Name: affinity purification of chloroplast translocon protein complexes using the tap tag
Uploaded: 2018-11-01T15:00:00
Duration: 7 min 1 s
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काम स्विस नेशनल साइंस फाउंडेशन (31003A_156998 और 31003A_176191) और Neuchâtel विश्वविद्यालय द्वारा अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था ।

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	<li>Jarvis, P., L&#243;pez-Juez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+and+homeostasis+of+chloroplasts+and+other+plastids.">Biogenesis and homeostasis of chloroplasts and other plastids.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 787-802 (2013).</li><li>Kessler, F., Schnell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloroplast+biogenesis:+diversity+and+regulation+of+the+protein+import+apparatus.">Chloroplast biogenesis: diversity and regulation of the protein import apparatus.</a> Current opinion in cell biology. 21 (4), 494-500 (2009).</li><li>Schnell, D. J., Kessler, F., Blobel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+components+of+the+chloroplast+protein+import+machinery.">Isolation of components of the chloroplast protein import machinery.</a> Science. 266 (5187), 1007-1012 (1994).</li><li>Kessler, F., Blobel, G., Patel, H. A., Schnell, D. 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S., Chen, M., Cerny, R., Fromm, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+tandem+affinity+purification+tag+and+methods+for+isolation+of+protein+heterocomplexes+from+plants.">Improved tandem affinity purification tag and methods for isolation of protein heterocomplexes from plants.</a> The Plant journal. 38 (1), 172-181 (2004).</li><li>Rohila, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interactions+of+tandem+affinity+purified+protein+kinases+from+rice.">Protein-protein interactions of tandem affinity purified protein kinases from rice.</a> PloS one. 4 (8), 6685 (2009).</li><li>Agne, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acidic+A-domain+of+Arabidopsis+TOC159+occurs+as+a+hyperphosphorylated+protein.">The acidic A-domain of Arabidopsis TOC159 occurs as a hyperphosphorylated protein.</a> Plant physiology. 153 (3), 1016-1030 (2010).</li><li>Wessel, D., Flugge, U. 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लेखक कोई प्रतिस्पर्धी रुचि नहीं घोषित करते हैं ।

हम प्रदर्शन किया है कि एक कदम टैग शुद्धीकरण नल Arabidopsis TOC की शुद्धि के लिए एक विशिष्ट और कुशल विधि-टिक जटिल है । हालांकि नल टैग दो क्रमिक शुद्धिकरण कदम (आईजीजी-टेव के बाद calmodulin संबध शुद्धि द्वारा पीछा-दरार) की अनुमति होगी, हम मानते है कि कई मामलों में पहले संबध कदम टेव को छेड़ो दरार के बाद पर्याप्त होगा । हमारा लक्ष्य, TOC159, कम प्रचुर मात्रा में है और दूसरा calmodulin के शामिल किए जाने-संबध कदम जरूरत से ज्यादा प्रोटीन उपज है जो यह हमारे वर्तमान प्रोटोकॉल से छोड़कर के लिए मुख्य कारण था कम । टेव-अपने आप में रेफरेंस एक अति विशिष्ट और कोमल शुद्धि कदम है कि केवल नल के साथ जुड़े संपर्क भागीदारों के साथ टैग लक्ष्य जारी करेंगे, जबकि आईजीजी राल के लिए गैर विशेष रूप से चिपके प्रोटीन दूषित वहां रह जाएगा । इस प्रकार, आईजीजी-संबध कदम के साथ संयोजन में, हमारे और शायद कई दूसरों के प्रयोजनों के लिए एक पर्याप्त कुशल शोधन में टेव रेफरेंस परिणाम ।
ध्यान रखा जाना चाहिए कि नल टैग का निर्माण vivo मेंपूरी तरह कार्यात्मक है । नल-टैगिंग संभावित प्रोटीन गतिविधि, स्थिरता या स्थानीयकरण पर बचके प्रभाव हो सकता है । TOC159 तीन डोमेन, एन टर्मिनल अंलीय डोमेन, केंद्रीय GTP-बाध्यकारी डोमेन और सी-टर्मिनल झिल्ली डोमेन, कि लंगर बाहरी chloroplast झिल्ली2में TOC159 के होते हैं । झिल्ली प्रविष्टि के साथ संभावित हस्तक्षेप से बचने के लिए, हम नल-टैग से जुड़े N-TOC159 के टर्मिनस । एन के लिए फ्यूजन-टर्मिनस नियम से अपवाद नहीं बल्कि है । कई प्रोटीन एन टर्मिनल लक्ष्यीकरण जानकारी शामिल है और इसलिए सी पर टैग द्वारा किया जाना चाहिए-टर्मिनस । हम TOC159 ppi2 उत्परिवर्ती के पूरक द्वारा vivo में कार्यात्मक है कि आश्वासन दिया (एक albino उत्परिवर्ती कमी TOC159) नल-TOC159 के साथ । हरे, जंगली प्रकार phenotype के बचाव संकेत दिया कि नल-TOC15915कार्यात्मक था ।
शुद्धि प्रोटोकॉल TOC159 के नए संपर्क भागीदारों, कि KOC1 और TIC5610,11शामिल की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । कुल में, 30 प्रोटीन के आसपास के परिसर का सुझाव है कि नए संपर्क भागीदारों अलग हो जाएगा और निकट भविष्य में विशेषता के साथ जुड़े थे । जब तक हम अत्यधिक नल-जटिल शुद्धिकरण के लिए टैग की सिफारिश, हम अभी भी कहना है कि एक यहां प्रस्तुत करने के लिए अतिरिक्त संस्करण मौजूद है और कुछ अनुप्रयोगों के लिए बहुत उपयोगी हो सकता है पसंद है ।

