Name: affinity purification of chloroplast translocon protein complexes using the tap tag
Uploaded: 2018-11-01T15:00:00
Duration: 7 min 1 s
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Die Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem Schweizerischen Nationalfonds (31003A_156998 und 31003A_176191) und der Universität Neuenburg.

1. Vorbereitung von Arabidopsis-Pflanzen
<ol><li>Bereiten Sie 1 L halbe Stärke Murashige und Skoog (MS) mittlere einschließlich Vitamine mit 1 % Saccharose und einstellen Sie des pH-Werts auf 5,7 mit Kalilauge (KOH). Hinzufügen von 0,8 % des Phytoagar und Autoklaven für 20 min bei 120 ° C.</li>
	<li>Gießen Sie 75 mL MS Medium pro Petri Platte (Durchmesser 14,5 cm, Höhe 3 cm) und lassen Sie die Erstarrung für 1 h.</li>
	<li>Ein 1,5 mL Microfuge Rohr 30 mg von Arabidopsis Thaliana Samen hinzu und Oberfläche Sterilisieren mit 70 % (V/V) Ethanol mit 0,05 % (V/V) Triton x-100 für 5 min, gefolgt von 100 % (V/V) Ethanol für 10 min. entfernen das Ethanol.</li>
	<li>Übertragen Sie die Samen, steriles Filterpapier zum trocknen. Streuen Sie die sterilisierten Samen gleichmäßig auf eine MS-Platte (jeder Genotyp erfordert mindestens 8 bis 10 Platten), und verschließen Sie jede Platte mit chirurgischen Klebeband.</li>
	<li>Zwei Tage in der Dunkelheit, Keimung der Samen zu synchronisieren inkubieren Sie die Platten bei 4 ° C. Transfer in eine Wachstums-Kammer mit folgenden Lichtzyklus: 8 h 120 µmol m−2 s−1 Licht und 16 h dunkel bei 22-20 ° C.</li>
</ol>2. Vorbereitung der HsIgG Agarose Korne
<ol><li>CNBr aktiviert Agarose Perlen (4 g) in 100 mL 1 mM HCl und 30 min bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>Übertragen Sie die Agarose-Perlen in einem gesinterten Glasfilter, waschen unter Vakuum mit 100 mL HCl 100 mM und 2 - 3 Mal wiederholen. Hinweis: Precool die Waschlösung bis 4 ° C.</li>
	<li>Aufschwemmen der Agarose Korne in 1 mL kalte 100 mM HCl und Übertragung auf einen konischen Zentrifugenröhrchen 50 mL. Waschen Sie der gesinterten Glasfilter mit 3 mL HCl 100 mM und übertragen Sie die Flüssigkeit auf das gleiche Rohr.</li>
	<li>Mit 400 × g für 5 min bei 4 ° C drehen Sie, und entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette zu. Hinweis: Dekantieren Sie nicht das Röhrchen.</li>
	<li>Aufschwemmen der Perlen in 50 mL Kupplung Puffer (Tabelle 1); kurz mixen Sie und dann drehen Sie sich mit 400 × g für 5 min bei 4 ° C.</li>
	<li>50 mg gefriergetrockneten Homo sapiens IgG (Hs-IgG) in 10 mL Kupplung Puffer auflösen, die Agarose Korne vorsichtig mischen und in rotary-Shaker über Nacht bei 4 ° c inkubieren</li>
	<li>Mit 400 × g für 5 min bei 4 ° C drehen Sie, und entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette zu.</li>
	<li>Waschen Sie die IgG-Agarose Korne mit 50 mL Kupplung Puffer und Spin bei 400 × g für 5 min bei 4 ° C.</li>
	<li>Aufschwemmen der IgG-Agarose-Beads mit 50 mL der blockierenden Puffer (Tabelle 1) und Spin bei 400 × g für 5 min bei 4 ° C. Einmal wiederholen.</li>
	<li>Aufzuwirbeln Sie IgG-Agarose Korne in 50 mL blockierende Puffer, drehen Sie die Mischung für 2 h bei RT und Spin bei 400 × g für 5 min bei 4 ° C.</li>
	<li>Den Überstand zu entfernen und erneut die IgG-Agarose Korne in 200 mL NaCl Kupplung Puffer (Tabelle 1).</li>
	<li>Um alle restlichen Vernetzung CNBr Gruppen zu blockieren, waschen Sie die IgG-Agarose Korne mit 100 mL 0,1 M Glycin-HCl, pH 2,8. Mit 400 × g für 5 min bei 4 ° C drehen Sie, und entfernen Sie den Überstand zu. Waschen mit 0,2 M Glycin-HCl, pH 2,8, Spin bei 400 × g für 5 min bei 4 ° C und den Überstand zu entfernen. Schließlich waschen Sie die IgG-Agarose Korne mit 200 mL Reinstwasser.</li>
	<li>Waschen Sie die IgG-Agarose Korne mit 200 mL Reinstwasser und dann 200 mL PBS-Puffer (Tabelle 1).</li>
