+plants.">Improved tandem affinity purification tag and methods for isolation of protein heterocomplexes from plants.</a> The Plant journal. 38 (1), 172-181 (2004).</li><li>Rohila, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interactions+of+tandem+affinity+purified+protein+kinases+from+rice.">Protein-protein interactions of tandem affinity purified protein kinases from rice.</a> PloS one. 4 (8), 6685 (2009).</li><li>Agne, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acidic+A-domain+of+Arabidopsis+TOC159+occurs+as+a+hyperphosphorylated+protein.">The acidic A-domain of Arabidopsis TOC159 occurs as a hyperphosphorylated protein.</a> Plant physiology. 153 (3), 1016-1030 (2010).</li><li>Wessel, D., Flugge, U. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+quantitative+recovery+of+protein+in+dilute+solution+in+the+presence+of+detergents+and+lipids.">A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids.</a> Analytical biochemistry. 138 (1), 141-143 (1984).</li></ol>

Les auteurs ne déclarent aucun intérêts opposés.

Nous avons démontré qu’une seule étape de purification de robinet tag est une méthode spécifique et efficace pour la purification de l’Arabidopsis TOC-TIC complexe. Bien que la balise de robinet permettrait aux deux étapes de purification successives (IgG-suivie de la calmoduline purification d’affinité après clivage protéase TEV), nous croyons que, dans de nombreux cas, la première étape de l’affinité suivie par protéase TEV sera suffisante. Notre objectif, TOC159, est peu abondante et l’inclusion de la deuxième étape de la calmoduline-affinité excessivement réduit le rendement de protéine qui était la principale raison pour l’exclure de notre présent protocole. Le TEV-élution en soi est une étape de purification très spécifique et douce qui sortira seulement la cible TAP-tag ainsi que de partenaires d’interaction associés tandis que contaminer les protéines coller non spécifique à la résine d’IgG y restera. Ainsi, en combinaison avec l’étape IgG-affinité, l’élution de TEV se traduit par une purification suffisamment efficace pour nos et probablement plusieurs autres fins.
Il faut que la construction de TAP-tag est pleinement fonctionnelle in vivo. TAP-tagging pourrait avoir des effets potentiellement délétères sur l’activité de la protéine, de stabilité ou de localisation. TOC159 se compose de trois domaines, le domaine acide N-terminal, la centrale du domaine liant le GTP et domaine C-terminal membrane, qui ancre TOC159 dans le de membrane externe du chloroplaste2. Pour éviter toute interférence avec l’insertion de la membrane, nous fusionnés avec la balise de robinet à l’extrémité N-terminale de TOC159. La fusion à l’extrémité N-terminale est plutôt l’exception que la règle. Beaucoup de protéines contiennent des informations de ciblage N-terminale et devrait par conséquent par étiqueté à l’extrémité C-terminale. On assure que TOC159 est fonctionnelle in vivo par complémentation du mutant ppi2 (un mutant albinos manque TOC159) avec robinet-TOC159. Le sauvetage du vert, phénotype sauvage a indiqué que TAP-TOC159 était fonctionnelle15.
Le protocole de purification servait à identifier de nouveaux partenaires d’interaction de TOC159, qui comprenait KOC1 et TIC5610,11. Au total, environ 30 protéines étaient associés avec le complexe, ce qui suggère que l’interaction nouvelle partenaires seront isolés et caractérisés dans un proche avenir. Alors que nous vous recommandons le robinet-tag pour la purification de complexe, nous tenons encore à souligner que les versions supplémentaires à celle présentée ici existent et peuvent être très utiles pour certaines applications.