पौधे प्रकाश संश्लेषण और photoautotrophic वृद्धि1के लिए chloroplasts पर निर्भर करते हैं । chloroplast प्रोटीन के विशाल बहुमत नाभिक में इनकोडिंग, cytosol में संश्लेषित और लिफाफा झिल्ली2में टिक और TOC परिसरों के माध्यम से chloroplast में आयात कर रहे हैं । TOC परिसर के मुख्य Toc75 प्रोटीन का आयोजन चैनल और दो रिसेप्टर GTPases Toc33 और Toc1593,4,5शामिल हैं । TOC159 chloroplasts की उत्पत्ति के लिए आवश्यक है और प्रकाश संश्लेषण के बड़े पैमाने पर संचय-जुड़े प्रोटीन6मध्यस्थता । टिक जटिल TIC20 प्रोटीन का आयोजन चैनल के रूप में के रूप में अच्छी तरह से TIC110 और TIC407,8के होते हैं । हाल ही में, भीतरी लिफाफा झिल्ली पर एक 1MD प्रोटीन translocation परिसर अलग था और पहले अज्ञात9घटक निहित, जिनमें से एक TIC56 था । हमने हाल ही में TIC56-TOC159 संबध शुद्धिकरण प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए 1 एमडीएस परिसर का सह-पृथकीकरण कर रखा है । डेटा "विहित" TOC/टिक परिसरों और 1 एमडीए परिसर10के बीच एक संरचनात्मक ओवरलैप संकेत दिया । KOC1 के रूप में पहले से अज्ञात घटक भी TOC और टिक परिसरों के नए संवाद भागीदारों के रूप में पहचाने गए नल का उपयोग-विधि यहां वर्णित10,11।
इस प्रकार, नल टैग शुद्धि प्रोटीन परिसरों के अलगाव और बाद में जन spectrometric विश्लेषण12द्वारा बातचीत भागीदारों की पहचान के लिए एक कुशल तरीका है । टैग ठोकर दो आईजीजी बाध्यकारी एक calmodulin-बाध्यकारी पेप्टाइड (CBP) से एक तंबाकू खोदना वायरस (टेव) को छेड़ो दरार साइट से अलग दोहराता होते हैं । मूल विधि, एक आईजीजी-अपनत्व शुद्धि टेव दरार और बाद में calmodulin-संबध के बाद कदम से मिलकर क्रोमैटोग्राफी बड़े और उच्च शुद्ध प्रोटीन के मूल शुद्धि की अनुमति दी परिसर13,14 . हमने प्रक्रिया को सरलीकृत किया है और यह दर्शाया है कि TOC159-युक्त प्रोटीन कॉम्प्लेक्स को भी केवल आईजीजी-संबधी शुद्धिकरण कदम का उपयोग करके शुद्ध किया जा सकता है टेव-क्लीवेज के लिए15. हमारे अनुभव में, calmodulin की चूक-अपनत्व कदम उच्च पैदावार के परिणामस्वरूप और इसलिए कम बहुतायत प्रोटीन के लिए उपयुक्त हो सकता है ।
संक्षेप में, हम स्थिर ट्रांसजेनिक A. थालियाना नल एक्सप्रेस-TOC159 ppi2 (TOC159 KO उत्परिवर्ती) पृष्ठभूमि में इंजीनियर और यह TOC-टिक परिसरों की शुद्धि के लिए एक विश्वसनीय स्रोत के रूप में स्थापित किया । TOC के अलगाव के लिए प्रोटोकॉल-टिक जटिल एक डिटर्जेंट मुक्त बफर में संयंत्र सामग्री के homogenization के साथ शुरू होता है । केंद्रापसारक के बाद, supernatant खारिज कर दिया है । कुल झिल्ली अंश युक्त गोली एक डिटर्जेंट-बफर युक्त का उपयोग कर solubilized है । एक अल्ट्रा-केंद्रापसारक कदम के बाद, solubilized TOC युक्त supernatant-टिक परिसरों आईजीजी-समानता शुद्धि के लिए राल के लिए लागू किया जाता है । कई धुलाई कदम के बाद, रेफरेंस एक टेव को छेड़ने वाले बफर का उपयोग करके किया जाता है ताकि चुनिंदा आईजीजी-बाइंडिंग डोमेन के बहाव को सट सके और धीरे से देशी TOC159-युक्त परिसरों को रिलीज किया जा सके । टेव eluate पश्चिमी सोख्ता या मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा सीधे विश्लेषण किया जा सकता है TOC15910,11,15के संपर्क भागीदारों की पहचान । विधि भी TOC15915के बाद अनुवाद संशोधन की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया है । भविष्य में, मूल TOC159-युक्त परिसरों cryoelectron माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर संरचनात्मक अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:783px;" width="783">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:312px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:185px;">PanReac&#160; AppliChem</td>
			<td style="width:119px;">A0384</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Tris</td>
			<td style="width:185px;">Biosolve</td>
			<td style="width:119px;">0020092391BS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:312px;">Na2HPO4</td>
			<td style="width:185px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S7909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:312px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:185px;">PanReac&#160; AppliChem</td>
			<td style="width:119px;">A2946</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">NaCl</td>
			<td style="width:185px;">PanReac&#160; AppliChem</td>
			<td style="width:119px;">A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">NaF</td>
			<td style="width:185px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S1509</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">PMSF</td>
			<td style="width:185px;">PanReac&#160; AppliChem</td>
			<td style="width:119px;">A0999</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Plant protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:185px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P9599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Glycerol</td>
			<td style="width:185px;">PanReac&#160; AppliChem</td>
			<td style="width:119px;">A0970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Triton X100</td>
			<td style="width:185px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">10789704001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Glycine</td>
			<td style="width:185px;">PanReac&#160; AppliChem</td>