	<li>Die IgG-Agarose Korne in 20 mL PBS-Puffer mit 0,01 % NaN3 (Natriumazid) Aufschwemmen und Lagerung bei 4 ° C.</li>
</ol>3. Isolation und Solubilisierung der Membran-Fraktion
<ol><li>Schleifen Sie 10 g drei Wochen alt A. Thaliana Sämlinge in flüssigem Stickstoff mit einem kalten Mörser und Stößel mit Sand.</li>
	<li>20 mL kaltem Puffer (Tabelle 1), 10 g Boden Gewebe Schleifen hinzufügen, gut mischen und auf dem Eis auftauen.</li>
	<li>Filtern Sie das Homogenat durch zwei Schichten von schnellen Filtermaterial in einer konischen Zentrifugenröhrchen 50mL. Genießen Sie die schnelle Filtermaterial mit Schleifen Puffer vor der Filtration.</li>
	<li>Zentrifuge das Filtrat für 10 min bei 1500 × g bei 4 ° C und Übertragung der Überstand auf eine konische gekühlte 50 mL Zentrifugenröhrchen, wiederholen Sie das gleiche noch einmal Schritt und sammeln den überstand. Eine 200 µL Probe der "totalen Bruch" zu behalten und bei-80 ° C für eine spätere Analyse gespeichert</li>
	<li>Den Überstand an kalten 38,50 mL Ultrazentrifugen Röhren übertragen und top-bis zu 35 mL mit kalten Schleifen Puffer. Zentrifuge für 1 h bei 100.000 × g bei 4 ° C in einer Ultrazentrifuge.</li>
	<li>Übertragen Sie den Überstand auf eine 50 mL konische Zentrifugenröhrchen. Behalten Sie eine 200 µL Probe der "löslichen Fraktion" und laden bei-80 ° C für eine spätere Analyse.</li>
	<li>Wieder aussetzen Sie, die grünen Pellets mit einer Glas-Teflon-Homogenisator in Schleifen Puffer. Für 1 h bei 100.000 × g bei 4 ° C in einer Ultrazentrifuge zentrifugiert und den Überstand verwerfen.</li>
	<li>Aufschwemmen der grünen Pellet in 18,75 mL 1 x Schleifen Puffer mit einer Glas-Teflon-Homogenisator und 9,375 mL 1 x Schleifen Puffer.</li>
	<li>Fügen Sie 9,375 mL 4 X solubilisation Lösung (Tabelle 1) (mit dem TX-100 Reinigungsmittel hinzu), um 37,5 mL geben und 30 min auf eine "rotierende Shaker" bei 4 ° c inkubieren</li>
	<li>Zentrifuge für 1 h bei 100.000 × g bei 4 ° C in einer Ultrazentrifuge. Übertragen Sie den Überstand auf eine 50 mL konische Zentrifugenröhrchen. Behalten Sie eine 200 µL Probe des Überstandes (künftig "Last Bruch") und Shop bei-80 ° C für eine spätere Analyse.</li>
	<li>Aufzuwirbeln Sie das Pellet in 37,5 mL Puffer Schleifen. Behalten Sie die Stichprobe von unlöslichen Teil und laden bei-80 ° C</li>
</ol>4. Immunopräzipitation
<ol><li>Equilibrate 100 µL der gepackten IgG-Agarose-Harz in Puffer A (Tabelle 1) und Spin 100 × g für 5 min bei 4 ° C.</li>
	<li>Entfernen Sie den Überstand und Aufschwemmen der IgG-Agarose-Harz in 100 µL Puffer A bei 4 ° c</li>
	<li>Die gewaschene IgG-Agarose-Harz auf 37,5 mL solubilisiert Membranen übertragen und über Nacht auf einem rotierenden Shaker in ein 50 mL konische Zentrifugenröhrchen bei 4 ° c inkubieren</li>
	<li>Sediment der IgG-Agarose Harz bei 100 × g für 5 min bei 4 ° C und den Überstand mit einer Pipette zu entfernen. Behalten Sie eine 200 µL Probe der "Durchfluss" und bei-80 ° C für eine spätere Analyse gespeichert.</li>
	<li>Waschen Sie die IgG-Agarose-Harz in 37,5 mL Puffer A und inkubieren Sie für 10 min auf einem rotierenden Shaker.</li>
	<li>Sediment der IgG-Agarose-Harz bei 100 × g für 5 min bei 4 ° C, den Überstand mit einer Pipette entfernen, hinzufügen 5 mL Puffer A 15 mL Zentrifugenröhrchen, Zentrifuge bei 100 × g, 4 ° C, 5 min. Retain Schleifen eine 200 µL Probe der "Wash 1" und bei-80 ° C lagern für die spätere Analyse.</li>
	<li>Wiederholen Sie die 5 mL Schritt dreimal mit Puffer A. Waschen</li>
	<li>Führen Sie die beiden letzten Waschen ohne Inhibitoren (NaF, Protease-Inhibitor und PMSF) Hinweis: Inhibitoren sind nicht mehr erforderlich, in diesem Stadium und ausgelassen um Kosten zu reduzieren. Behalten Sie eine 200 µL Probe des letzten Waschen Schritt "endgültige Wash (W6)" und den Shop bei-80 ° C für eine spätere Analyse.</li>