Les plantes dépendent des chloroplastes pour la photosynthèse et la croissance photoautotrophique1. La grande majorité des protéines de chloroplastes est codée dans le noyau, synthétisée dans le cytosol et importée dans le chloroplaste par les complexes TIC et TOC dans l’enveloppe membranes2. Le noyau du complexe TOC est constitué du chenal menant à la protéine Toc75 et deux récepteurs GTPases Toc33 Toc1593,4,5. TOC159 est essentiel pour la biogenèse des chloroplastes et intervient dans l’accumulation massive de protéines associées à la photosynthèse,6. Le complexe des TIC se compose de la canal de conduction protéine TIC20 ainsi que TIC110 et TIC407,8. Récemment, une translocation de protéines 1MD complexe au niveau de la membrane enveloppe intérieure a été isolée et contenait des éléments inconnus9, dont a été TIC56. Récemment, nous avons isolé co TIC56 du 1 MDa complexe en utilisant le protocole de purification d’affinité TAP-TOC159. Les données indiquent un chevauchement structurels entre les complexes TOC/TIC « canonical » et le complexe 1 MDa10. Auparavant inconnue des composants tels que KOC1 sont désignés comme nouveaux partenaires d’interaction des complexes TOC et TIC à l’aide de la méthode robinet décrit ici10,11.
Ainsi, la purification de TAP-tag est une méthode efficace pour l’isolation des complexes protéiques et l’identification des partenaires qui interagissent par l’analyse par spectrométrie de masse subséquentes12. La balise de robinet se compose de deux répétitions de liaison IgG séparées d’un peptide liant la calmoduline (CBP) par un tabac etch site de clivage de protéases virus (TEV). La méthode originale, consistant en une étape de purification d’affinité IgG suivie par TEV et chromatographie d’affinité-calmoduline subséquente autorisée la purification native de grand et très pur protéines complexes13,14 . Nous avons simplifié la procédure et a démontré que les complexes de protéine contenant du TOC159 peuvent également être épurées efficacement en utilisant uniquement l’étape de purification IgG-affinité suivie par TEV élution15. Dans notre expérience, l’omission de l’étape de la calmoduline-affinité a donné lieu à des rendements plus élevés et peut-être donc convenir pour des protéines de faible abondance.
En bref, nous avons conçu le stable transgéniques a. thaliana exprimant TAP-TOC159 dans le ppi2 (toc159 KO mutant) contexte et établi comme une source fiable pour la purification des complexes TOC-TIC. Le protocole pour l’isolement du complexe TOC-TIC commence par l’homogénéisation de la matière végétale dans un tampon sans détergent. Après centrifugation, le surnageant est ignoré. La pastille contenant la fraction totale de membrane est solubilisée à l’aide d’un tampon contenant du détergent. Après une étape d’ultra-centrifugation, le surnageant contenant des complexes de TOC-TIC solubilisées est appliqué à l’IgG de résine pour la purification d’affinité. Après plusieurs étapes de lavage, élution est réalisée en utilisant un tampon contenant de protéase TEV pour cliver sélectivement en aval du domaine de liaison IgG et doucement relâchez natives complexes contenant TOC159. L’éluat TEV peut être analysé directement par Western blot ou spectrométrie de masse pour identifier les partenaires d’interaction de TOC15910,11,15. La méthode a également été utilisée pour identifier les modifications post-traductionnelles des TOC15915. À l’avenir, natives complexes contenant TOC159 peuvent être utilisés pour les études structurales à l’aide de la microscopie cryoélectronique.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:783px;" width="783">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:312px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:185px;">PanReac&#160; AppliChem</td>
			<td style="width:119px;">A0384</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Tris</td>
			<td style="width:185px;">Biosolve</td>
			<td style="width:119px;">0020092391BS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:312px;">Na2HPO4</td>
			<td style="width:185px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S7909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:312px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:185px;">PanReac&#160; AppliChem</td>
			<td style="width:119px;">A2946</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">NaCl</td>
			<td style="width:185px;">PanReac&#160; AppliChem</td>
			<td style="width:119px;">A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">NaF</td>
			<td style="width:185px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S1509</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">PMSF</td>
			<td style="width:185px;">PanReac&#160; AppliChem</td>
			<td style="width:119px;">A0999</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Plant protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:185px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P9599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Glycerol</td>
			<td style="width:185px;">PanReac&#160; AppliChem</td>
			<td style="width:119px;">A0970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Triton X100</td>