			<td style="width:119px;">A1067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">EDTA</td>
			<td style="width:185px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:119px;">8043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:185px;">PanReac&#160; AppliChem</td>
			<td style="width:119px;">A1101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">SDS</td>
			<td style="width:185px;">PanReac&#160; AppliChem</td>
			<td style="width:119px;">A0675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Bromophenol blue</td>
			<td style="width:185px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">B0126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">HCl</td>
			<td style="width:185px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">20252-290</td>
			<td>Corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Sucrose</td>
			<td style="width:185px;">PanReac&#160; AppliChem</td>
			<td style="width:119px;">A3935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:312px;">Murashige and Skoog medium with vitamins</td>
			<td style="width:185px;">Duchefa Biochemie</td>
			<td style="width:119px;">M0222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Phytoagar</td>
			<td style="width:185px;">Duchefa Biochemie</td>
			<td style="width:119px;">P1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Petri plate</td>
			<td style="width:185px;">Greiner Bio-one</td>
			<td style="width:119px;">639102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">1.5 mL microfuge tubes</td>
			<td style="width:185px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:119px;">72.706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Ethanol</td>
			<td style="width:185px;">Fisher chemical</td>
			<td style="width:119px;">E/0600DF/15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Filter paper&#160;</td>
			<td style="width:185px;">Whatman</td>
			<td style="width:119px;">10311804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Surgical tape</td>
			<td style="width:185px;">3M</td>
			<td style="width:119px;">1530-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:312px;">CNBr-Activated agarose beads (sepharose 4B)</td>
			<td style="width:185px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">17-0430-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Sintered glass filter</td>
			<td style="width:185px;">DURAN</td>
			<td style="width:119px;">2515703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Centrifuge tube 50 mL</td>
			<td style="width:185px;">TPP</td>
			<td style="width:119px;">91050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Purified immunoglobulin G (HsIgG)</td>
			<td style="width:185px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:119px;">855908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Rotating shaker</td>
			<td style="width:185px;">IKA</td>
			<td>4016000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:312px;">NaN3 (sodium azide)</td>
			<td style="width:185px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">71290</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Quick filtration material (Miracloth)</td>
			<td style="width:185px;">Merk-Millipore</td>
			<td style="width:119px;">475855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Ultracentrifube XNP-80</td>
			<td style="width:185px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">A99839</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Rotor SW 32 Ti</td>
			<td style="width:185px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">369650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Ultracentrifuge tubes</td>
			<td style="width:185px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">326823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Glass teflon homogenizer (Potter)</td>
			<td style="width:185px;">Wheaton</td>
			<td style="width:119px;">357426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Spin column (Mobicol)</td>
			<td style="width:185px;">Mo Bi Tec</td>
			<td style="width:119px;">M1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Filter 35&#181;m for spin column (Mobicol)</td>
			<td style="width:185px;">Mo Bi Tec</td>
			<td style="width:119px;">M513515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">AcTEV</td>
			<td style="width:185px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">12575-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Centrifugal evaporator (Speed Vac)</td>
			<td style="width:185px;">Eppendorf</td>
			<td>5305000100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">FBN1A(PGL35) antibody</td>
			<td style="width:185px;">AgriSera</td>
			<td>AS06 116</td>
			<td>RRID:AB_2247012</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sand, Fontainebleau</td>
			<td style="width:185px;">VWR</td>
			<td>27460.295</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