	<li>Übertragen der IgG-Agarose-Harz auf einer 500 µL Spin Spalte mit einem 35 µm-Filter und die Perlen zweimal mit 300 µL der TEV Elution Buffer (Tabelle 1) (nicht mit entwicklelt) für Gleichgewichtherstellung zu waschen. Schließen Sie die Spin-Spalte.</li>
	<li>Fügen Sie 300 µL der TEV Elution Puffer mit 50 Einheiten (10 µL) entwicklelt. Bereiten Sie die Mischung in ein Rohr vor der Zugabe in das Harz.</li>
	<li>Die Spin-Spalte mit Perlen in einem Thermomixer bei 16 ° C inkubieren, 350 u/min für 2 h Invertieren der Spalte sanft mehrmals alle 30 Minuten.</li>
	<li>Öffnen Sie die Spin-Spalte zu, legen Sie sie in eine neue saubere 1,5 mL-Tube und Spin 100 × g für 5 min bei 4 ° C, das Eluat zu sammeln.</li>
	<li>Trocknen (zum Beispiel) 10 % (V/V) der eluierten Probe (~ 25 µL) in einem zentrifugalen Verdampfer und verwenden für Massenspektrometrie oder andere weitere Analyse.</li>
	<li>Aliquoten unterteilt die restlichen Eluat (~ 275 µL) in elf 1,5 mL Zentrifuge Röhren (25 µL), in eine zentrifugale Verdampfer trocknen und Lagern bei-80 ° C.</li>
	<li>Analysieren Sie die Proben während des Verfahrens sowie die Eluate von Standard Immunoblotting SDS-PAGE folgt einbehalten. Für die Probenvorbereitung, überstürzten 50 µg von insgesamt (T), Last (L), durch (FT), fließen waschen 1 (W1) und 200 µL Wash 6 (W6) durch Chloroform/Methanol-Extraktion-16.</li>
	<li>Fügen Sie 10 µL 2 x SDS-PAGE laden Puffer (Tabelle 1) zu den ausgefällten Proben und 25 µL eluierten getrockneten Probe. Wirbel und kochen für 10 min bei 95 ° C in einem Hitze-Block.</li>
	<li>Analysieren Sie insgesamt (T), Last (L), Durchströmung (FT), Wash 1 (W1), 6 (W6) und Elution (E) durch Immunoblotting mit Anti-TOC159 Antikörper um zu bestimmen, die Effizienz des Verfahrens Isolierung zu waschen.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Jarvis, P., L&#243;pez-Juez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+and+homeostasis+of+chloroplasts+and+other+plastids.">Biogenesis and homeostasis of chloroplasts and other plastids.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 787-802 (2013).</li><li>Kessler, F., Schnell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloroplast+biogenesis:+diversity+and+regulation+of+the+protein+import+apparatus.">Chloroplast biogenesis: diversity and regulation of the protein import apparatus.</a> Current opinion in cell biology. 21 (4), 494-500 (2009).</li><li>Schnell, D. 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S., Chen, M., Cerny, R., Fromm, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+tandem+affinity+purification+tag+and+methods+for+isolation+of+protein+heterocomplexes+from+plants.">Improved tandem affinity purification tag and methods for isolation of protein heterocomplexes from plants.</a> The Plant journal. 38 (1), 172-181 (2004).</li><li>Rohila, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interactions+of+tandem+affinity+purified+protein+kinases+from+rice.">Protein-protein interactions of tandem affinity purified protein kinases from rice.</a> PloS one. 4 (8), 6685 (2009).</li><li>Agne, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acidic+A-domain+of+Arabidopsis+TOC159+occurs+as+a+hyperphosphorylated+protein.">The acidic A-domain of Arabidopsis TOC159 occurs as a hyperphosphorylated protein.</a> Plant physiology. 153 (3), 1016-1030 (2010).</li><li>Wessel, D., Flugge, U. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+quantitative+recovery+of+protein+in+dilute+solution+in+the+presence+of+detergents+and+lipids.">A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids.</a> Analytical biochemistry. 138 (1), 141-143 (1984).</li></ol>

Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt.

Wir zeigten, dass ein einzigen Schritt TAP Tag Reinigung eine konkrete und effiziente Methode zur Reinigung von Arabidopsis -TOC-TIC-Komplex. Obwohl das TAP-Tag zwei aufeinander folgende Reinigungsschritte (IgG-gefolgt von Calmodulin Affinitätsreinigung nach TEV Protease-Spaltung) erlauben würde, glauben wir, dass in vielen Fällen der erste Affinität Schritt gefolgt von TEV Protease Spaltung ausreichen werden. Unser Ziel, TOC159, ist reichlich niedrig und die Aufnahme des zweiten Schrittes Calmodulin-Affinität übermäßig vermindert die Proteinausbeute war der Hauptgrund für unsere dieses Protokolls auszuschließen. Der TEV-Elution an sich ist eine sehr spezielle und schonende Reinigungsschritt, der nur release wird das TAP-markierte Ziel zusammen mit zugehörigen Interaktionspartner während verunreinigen die Proteine unspezifisch an die IgG-Harz kleben dort bleiben wird. In Kombination mit der IgG-Affinität Schritt ergibt sich also, den TEV Elution in eine ausreichend effiziente Reinigung für unsere und wahrscheinlich viele andere Zwecke.
Vorsicht ist geboten, dass die TAP-Tags Konstrukt voll funktionsfähig in Vivo. TAP-tagging könnte potenziell schädliche Auswirkungen auf die Proteinaktivität, Stabilität oder Lokalisierung haben. TOC159 besteht aus drei Domänen, die sauren N-terminale Domäne, die zentrale GTP-bindende Domäne und C-terminalen Membran Domäne, das TOC159 in die äußere Chloroplasten Membran2Anker. Zur Vermeidung möglichen Interferenzen mit Membran einsetzen verschmolzen wir das TAP-Tag an den N-Terminus des TOC159. Fusion an den N-Terminus ist eher die Ausnahme als die Regel. Viele Proteine enthalten N-terminale gezielt Informationen und sollte daher durch am C-Terminus markiert. Wir sicher, dass TOC159 funktionelle in Vivo durch Ergänzung des ppi2 mutierten (ein Albino-Mutant TOC159 fehlt) mit TAP-TOC159. Die Rettung des grünen Wildtyp Phänotyp zufolge TAP-TOC159 funktionelle15Jahre alt war.
Die Reinigung-Protokoll wurde verwendet, um neue Interaktionspartner des TOC159, zu identifizieren, die KOC1 und TIC5610,11enthalten. Insgesamt waren rund 30 Proteine mit dem Komplex, was darauf hindeutet, dass neue Interaktion Partner werden isoliert und charakterisiert in naher Zukunft verbunden. Während das TAP-Tag für komplexe Reinigung wir empfehlen, möchten wir noch darauf hinweisen, dass weitere Versionen mit dem hier vorgestellten vorhanden und können für einige Anwendungen sehr nützlich sein.