			<td style="width:185px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">10789704001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Glycine</td>
			<td style="width:185px;">PanReac&#160; AppliChem</td>
			<td style="width:119px;">A1067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">EDTA</td>
			<td style="width:185px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:119px;">8043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:185px;">PanReac&#160; AppliChem</td>
			<td style="width:119px;">A1101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">SDS</td>
			<td style="width:185px;">PanReac&#160; AppliChem</td>
			<td style="width:119px;">A0675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Bromophenol blue</td>
			<td style="width:185px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">B0126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">HCl</td>
			<td style="width:185px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">20252-290</td>
			<td>Corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Sucrose</td>
			<td style="width:185px;">PanReac&#160; AppliChem</td>
			<td style="width:119px;">A3935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:312px;">Murashige and Skoog medium with vitamins</td>
			<td style="width:185px;">Duchefa Biochemie</td>
			<td style="width:119px;">M0222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Phytoagar</td>
			<td style="width:185px;">Duchefa Biochemie</td>
			<td style="width:119px;">P1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Petri plate</td>
			<td style="width:185px;">Greiner Bio-one</td>
			<td style="width:119px;">639102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">1.5 mL microfuge tubes</td>
			<td style="width:185px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:119px;">72.706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Ethanol</td>
			<td style="width:185px;">Fisher chemical</td>
			<td style="width:119px;">E/0600DF/15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Filter paper&#160;</td>
			<td style="width:185px;">Whatman</td>
			<td style="width:119px;">10311804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Surgical tape</td>
			<td style="width:185px;">3M</td>
			<td style="width:119px;">1530-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:312px;">CNBr-Activated agarose beads (sepharose 4B)</td>
			<td style="width:185px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">17-0430-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Sintered glass filter</td>
			<td style="width:185px;">DURAN</td>
			<td style="width:119px;">2515703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Centrifuge tube 50 mL</td>
			<td style="width:185px;">TPP</td>
			<td style="width:119px;">91050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Purified immunoglobulin G (HsIgG)</td>
			<td style="width:185px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:119px;">855908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Rotating shaker</td>
			<td style="width:185px;">IKA</td>
			<td>4016000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:312px;">NaN3 (sodium azide)</td>
			<td style="width:185px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">71290</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Quick filtration material (Miracloth)</td>
			<td style="width:185px;">Merk-Millipore</td>
			<td style="width:119px;">475855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Ultracentrifube XNP-80</td>
			<td style="width:185px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">A99839</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Rotor SW 32 Ti</td>
			<td style="width:185px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">369650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Ultracentrifuge tubes</td>
			<td style="width:185px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">326823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Glass teflon homogenizer (Potter)</td>
			<td style="width:185px;">Wheaton</td>
			<td style="width:119px;">357426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Spin column (Mobicol)</td>
			<td style="width:185px;">Mo Bi Tec</td>
			<td style="width:119px;">M1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Filter 35&#181;m for spin column (Mobicol)</td>
			<td style="width:185px;">Mo Bi Tec</td>
			<td style="width:119px;">M513515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">AcTEV</td>
			<td style="width:185px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">12575-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Centrifugal evaporator (Speed Vac)</td>
			<td style="width:185px;">Eppendorf</td>
			<td>5305000100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">FBN1A(PGL35) antibody</td>
			<td style="width:185px;">AgriSera</td>
			<td>AS06 116</td>
			<td>RRID:AB_2247012</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sand, Fontainebleau</td>
			<td style="width:185px;">VWR</td>
			<td>27460.295</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