affinity purification of chloroplast translocon protein complexes using the tap tag

Chloroplast उत्पत्ति नाभिक के हजारों plastid में इनकोडिंग प्रोटीन के आयात की आवश्यकता है । इन प्रोटीन का आयात बाहरी (TOC) और भीतरी (टिक) chloroplast झिल्ली पर translocon पर निर्भर करता है । TOC और टिक परिसरों multimeric और शायद अभी तक अज्ञात घटक होते हैं । क्षेत्र में मुख्य लक्ष्यों में से एक TOC और टिक घटकों की पूरी सूची स्थापित करने के लिए है । TOC के अलगाव के लिए-टिक परिसरों और नए घटकों की पहचान के लिए, प्रोटीन रिसेप्टर TOC159 के साथ मिलकर समानता शुद्धि (ठोकर) टैग नल TOC159 में जिसके परिणामस्वरूप के अलावा द्वारा एन-टर्मिनली संशोधित किया गया है । नल-टैग दो अनुक्रमिक संबध शुद्धि चरणों के लिए डिज़ाइन किया गया है (इसलिए "मिलकर संबध") । नल-टैग इन अध्ययनों में प्रयुक्त एक N-टर्मिनल आईजीजी-बाध्यकारी डोमेन Staphylococcus aureus प्रोटीन ए (ProtA) से व्युत्पंन एक calmodulin-बाध्यकारी पेप्टाइड (CBP) के बाद होते हैं । इन दो अपनत्व टैग के बीच, एक तंबाकू खोदना वायरस (टेव) को छेड़ो दरार साइट शामिल किया गया है । इसलिए टेव को आईजीजी मोतियों से बाँधने के बाद TOC159-युक्त कॉम्प्लेक्सों के कोमल रेफरेंस के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल में द्वितीय Calmodulin-संबधी शुद्धिकरण चरण का लोप किया गया. शुद्धि प्रोटोकॉल की तैयारी और कुल सेलुलर झिल्ली के solubilization के साथ शुरू होता है । डिटर्जेंट-उपचार के बाद, solubilized झिल्ली प्रोटीन नल-TOC159 युक्त परिसरों के immunoisolation के लिए आईजीजी मोतियों के साथ मशीन हैं । बाध्यकारी और व्यापक धुलाई पर, नल-परिसरों युक्त TOC159 और आईजीजी मोतियों से जारी टेव को छेड़ने जिससे एस. aureus आईजीजी-बाइंडिंग डोमेन हटा दिया जाता है । पृथक TOC159-युक्त परिसरों के पश्चिमी सोख्ता ज्ञात या संदिग्ध TOC और टिक प्रोटीन की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इससे भी महत्वपूर्ण बात, TOC159 युक्त परिसरों सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है TOC और जन स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा टिक परिसरों के नए घटकों की पहचान । प्रोटोकॉल है कि हम वर्तमान संभावित किसी भी झिल्ली के कुशल अलगाव-बाध्य प्रोटीन जटिल मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा अभी तक अज्ञात घटकों की पहचान के लिए इस्तेमाल किया जा अनुमति देता है ।