Pflanzen hängen Chloroplasten Photosynthese und Photoautotrophe Wachstum1. Die überwiegende Mehrheit der Chloroplasten Proteine kodiert im Zellkern, in das Zytosol synthetisiert und in den Chloroplasten über TIC und TOC-komplexe in den Umschlag Membranen2importiert. Der Kern des Inhaltsverzeichnisses Komplex besteht aus Toc75 Protein-leitenden Kanal und die zwei Rezeptor GTPases Toc33 und Toc1593,4,5. TOC159 ist essentiell für die Biogenese von Chloroplasten und die massive Anhäufung von Photosynthese-assoziierte Proteine6vermittelt. Der TIC-Komplex besteht aus dem TIC20 Protein-leitenden Kanal sowie TIC110 und TIC407,8. Vor kurzem eine 1MD Protein Translokation Komplex an der inneren Umschlag Membran wurde isoliert und enthielt bislang nicht identifizierte Komponenten9, eins davon TIC56 war. Vor kurzem wurde TIC56 des Komplexes mit dem TAP-TOC159 Affinität Reinigung Protokoll 1 MDa Co isoliert. Die Daten zeigten eine strukturelle Überschneidungen zwischen den "kanonischen" TOC/TIC-komplexe und 1 MDa komplexe10. Bisher wurden unbekannte Komponenten wie KOC1 auch gekennzeichnet, wie neue Interaktionspartner der TOC und TIC-komplexe mit der TAP-Methode hier10,11beschrieben.
So ist die TAP-Tag Reinigung eine effiziente Methode für die Isolierung von Proteinkomplexen und die Identifizierung der interagierenden Partner durch nachfolgende massenspektrometrische Analyse12. Das TAP-Tag besteht aus zwei IgG Bindung Wiederholungen von ein Calmodulin-Bindung-Peptid (CBP) getrennt durch ein Tabak Ätzen (TEV) Virus-Protease-Spaltstelle. Die ursprüngliche Methode, d. h. eine IgG-Affinität Reinigung gefolgt von TEV Spaltung und anschließende Calmodulin-Affinitätschromatographie gestattet die native Reinigung von großen und hochreines Protein-komplexe13,14 . Wir haben das Verfahren vereinfacht und gezeigt, dass die TOC159-haltigen Proteinkomplexe auch effizient nutzen nur die IgG-Affinität Reinigungsschritt gefolgt von TEV-Spaltung Elution15gereinigt werden. In unserer Erfahrung der Verzicht auf die Calmodulin-Affinität Schritt führte zu höheren Erträgen sowie möglicherweise daher geeignet für niedrige Fülle Proteine.
Kurzum, wir stabile transgenen A. Thaliana entwickelt Linien mit dem Ausdruck TAP-TOC159 in der ppi2 (toc159 KO Mutant) Hintergrund und etablierte es als eine zuverlässige Quelle für die Reinigung des TOC-TIC-komplexe. Das Protokoll für die Isolierung von der TOC-TIC-Komplex beginnt mit der Homogenisierung des Pflanzenmaterials in einem Waschmittel-freie Puffer. Nach Zentrifugation wird der Überstand verworfen. Das Pellet mit der gesamten Membran-Anteil ist mit einem Reinigungsmittel-haltigen Puffer solubilisiert. Nach einer Ultra-Zentrifugationsschritt wird der Überstand mit solubilisiert TOC-TIC-komplexe auf IgG-Harz für die Affinitätsreinigung angewendet. Nach mehreren Waschschritten, Elution erfolgt mit TEV Protease-haltigen Puffer zu selektiv flussabwärts Spalten der IgG-bindende Domänen und sanft loslassen native TOC159-haltigen komplexe. TEV Eluat kann direkt durch westliche Beflecken oder Ermittlung der Interaktionspartner TOC15910,11,15-Massenspektrometrie analysiert werden. Die Methode ist auch zur post-translationalen Modifikationen des TOC15915Kennzeichnung verwendet. In Zukunft können native TOC159-haltigen komplexe für strukturelle Studien mit Cryoelectron Mikroskopie verwendet werden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:783px;" width="783">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:312px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:185px;">PanReac&#160; AppliChem</td>
			<td style="width:119px;">A0384</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Tris</td>
			<td style="width:185px;">Biosolve</td>
			<td style="width:119px;">0020092391BS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:312px;">Na2HPO4</td>
			<td style="width:185px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S7909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:312px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:185px;">PanReac&#160; AppliChem</td>
			<td style="width:119px;">A2946</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">NaCl</td>
			<td style="width:185px;">PanReac&#160; AppliChem</td>
			<td style="width:119px;">A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">NaF</td>
			<td style="width:185px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S1509</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">PMSF</td>
			<td style="width:185px;">PanReac&#160; AppliChem</td>
			<td style="width:119px;">A0999</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Plant protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:185px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P9599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Glycerol</td>
			<td style="width:185px;">PanReac&#160; AppliChem</td>
			<td style="width:119px;">A0970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Triton X100</td>
			<td style="width:185px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">10789704001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Glycine</td>