affinity purification of chloroplast translocon protein complexes using the tap tag

Biogenèse des chloroplastes nécessite l’importation de milliers de protéines codées noyau dans les plastes. L’importation de ces protéines dépend du translocon à l’extérieur (TOC) et les membranes internes des chloroplastes (TIC). Les complexes TOC et TIC sont multimériques et probablement contiennent des composants encore inconnus. L’un des principaux objectifs dans le domaine est d’établir l’inventaire complet des composants TOC et TIC. Pour l’isolement des complexes de TIC-TOC et l’identification de nouveaux composants, le récepteur préprotéines que Toc159 a été modifiée en position N-terminale par l’ajout de la balise de purification (TAP) tandem affinité aboutissant à TAP-TOC159. Le TAP-tag est conçu pour les deux étapes de purification d’affinité séquentielle (d'où « affinité tandem »). La TAP-balise utilisée dans ces études se compose d’un domaine N-terminal IgG-liaison dérivé de protéine de Staphylococcus aureus un (ProtA) suivi par un peptide liant la calmoduline (CBP). Entre ces balises deux affinité, un tabac etch clivage protéase virus (TEV) site a été inclus. Par conséquent, protéase TEV peut être utilisé pour douce élution des complexes contenant du TOC159 après la liaison d’IgG perles. Dans le protocole présenté ici, la deuxième étape de purification de la calmoduline-affinité a été omise. Le protocole de purification commence par la préparation et la solubilisation des membranes cellulaires totales. Après le traitement-détergent, les protéines de la membrane solubilisée sont incubés avec perles d’IgG pour l’immunoisolation des complexes contenant du robinet-TOC159. Liaison et un lavage, TAP-TOC159 complexes contenant sont clivés et libérés des perles d’IgG à l’aide de la protéase TEV par laquelle le domaine de liaison à IgG S. aureus est supprimé. Western Blot de l’isolé complexes contenant TOC159 peuvent être utilisés pour confirmer la présence de protéines connues ou soupçonnées, TOC et TIC. Plus important encore, les complexes contenant du TOC159 ont été utilisés avec succès pour identifier les nouveaux composants des complexes TOC et TIC par spectrométrie de masse. Le protocole que nous vous présentons potentiellement permet l’isolement efficace d’une protéine de membrane-bondissent complexe à utiliser pour l’identification des éléments encore inconnus par spectrométrie de masse.

Nous avons décrit ici un protocole pour la purification d’une protéine d’enveloppe chloroplastique TAP-tag complexe transgéniques a. thaliana plantes. Comme le montre la Figure 1A, plantes exprimant le 35S:NTAP-TOC159 construct a permis d’isoler ce complexe alors que les plantes exprimant la construction de 35S:NTAP ont été utilisés comme un contrôle. Figure 1 B indique les étapes détaillées de la purification de complexes protéiques de TAP-TOC159 suivi par spectrométrie de masse pour permettre l’identification des protéines qui interagissent. L’analyse par immunotransfert (Figure 2, côté droit) confirme que TAP-TOC159 isolé interagit avec TOC75 et TOC33 du complexe TOC. La kinase de la membrane externe de chloroplaste KOC1 connu de phosphoryler TOC159 aussi co isolé avec le complexe de TAP-TOC159 (Figure 2B, côté droit). La présence de TIC110 révèle que le complexe de TAP-TOC159 isolé contient également les composants de l’ensemble des TIC. L’anticorps FBN1A dirigé contre une protéine de plastoglobule non liée à l’import des protéines ne reconnaissait pas le complexe de TAP-TOC159 indiquant l’absence de contaminations. Dans le contrôle négatif, immunoprécipitée PAEEN protéine isole pas conjointement avec n’importe lequel des protéines TOC-TIC (Figure 2, côté gauche) et confirme la spécificité de la purification de TAP-TOC159.