हम यहां ट्रांसजेनिक a. थालियाना संयंत्रों से एक नल टैग chloroplast लिफाफा प्रोटीन परिसर की शुद्धि के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया । के रूप में चित्रा 1एमें दिखाया गया है, पौधों 35S: ंतप-TOC159 के निर्माण के लिए इस परिसर को अलग करते थे, जबकि पौधों 35S: ंतप निर्माण एक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया व्यक्त किया गया । चित्रा 1 बी नल की शुद्धि के विस्तृत कदम से पता चलता है-TOC159 प्रोटीन परिसरों मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा पीछा करने के लिए बातचीत प्रोटीन की पहचान की अनुमति । immunoblot विश्लेषण (चित्रा 2, दाईं ओर) की पुष्टि करता है कि पृथक नल-TOC159 TOC75 और TOC परिसर के TOC33 के साथ सूचना का आदान प्रदान । chloroplast बाहरी झिल्ली कळेनासे KOC1 ज्ञात करने के लिए phosphorylate TOC159 भी सह नल के साथ अलग-TOC159 परिसर (चित्रा 2बी, दाईं ओर) । TIC110 की उपस्थिति से पता चलता है कि अलग नल-TOC159 जटिल भी टिक परिसर के घटकों में शामिल हैं । प्रोटीन आयात करने के लिए एक plastoglobule प्रोटीन असंबंधित के खिलाफ उठाया FBN1A एंटीबॉडी नल-TOC159 परिसर में संक्रमण के अभाव का संकेत नहीं पहचानता था । नकारात्मक नियंत्रण में, immunoprecipitated ंतप प्रोटीन सह नहीं था TOC के किसी के साथ अलग-टिक प्रोटीन (चित्रा 2, वाम पक्ष) और नल की विशिष्टता-TOC159 शुद्धि की पुष्टि ।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58532/58532fig1.jpg"> चित्रा 1 . योजना का निर्माण एवं संबध शुद्धिकरण कार्यविधि । (क). 35S: ंतप-TOC159 का निर्माण, एंकोडिंग ंतप-TOC159 Arabidopsis थालियाना मेंछुरा व्यक्त किया गया था । नकारात्मक नियंत्रण संयंत्रों 35S व्यक्त: ंतप निर्माण, नल-अकेले टैग एंकोडिंग । (ख). चरण वार संबध शुद्धिकरण प्रोटोकॉल झिल्ली अलगाव और solubilization के होते हैं, आईजीजी agarose इंयूनो-शुद्धि, बहाकर, टेव को छेड़ो दरार और रेफरेंस । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58532/58532fig1large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58532/58532fig2.jpg"> चित्रा 2 . TOC159 प्रोटीन के साथ मिलकर समानता शुद्धि । N-टर्मिनली नल-टैग की गईं TOC159 ंतप-TOC15:ppi2 Arabidopsis पौधों और नल से शुद्ध प्रोटीन का दोहन से शुद्ध