			<td style="width:185px;">PanReac&#160; AppliChem</td>
			<td style="width:119px;">A1067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">EDTA</td>
			<td style="width:185px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:119px;">8043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:185px;">PanReac&#160; AppliChem</td>
			<td style="width:119px;">A1101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">SDS</td>
			<td style="width:185px;">PanReac&#160; AppliChem</td>
			<td style="width:119px;">A0675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Bromophenol blue</td>
			<td style="width:185px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">B0126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">HCl</td>
			<td style="width:185px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">20252-290</td>
			<td>Corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Sucrose</td>
			<td style="width:185px;">PanReac&#160; AppliChem</td>
			<td style="width:119px;">A3935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:312px;">Murashige and Skoog medium with vitamins</td>
			<td style="width:185px;">Duchefa Biochemie</td>
			<td style="width:119px;">M0222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Phytoagar</td>
			<td style="width:185px;">Duchefa Biochemie</td>
			<td style="width:119px;">P1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Petri plate</td>
			<td style="width:185px;">Greiner Bio-one</td>
			<td style="width:119px;">639102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">1.5 mL microfuge tubes</td>
			<td style="width:185px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:119px;">72.706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Ethanol</td>
			<td style="width:185px;">Fisher chemical</td>
			<td style="width:119px;">E/0600DF/15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Filter paper&#160;</td>
			<td style="width:185px;">Whatman</td>
			<td style="width:119px;">10311804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Surgical tape</td>
			<td style="width:185px;">3M</td>
			<td style="width:119px;">1530-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:312px;">CNBr-Activated agarose beads (sepharose 4B)</td>
			<td style="width:185px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">17-0430-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Sintered glass filter</td>
			<td style="width:185px;">DURAN</td>
			<td style="width:119px;">2515703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Centrifuge tube 50 mL</td>
			<td style="width:185px;">TPP</td>
			<td style="width:119px;">91050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Purified immunoglobulin G (HsIgG)</td>
			<td style="width:185px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:119px;">855908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Rotating shaker</td>
			<td style="width:185px;">IKA</td>
			<td>4016000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:312px;">NaN3 (sodium azide)</td>
			<td style="width:185px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">71290</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Quick filtration material (Miracloth)</td>
			<td style="width:185px;">Merk-Millipore</td>
			<td style="width:119px;">475855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Ultracentrifube XNP-80</td>
			<td style="width:185px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">A99839</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Rotor SW 32 Ti</td>
			<td style="width:185px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">369650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Ultracentrifuge tubes</td>
			<td style="width:185px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">326823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Glass teflon homogenizer (Potter)</td>
			<td style="width:185px;">Wheaton</td>
			<td style="width:119px;">357426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Spin column (Mobicol)</td>
			<td style="width:185px;">Mo Bi Tec</td>
			<td style="width:119px;">M1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Filter 35&#181;m for spin column (Mobicol)</td>
			<td style="width:185px;">Mo Bi Tec</td>
			<td style="width:119px;">M513515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">AcTEV</td>
			<td style="width:185px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">12575-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Centrifugal evaporator (Speed Vac)</td>
			<td style="width:185px;">Eppendorf</td>
			<td>5305000100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">FBN1A(PGL35) antibody</td>
			<td style="width:185px;">AgriSera</td>
			<td>AS06 116</td>
			<td>RRID:AB_2247012</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sand, Fontainebleau</td>
			<td style="width:185px;">VWR</td>
			<td>27460.295</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

affinity purification of chloroplast translocon protein complexes using the tap tag