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58532/58532fig1.jpg"> Figure 1 . Régime de la constructions et la méthode de purification d’affinité. (A). le 35S:NTAP-TOC159 construction, encodage PAEEN-TOC159 était stablement exprimé chez Arabidopsis thaliana. Plantes de contrôle négatif exprime la construction 35S:NTAP, codant le seul robinet-tag. B. le protocole de purification d’affinité sage étape se compose de membrane d’isolement et de solubilisation, IgG d’agarose immuno-purification, lavages, le clivage de protéase TEV et élution. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58532/58532fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58532/58532fig2.jpg"> Figure 2 . Purification d’affinité en tandem de la protéine TOC159. N-terminale TOC159 TAP-tag a été purifiée de NTAP-TOC15 : plantesArabidopsis ppi2 et robinet protéine purifiée à partir de plantes WT robinet a été utilisée comme contrôle négatif. Total de protéine solubilisées des extraits (T), protéines de la membrane = fraction de charge (L), écoulement à travers (FT), premier et dernier lavage fractions (W1 et W6) et 10 % de l’éluat TEV ont été analysés par Western Blot. La membrane a été sondée avec les anticorps contre TOC159 (AT4G02510), TOC75 (AT3G46740), TOC33 (AT1G02280), KOC1 (AT4G32250), TIC110 (AT1G06950) et FBN1A (AT4G04020). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58532/58532fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Table des tampons</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Tampon de couplage</td>
			<td>NaHCO3 Ajuster au pH 8,5 ajuster le pH avec 0,1 M Na2CO3
</td>
			<td>100 mM 
			 </td>
		</tr>
<tr>
<td>Tampon de blocage</td>
			<td>Tris-HCl Ajuster le pH 8 avec HCl.</td>
			<td>100 mM 
			 </td>
		</tr>
<tr>
<td>Tampon PBS</td>
			<td>Na2HPO4 KH2PO4 NaCl KCl Ajuster le pH 7,3 avec HCl.</td>
			<td>4.3 mM 1,4 mM 137 2.7 
			 </td>
		</tr>
<tr>
<td>NaCl tampon de couplage</td>
			<td>Tampon de couplage NaCl</td>
			<td>  1 M</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 x tampon de meulage</td>
			<td>Tris-HCl, pH 7.5 avec HCl. NaCl NaF PMSF Cocktail d’inhibiteur de la protéase de plantes</td>
			<td>100 mM 200 mM 5 mM 1 mM 0,20 %</td>
		</tr>
<tr>
<td>4 x solution de solubilisation</td>
			<td>Glycérol Triton-X100</td>
			<td>40 % 3 %</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tampon A</td>
			<td>  2 x tampon de meulage 1 x tampon de meulage 4 x solution de solubilisation</td>
			<td>100 ml 50 ml 25 ml 25 %</td>
		</tr>
<tr>
<td>Élution de TEV tampon</td>
			<td>Tris-HCl, pH 8 avec HCl EDTA, pH 8 avec HCl NaCl Glycérol Triton-X100 TNT</td>
			<td>50 mM 0,5 mM 100 mM 10 % 0,75 % 1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 x chargement de SDS-PAGE tampon</td>
			<td>Tris-HCl pH 6,8 avec HCl SDS Glycérol Bleu de bromophénol TNT</td>
			<td>0,1 M 4 % 20 % 0,20 % 0,2 M</td>
		</tr>
</tbody></table>Le tableau 1. Recettes de tampon.