किया गया था: WT पौधों एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था । कुल प्रोटीन अर्क (टी), solubilized झिल्ली प्रोटीन = लोड अंश (एल), (फुट) के माध्यम से प्रवाह, पहला और आखिरी वॉश अंशों (W1 और W6) और टेव eluate के 10% पश्चिमी सोख्ता द्वारा विश्लेषण किया गया । झिल्ली TOC159 (AT4G02510), TOC75 (AT3G46740), TOC33 (AT1G02280), KOC1 (AT4G32250), TIC110 (AT1G06950), और FBN1A (AT4G04020) के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ जांच की थी । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58532/58532fig2large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>बफ़र्स की तालिका</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>युग्मन बफर</td>
			<td>NaHCO३ समायोजित करने के लिए पीएच ८.५ ०.१ एम ना2सह3 के साथ पीएच समायोजित
</td>
			<td>१०० एमएम 
			 </td>
		</tr>
<tr>
<td>बफ़र ब्लॉक कर रहा है</td>
			<td>Tris – एचसीएल एचसीएल के साथ पीएच 8 को एडजस्ट करें ।</td>
			<td>१०० एमएम 
			 </td>
		</tr>
<tr>
<td>पंजाबियों बफर</td>
			<td>ना2HPO4 KH२PO4 Nacl KCl एचसीएल के साथ पीएच ७.३ को एडजस्ट करें ।</td>
			<td>४.३ एमएम १.४ एमएम १३७ २.७ 
			 </td>
		</tr>
<tr>
<td>NaCl युग्मन बफर</td>
			<td>युग्मन बफर Nacl</td>
			<td>  1 मीटर</td>
		</tr>
<tr>
<td>2x पीस बफर</td>
			<td>Tris-एचसीएल, एचसीएल के साथ पीएच ७.५ । Nacl NaF PMSF संयंत्र को छेड़ो अवरोधक कॉकटेल</td>
			<td>१०० एमएम २०० एमएम 5 मिमी 1 मिमी ०.२०%</td>
		</tr>
<tr>
<td>4x solubilisation समाधान</td>
			<td>ग्लिसरॉल ट्राइटन-X100</td>
			<td>४०% 3</td>
		</tr>
<tr>
<td>बफ़र A</td>
			<td>  2x पीस बफर 1x पीस बफर 4x solubilisation समाधान</td>
			<td>१०० एमएल ५० एमएल 25 मिलीलीटर 25</td>
		</tr>
<tr>
<td>टेव रेफरेंस बफर</td>
			<td>Tris-एचसीएल, एचसीएल के साथ पीएच 8 EDTA, एचसीएल के साथ पीएच 8 Nacl ग्लिसरॉल ट्राइटन-X100 डीटीटी</td>
			<td>50mm ०.५ एमएम १०० एमएम 10 ०.७५% 1 मिमी</td>
		</tr>
<tr>
<td>2x एसडीएस-पृष्ठ लोड हो रहा है बफर</td>
			<td>एचसीएल के साथ Tris-एचसीएल का पीएच ६.८ Sds ग्लिसरॉल Bromophenol नीला डीटीटी</td>
			<td>०.१ मीटर 4 20 ०.२०% ०.२ मीटर</td>
		</tr>
</tbody></table>तालिका 1. बफर व्यंजनों ।