Chloroplasten Biogenese erfordert den Import von Tausenden von Kern-kodierten Proteine in den Plastiden. Der Import dieser Proteine hängt von der Translocon an der äußeren (TOC) und inneren (TIC) Chloroplasten Membranen. Die TOC und TIC-komplexe sind Multimeric und wahrscheinlich noch unbekannte Komponenten enthalten. Eines der wichtigsten Ziele im Feld ist, das komplette Inventar der TOC und TIC Komponenten zu etablieren. Für die Isolierung von TOC-TIC-komplexe und die Identifizierung neuer Komponenten geändert der preprotein Rezeptor TOC159 wurde N-Terminal durch die Zugabe des Tandem Affinität Reinigung (TAP) Tags was zu TAP-TOC159. Das TAP-Tag richtet sich an zwei sequentielle Affinität Reinigungsschritte (daher "Tandem-Affinität"). Das TAP-Tag verwendet in diesen Studien besteht aus einer N-terminalen IgG-bindende Domäne von Staphylococcus Aureus Protein (ProtA) gefolgt durch ein Calmodulin-Bindung-Peptid (CBP) abgeleitet. Zwischen diesen beiden Affinität-Tags, ein Tabak Ätzen Virus (TEV) Protease Spaltung Website aufgenommen wurde. Daher kann TEV Protease für sanfte Elution von TOC159-haltigen komplexe nach Bindung an IgG Perlen verwendet werden. In dem hier vorgestellten Protokoll wurde der zweite Calmodulin-Affinität Reinigungsschritt ausgelassen. Die Reinigung Protokoll beginnt mit der Vorbereitung und Solubilisierung von insgesamt Zellmembranen. Nach der Waschmittel-Behandlung werden die solubilisiert Membranproteine mit IgG-Perlen für die Immunoisolation der TAP-TOC159-haltigen komplexe inkubiert. Bei der Bindung und umfangreiche waschen sind TAP-TOC159 enthaltenden komplexe gespalten und befreit die IgG-Perlen mit der TEV-Protease, wobei der S. Aureus IgG-bindende Domäne entfernt wird. Westlichen beflecken von der isolierten TOC159-haltigen komplexe lässt sich das Vorhandensein von bekannten oder vermuteten TOC und TIC Proteinen zu bestätigen. Noch wichtiger ist, sind die TOC159-haltigen komplexe erfolgreich benutzt worden, neue Komponenten der TOC und TIC komplexe zu identifizieren durch Massenspektrometrie. Das Protokoll, das präsentieren wir potentiell ermöglicht die effiziente Isolierung Membrane-springen Protein Komplex von Massenspektrometrie zur Identifizierung von unbekannten Komponenten verwendet werden.

Wir beschrieben hier ein Protokoll für die Reinigung von einem TAP-Tags Chloroplasten Umschlag Proteinkomplex aus transgenen A. Thaliana Pflanzen. Wie in Abbildung 1Adargestellt, Pflanzen mit dem Ausdruck der 35S:NTAP-TOC159-Konstrukt wurden verwendet, um diese Anlage zu isolieren, während Pflanzen, die 35S:NTAP-Konstrukt als Kontrolle verwendet wurden. Abbildung 1 B zeigt die einzelnen Schritte von der Reinigung des TAP-TOC159-Protein-komplexe gefolgt von Massenspektrometrie ermöglicht die Identifizierung von interagierenden Proteine. Die Immunoblot Analyse (Bild 2, rechts) bestätigt, dass isolierte TAP-TOC159 mit TOC75 und TOC33 von der TOC-Komplex interagiert. Die Chloroplasten Außenmembran Kinase KOC1 bekannt, dass TOC159 auch gemeinsam mit der TAP-TOC159-Komplex (Abbildung 2B, rechts) isoliert phosphorylieren. Das Vorhandensein von TIC110 zeigt, dass der isolierte TAP-TOC159-Komplex auch die Komponenten des TIC-komplexes enthält. Der FBN1A Antikörper gegen ein Plastoglobule Protein, das in keinem Zusammenhang mit Protein Import erkannte nicht die TAP-TOC159-Anlage zeigt die Abwesenheit von Verunreinigungen. In der negativen Kontrolle Immunoprecipitated NTAP Protein nicht zusammen mit der TOC-TIC Proteine (Abbildung 2, linke Seite) isolieren und bestätigt die Spezifität der TAP-TOC159 Reinigung.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58532/58532fig1.jpg"> Abbildung 1 . Schema der Konstrukte und Affinität Reinigungsprozedur. (A). die 35S:NTAP-TOC159 Konstrukt, Codierung NTAP-TOC159 stabil war ausgedrückt in Arabidopsis Thaliana. Negativkontrolle Pflanzen ausgedrückt das 35S:NTAP Konstrukt, Kodierung der TAP-Tag allein. (B). das Schritt weisen Affinität Reinigung Protokoll besteht aus Membran Isolation und Solubilisierung, IgG Agarose Immuno-Reinigung, Waschungen, TEV Protease Spaltung und Elution. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58532/58532fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58532/58532fig2.jpg"> Abbildung 2 . Tandem-Affinitätsreinigung des Proteins TOC159. N-Terminal tippen verschlagwortet TOC159 wurde gereinigt von NTAP-TOC15:ppi2 Arabidopsis -Pflanzen und tippen Sie auf Protein von TAP: WT Pflanzen gereinigt wurde als Negativkontrolle verwendet. Gesamt Protein Extrakte (T), solubilisiert Membranproteine = Last Bruchteil (L), Durchströmung (FT), erste und letzte waschen Brüche (W1 und W6) und 10 % der TEV Eluat durch Western Blot analysiert wurden. Die Membran wurde sondiert mit Antikörpern gegen TOC159 (AT4G02510), TOC75 (AT3G46740), TOC33 (AT1G02280), KOC1 (AT4G32250), TIC110 (AT1G06950) und FBN1A (AT4G04020). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58532/58532fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Tabelle der Puffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Kupplung-Puffer</td>
			<td>Nahco33 Passen Sie auf pH 8,5 pH mit 0,1 M Na2CO3 anpassen
</td>
			<td>100 mM 
			 </td>
		</tr>
<tr>
<td>Puffer zu blockieren</td>
			<td>Tris-HCl Passen Sie auf pH 8 mit HCl.</td>
			<td>100 mM 
			 </td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS-Puffer</td>
			<td>Na2HPO4 KH2PO4 NaCl KCl Passen Sie auf pH 7.3 mit HCl.</td>
			<td>4,3 mM 1,4 mM 137 2.7 
			 </td>
		</tr>
<tr>
<td>NaCl Puffer Kupplung</td>
			<td>Kupplung-Puffer NaCl</td>
			<td>  1 M</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 x Puffer Schleifen</td>
			<td>Tris-HCl, pH 7,5 mit HCl. NaCl NaF PMSF Pflanze-Protease-Inhibitor-cocktail</td>
			<td>100 mM 200 mM 5 mM 1 mM 0,20 %</td>
		</tr>
<tr>
<td>4 x Lutensol Lösung</td>
			<td>Glycerin Triton-X100</td>
			<td>40 % 3 %</td>
		</tr>
<tr>
<td>Puffer A</td>
			<td>  2 x Puffer Schleifen 1 x Puffer Schleifen 4 x Lutensol Lösung</td>
			<td>100 ml 50 ml 25 ml 25 %</td>
		</tr>
<tr>
<td>TEV Elution Buffer</td>
			<td>Tris-HCl, pH 8 mit HCl EDTA, pH 8 mit HCl NaCl Glycerin Triton-X100 DVB-T</td>
			<td>50 mM 0,5 mM 100 mM 10 % 0,75 % 1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 x SDS-PAGE Loading Buffer</td>
			<td>Tris-HCl pH 6,8 mit HCl SDS Glycerin Bromophenol blue DVB-T</td>
			<td>0,1 M 4 % 20 % 0,20 % 0,2 M</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1. Puffer Rezepte.