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Affinity Purification of Chloroplast Translocon Protein Complexes Using the TAP Tag

Nous présentons ici un protocole éprouvé et testé pour la purification des chloroplastes complexes d’importation protéiques (complexe TOC-TIC) à l’aide de la balise de robinet. Le protocole d’affinité-isolation en une seule étape peut potentiellement s’appliquer à n’importe quelle protéine et être utilisé pour identifier de nouveaux partenaires d’interaction par spectrométrie de masse.

Purification d’affinité des chloroplastes Translocon protéines Complexes à l’aide de la balise de robinet

Chloroplast biogenesis requires the import of thousands of nucleus-encoded proteins into the plastid. The import of these proteins depends on the ...

Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans le domaine du chloroplaste, par exemple, la composition des machines d’importation de protéines chloroplastes. Il est essentiel pour le verdissement et la photosynthèse et donc pour la production alimentaire sur la planète. La machine moléculaire se compose de deux complexes distincts dans le membre externe et intérieur du chloroplaste appelé TOC et TIC, mais la composition n’est pas entièrement connue.Le principal avantage de cette technique est que la purification du complexe Arabidopsis TOC/TIC peut être accomplie en une seule étape méthode de purification, la purification TAP-TOC. C’est une méthode spécifique et efficace. En général, les chercheurs nouveaux à cette méthode peuvent lutter parce qu’ils ne sont pas familiers avec l’isolement des fractions de membrane chloroplaste, détergent, solubilization, ou purification d’affinité.Après avoir préparé les plantes arabidopsis, moudre 10 grammes de semis de trois semaines dans de l’azote liquide, à l’aide d’un mortier froid et pilon avec du sable. Ajouter 20 millilitres de tampon de broyage à froid aux tissus du sol. Bien mélanger et laisser le mélange décongeler sur la glace.Ensuite, trempez deux couches de matériau de filtration rapide avec tampon de broyage. Filtrer l’homogénéité à travers les deux couches de matériau de filtration dans un tube de centrifugeuse conique de 50 millilitres. Centrifugez le filtrate à 1500 fois g en quatre degrés Celsius pendant 10 minutes et transférez le supernatant dans un tube de centrifugeuse conique frais et pré-refroidi de 50 millilitres.Répétez la centrifugation une fois de plus dans les mêmes conditions. Transférer le supernatant dans un tube d’ultracentrifugeuse froid de 38,50 millilitres et le recharger jusqu’à 35 millilitres avec tampon de broyage à froid. Utilisez une ultracentrifugeuse pour centrifuger l’échantillon à 100 000 fois g et quatre degrés Celsius pendant une heure.À l’aide d’un homogénéisateur en téflon en verre, réutilisez la pastille verte dans un tampon de broyage. Centrifugeuse à 100 000 fois g et quatre degrés Celsius pendant une heure et jeter le supernatant. Utilisez l’homogénéiseur en verre téflon pour résuspendre la pastille verte dans 18,75 millilitres d’un tampon de broyage x.Ajouter ensuite 9,375 millilitres d’un tampon de broyage x. Ajouter 9,375 millilitres de quatre x solution de solubilisation pour porter le volume final à 37,5 millilitres et incuber sur un shaker rotatif à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes. Après cela, utilisez une ultracentrifugeuse pour centrifuger l’échantillon à 100 000 fois g et quatre degrés Celsius pendant une heure.Transférer le supernatant contenant les membranes solubilisées dans un tube de centrifugeuse conique frais de 50 millilitres. Après avoir préparé la résine d’agarose IGG, transférez la résine d’agarose IGG précédemment lavée au tube conique de 50 millilitres contenant les 37,5 millilitres de membranes solubilisées. Incuber pendant la nuit sur un shaker rotatif à quatre degrés Celsius.Le lendemain, sédimenter la résine agarose IGG à 100 fois g et quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Utilisez une pipette pour enlever le surnatant. Était la résine agarose IGG dans 37,5 millilitres de tampon A et incuber sur un shaker rotatif à température ambiante pendant 10 minutes.Continuer à sédimenter et laver la résine comme indiqué dans le protocole de texte. Après cela, transférer la résine agarose IGG à une colonne de spin de 500 microlitres avec un filtre de 35 microns. Lavez les perles deux fois avec 300 microlitres de tampon d’élitution TEV pour l’équilibrage.Ensuite, ajoutez 300 microlitres de tampon d’élitution TEV contiennent 10 microlitres de protéase TEV. Incuber la colonne de spin avec des perles dans un Thermomixer à 16 degrés Celsius et 350 tours pendant deux heures. Ensuite, ouvrez la colonne de spin et placez-la dans un nouveau tube propre de 1,5 millilitre.Faites tourner ce tube à 100 fois g et quatre degrés Celsius pendant cinq minutes pour recueillir l’allongement. Dans cette étude, un complexe protéique d’enveloppe de chloroplaste tagué tap des usines transgéniques d’A.thaliana est purifié. L’analyse d’Immunoblot confirme que l’isolat TAP-TOC159 interagit avec TOC75 et TOC33 du complexe TOC.La kinase de membrane externe de chloroplaste, KOC1, qui est connue pour phosphorylate TOC159 est également co-isolée. La présence de TIC110 révèle que le complexe isolé TAP-TOC159 contient également les composants du complexe TIC. L’anticorps FBN1A n’a pas reconnu le complexe TAP-TOC159, ce qui indique l’absence de contaminations.Dans le contrôle négatif, la protéine NTAP immunoprécipitée ne s’est co-isolée avec aucune des protéines TOC, TIC et confirme la spécificité de la purification TAP-TOC159. Bien que cette méthode puisse fournir un aperçu de l’importation de protéines chloroplastes, elle peut potentiellement être appliquée à tout autre complexe dans le système de bouteilles arabidopsis thaliana. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes peuvent être appliquées, comme le ballonnement occidental ou la spectrométrie de masse, soit pour démontrer la présence de composants connus, soit pour identifier de nouveaux composants des complexes TOC et TIC.Cette technique a ouvert la voie à la recherche dans le domaine de l’importation de protéines chloroplastes afin d’explorer la fonction des nouveaux composants des complexes TOC et TIC.

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