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Affinity Purification of Chloroplast Translocon Protein Complexes Using the TAP Tag

हम यहां chloroplast प्रोटीन आयात परिसरों की शुद्धि के लिए एक सिद्ध और परीक्षण प्रोटोकॉल वर्तमान (TOC-टिक जटिल) नल-टैग का उपयोग कर । एक कदम संबध-अलगाव प्रोटोकॉल संभावित रूप से किसी भी प्रोटीन के लिए लागू किया जा सकता है और जन स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा नए संवाद भागीदारों की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा ।

टैग नल का उपयोग कर Chloroplast Translocon प्रोटीन परिसरों का अपनत्व शुद्धिकरण

Chloroplast biogenesis requires the import of thousands of nucleus-encoded proteins into the plastid. The import of these proteins depends on the ...

यह विधि क्लोरोप्लास्ट क्षेत्र में महत्वपूर्ण सवालों के जवाब देने में मदद कर सकती है, उदाहरण के लिए, क्लोरोप्लास्ट प्रोटीन आयात मशीनरी की संरचना। यह हरियाली और प्रकाश संश्लेषण के लिए आवश्यक है और इसलिए ग्रह पर खाद्य उत्पादन के लिए । आणविक मशीन में क्लोरोप्लास्ट के बाहरी और भीतरी सदस्य में दो अलग-अलग परिसर होते हैं जिन्हें टोप्लास्ट और TIC कहा जाता है, लेकिन संरचना पूरी तरह से ज्ञात नहीं है।इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि अरबीडोप्सिस TOC/TIC परिसर की शुद्धि एक कदम शुद्धिकरण विधि, नल-TOC शुद्धिकरण में पूरा किया जा सकता है। यह एक विशिष्ट और कुशल विधि है। आम तौर पर, इस विधि के लिए नए शोधकर्ताओं संघर्ष कर सकते हैं क्योंकि वे क्लोरोप्लास्ट झिल्ली अंश, डिटर्जेंट, घुलनशीलता, या आत्मीयता शुद्धिकरण के अलगाव से परिचित नहीं हैं।अरबीडोप्सिस पौधों को तैयार करने के बाद, रेत के साथ ठंडे मोर्टार और मूसल का उपयोग करके, तरल नाइट्रोजन में तीन सप्ताह पुराने रोपण के 10 ग्राम पीसें। जमीन के ऊतकों में 20 मिलीलीटर कोल्ड पीसने वाले बफर जोड़ें। अच्छी तरह मिलाएं और मिश्रण को बर्फ पर पिघला दें।इसके बाद, बफर पीसने के साथ त्वरित निस्पंदन सामग्री की दो परतों को भिगो दें। एक 50 मिलीलीटर शंकुकेंद्रितीय अपकेंद्रित्र ट्यूब में छानने का काम सामग्री की दो परतों के माध्यम से समरूप फिल्टर करें। 10 मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस में 1, 500 बार जी पर फिल्ट्रेट अपकेंद्रित्र और एक ताजा, पूर्व ठंडा शंकुधारी अपकेंद्रित्र ट्यूब के लिए supernatant हस्तांतरण।अपकेंद्री को एक बार और एक ही स्थितियों पर दोहराएं। सुपरनेट को ठंडे 38.50 मिलीलीटर अल्ट्रासेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें और इसे ठंड पीसने वाले बफर के साथ 35 मिलीलीटर तक ऊपर करें। एक घंटे के लिए 100, 000 बार जी और चार डिग्री सेल्सियस पर नमूना अपकेंद्रित्र करने के लिए एक अल्ट्रासेंट्रफ्यूज का उपयोग करें।ग्लास टेफ्लॉन होमोजेनाइजर का उपयोग करके, हरी गोली को पीसने वाले बफर में फिर से खर्च करें। एक घंटे के लिए 100, 000 बार जी और चार डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रलाइज करें और सुपरनेट को त्याग दें। एक एक्स पीस बफर के 18.75 मिलीलीटर में हरे रंग की गोली को फिर से खर्च करने के लिए ग्लास टेफ्लॉन होमोजेनाइजर का उपयोग करें।फिर एक एक्स पीस बफर के एक और 9.375 मिलीलीटर जोड़ें। 37.5 मिलीलीटर के लिए अंतिम मात्रा लाने के लिए चार एक्स घुलनशीलता समाधान के 9.375 मिलीलीटर जोड़ें और 30 मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर एक घूर्णन शेखर पर इनक्यूबेट करें। इसके बाद, एक घंटे के लिए 100, 000 बार जी और चार डिग्री सेल्सियस पर नमूना अपकेंद्रित्र करने के लिए एक अल्ट्रासेंट्रफ्यूज का उपयोग करें।घुलनशील झिल्ली वाले सुपरनेटेंट को एक ताजा 50 मिलीलीटर शंकुकीय अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरित करें। IGG agarose राल तैयार करने के बाद, पहले धोया IGG agarose राल 50 मिलीलीटर शंकु नली में स्थानांतरित करने के लिए 37.5 मिलीलीटर घुलनशील झिल्ली युक्त। चार डिग्री सेल्सियस पर एक घूर्णन शेखर पर रात में इनक्यूबेट ।