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Affinity Purification of Chloroplast Translocon Protein Complexes Using the TAP Tag

Wir stellen Ihnen hier eine bewährte und getestete Protokoll für die Reinigung der Chloroplasten Import Proteinkomplexe (TOC-TIC-Komplex) mit der TAP-Tag. Das einstufige Affinität-Isolierung-Protokoll kann potenziell auf jedem Protein angewendet werden und verwendet werden, um neue Interaktionspartner identifizieren durch Massenspektrometrie.

Affinitätsreinigung der Chloroplasten Translocon Proteinkomplexe mit dem TAP-Tag

Chloroplast biogenesis requires the import of thousands of nucleus-encoded proteins into the plastid. The import of these proteins depends on the ...

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich des Chloroplasten zu beantworten, z. B. die Zusammensetzung der Chloroplasten-Protein-Importmaschinerie. Es ist wichtig für die Begrünung und Photosynthese und damit für die Nahrungsmittelproduktion auf dem Planeten. Die molekulare Maschine besteht aus zwei separaten Komplexen im äußeren und inneren Element des Chloroplasten namens TOC und TIC, aber die Zusammensetzung ist nicht vollständig bekannt.Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass die Reinigung des Arabidopsis TOC/TIC-Komplexes in einer einstufigen Reinigungsmethode, der TAP-TOC-Reinigung, erfolgen kann. Es ist eine spezifische und effiziente Methode. Im Allgemeinen können Forscher, die mit dieser Methode vertraut sind, Schwierigkeiten haben, weil sie nicht mit der Isolierung von Chloroplastenmembranfraktionen, Waschmittel, Löslichkeit oder Affinitätsreinigung vertraut sind.Nach der Zubereitung der Arabidopsis-Pflanzen, schleifen Sie 10 Gramm der drei Wochen alten Sämlinge in flüssigem Stickstoff, mit einem kalten Mörtel und Stößel mit Sand. Fügen Sie 20 Milliliter Kaltschleifpuffer in das gemahlene Gewebe. Gut mischen und die Mischung auf Eis auftauen lassen.Als nächstes zwei Schichten Schnellfiltrationsmaterial mit Schleifpuffer einweichen. Filtern Sie das Homogenat durch die beiden Schichten des Filtrationsmaterials in ein 50 Milliliter konisches Zentrifugenrohr. Zentrifugieren Sie das Filtrat bei 1,500 mal g bei vier Grad Celsius für 10 Minuten und übertragen Sie den Überstand auf ein frisches, vorgekühltes 50 Milliliter konisches Zentrifugenrohr.Wiederholen Sie die Zentrifugation noch einmal unter den gleichen Bedingungen. Übertragen Sie den Überstand auf ein kaltes 38,50 Milliliter Ultrazentrifugenrohr und verladen ihn auf 35 Milliliter mit Kaltschleifpuffer. Verwenden Sie eine Ultrazentrifuge, um die Probe eine Stunde lang bei 100, 000 mal g und vier Grad Celsius zentrifugieren zu können.Mit einem gläsernen Teflon-Homogenisator das grüne Pellet im Schleifpuffer wieder aufhängen. Zentrifuge bei 100, 000 mal g und vier Grad Celsius für eine Stunde und den Überstand entsorgen. Verwenden Sie den glasigen Teflon-Homogenisator, um das grüne Pellet in 18,75 Millilitern eines x-Schleifpuffers wieder aufzuhängen.Dann fügen Sie weitere 9,375 Milliliter eines x Schleifpuffers hinzu. Fügen Sie 9,375 Milliliter von vier x Löslichkeitslösung hinzu, um das Endvolumen auf 37,5 Milliliter zu bringen und 30 Minuten lang auf einem rotierenden Shaker bei vier Grad Celsius zu brüten. Danach verwenden Sie eine Ultrazentrifuge, um die Probe eine Stunde lang bei 100, 000 mal g und vier Grad Celsius zu zentrifugieren.Übertragen Sie den Überstand, der die löslichen Membranen enthält, auf ein frisches 50 Milliliter-Konzentrigerohr. Nach der Zubereitung des IGG-Agaroseharzes das zuvor gewaschene IGG-Agaroseharz in das 50-Milliliter-Konustube mit den 37,5 Millilitern löslicher Membranen übertragen. Inkubieren Sie über Nacht auf einem rotierenden Shaker bei vier Grad Celsius.Am nächsten Tag wird das IGG-Agaroseharz bei 100 mal g und vier Grad Celsius für fünf Minuten abgelagert. Verwenden Sie eine Pipette, um den Überstand zu entfernen. War das IGG-Agaroseharz in 37,5 Milliliter Puffer A und brütete 10 Minuten lang auf einem rotierenden Shaker bei Raumtemperatur.Setzen Sie das Sedimentieren und Waschen des Harzes fort, wie im Textprotokoll beschrieben. Danach das IGG-Agaroseharz in eine 500-Mikroliter-Spinsäule mit einem 35-Mikron-Filter übertragen. Waschen Sie die Perlen zweimal mit 300 MikroliterTEV-Elutionspuffer für den Ausgleich.Als nächstes fügen Sie 300 Mikroliter TEV-Elutionspuffer hinzu, die 10 Mikroliter TEV-Protease enthalten. Die Spinsäule mit Perlen in einem Thermomixer bei 16 Grad Celsius und 350 U/min für zwei Stunden inkubieren. Öffnen Sie dann die Spin-Säule und legen Sie sie in ein neues, sauberes 1,5-Milliliter-Rohr.Drehen Sie diese Röhre bei 100 mal g und vier Grad Celsius für fünf Minuten, um das Eluat zu sammeln. In dieser Studie wird ein TAP-markierter Chloroplasten-Hüllkurvenproteinkomplex aus transgenen A.thaliana-Pflanzen gereinigt. Die Immunoblot-Analyse bestätigt, dass isolieren TAP-TOC159 mit TOC75 und TOC33 des TOC-Komplexes interagiert.Die Chloroplasten-Außenmembrankinase KOC1, die bekanntist, um TOC159 zu phosphorylieren, ist ebenfalls koisoliert. Das Vorhandensein von TIC110 zeigt, dass der isolierte TAP-TOC159-Komplex auch die Komponenten des TIC-Komplexes enthält. Der FBN1A-Antikörper erkannte den TAP-TOC159-Komplex nicht, was auf das Fehlen von Verunreinigungen hindeutet.Bei der Negativkontrolle isolierte das immunpräzipierte NTAP-Protein keines der TOC-, TIC-Proteine und bestätigte die Spezifität der TAP-TOC159-Reinigung. Obwohl diese Methode Einblick in Chloroplasten-Protein-Import bieten kann, Kann es potenziell auf jeden anderen Komplex im Arabidopsis thaliana Flaschensystem angewendet werden. Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie Western Blotting oder Massenspektrometrie angewendet werden, um entweder das Vorhandensein bekannter Komponenten zu demonstrieren oder um neue Komponenten des TOC- und TIC-Komplexes zu identifizieren.Diese Technik ebnete den Weg für die Forschung im Bereich des Chloroplasten-Proteins, um die Funktion neuer Komponenten der TOC- und TIC-Komplexe zu erforschen.

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Biochemistry

Unit 1

Intracellular Compartments and Protein Sorting

SCIENTISTS IN ACTION

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Isolierung von Cognate RNA-Protein-Komplexe von Zellen unter Verwendung von Oligonukleotid-gerichtete Elution

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. ...

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Biochemie

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Protein Complex Affinity Capture von Cryomilled Mammalian Cells

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

Tandem Affinity Purification von Proteinkomplexen aus eukaryotischen Zellen

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Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Auflösen von Affinity Purified Protein-Komplexen von Blue native PAGE und Protein Correlation Profilieren

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Nachweis und Visualisierung von DNA-schadeninduzierten Proteinkomplexen in Suspensionszellkulturen unter Verwendung des Proximity Ligation Assays

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Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

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2 in 1: Affinitätsreinigung für die parallele Analyse von Protein-Protein und Protein-Metabolit komplexe in einem Schritt

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Vorbereitung der Chloroplasten Sub Fächer von Arabidopsis für die Analyse von Protein-Lokalisierung durch Immunoblotting oder Proteomics

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