अगले दिन, तलछट आईजीजी एगरेज राल १०० बार जी और पांच मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर उठी । सुपरनेट को हटाने के लिए पिपेट का इस्तेमाल करें। क्या IGG ने 37.5 मिलीलीटर बफर ए में राल को उगाया और 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर घूर्णन शेखर पर इनक्यूबेट किया।पाठ प्रोटोकॉल में उल्लिखित राल को तलछट जारी रखें और धोएं। इसके बाद, IGG agarose राल को 35 माइक्रोन फिल्टर के साथ 500 माइक्रोलीटर स्पिन कॉलम में स्थानांतरित करें। मोतियों को दो बार तेव के 300 माइक्रोलीटर के साथ धोएं।इसके बाद, तेव एल्यूशन बफर के 300 माइक्रोलीटर जोड़ें जिसमें तेव प्रोटीज़ के 10 माइक्रोलीटर होते हैं। एक थर्मोमिक्सर में मोतियों के साथ स्पिन कॉलम को 16 डिग्री सेल्सियस और ३५० आरपीएम में दो घंटे के लिए इनक्यूबेट करें । फिर, स्पिन कॉलम खोलें और इसे एक नए, साफ, 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में रखें।एल्यूएट को इकट्ठा करने के लिए इस ट्यूब को 100 बार जी और चार डिग्री सेल्सियस पर पांच मिनट के लिए स्पिन करें। इस अध्ययन में ट्रांसजेनिक ए थैलियाना पौधों से एक टैप टैग क्लोरोप्लास्ट लिफाफा प्रोटीन कॉम्प्लेक्स शुद्ध है। इम्यूनोब्लॉट विश्लेषण इस बात की पुष्टि करता है कि टैप-TOC159 को अलग करना TOC75 और TOC 33 के साथ टोसी कॉम्प्लेक्स के साथ बातचीत करता है।क्लोरोप्लास्ट बाहरी झिल्ली काइनेज, KOC1, जिसे फॉस्फोरिलेट TOC159 के लिए जाना जाता है, भी सह-अलग है। TIC110 की उपस्थिति से पता चलता है कि अलग-थलग टैप-TOC159 परिसर में टिक कॉम्प्लेक्स के घटक भी शामिल हैं। FBN1A एंटीबॉडी ने टैप-TOC159 परिसर को नहीं पहचाना, जो संदूषणों के अभाव का संकेत है ।नकारात्मक नियंत्रण में, इम्यूनोप्रिपिशेटेड एनटीपी प्रोटीन ने किसी भी TOC, TIC प्रोटीन के साथ सह-अलग नहीं किया और टैप-TOC159 शुद्धि की विशिष्टता की पुष्टि करता है। हालांकि यह विधि क्लोरोप्लास्ट प्रोटीन आयात में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकती है, लेकिन इसे संभवतः अरबीडोप्सिस थैलियाना बोतल प्रणाली में किसी अन्य परिसर में लागू किया जा सकता है। इस प्रक्रिया के बाद, अन्य तरीकों को पश्चिमी ब्लॉटिंग या मास स्पेक्ट्रोमेट्री जैसे लागू किया जा सकता है ताकि या तो ज्ञात घटकों की उपस्थिति प्रदर्शित की जा सके या टीओसी और TIC परिसरों के नए घटकों की पहचान की जा सके।इस तकनीक ने सीओसी और TIC परिसरों के नए घटकों के कार्य का पता लगाने के लिए क्लोरोप्लास्ट प्रोटीन आयात क्षेत्र में अनुसंधान का मार्ग प्रशस्त किया।

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Isolation of Cognate RNA-protein Complexes from Cells Using Oligonucleotide-directed Elution

Oligonucleotide निर्देशित क्षालन का उपयोग कोशिकाओं से आत्मीय आरएनए प्रोटीन परिसरों का अलगाव

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. ...

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Cryomilled स्तनधारी कोशिकाओं से प्रोटीन जटिल संबंध कब्जा

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Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

कोशिकाओं से मिलकर प्रोटीन परिसरों की आत्मीयता शुद्धि

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Identification of Plant Ice-binding Proteins Through Assessment of Ice-recrystallization Inhibition and Isolation Using Ice-affinity Purification

संयंत्र आइस recrystallization निषेध और अलगाव के मूल्यांकन के माध्यम से बर्फ बाध्यकारी प्रोटीन आइस आत्मीयता शोधन का उपयोग करते हुए की पहचान

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Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

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Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

निलंबन सेल संस्कृतियों में डीएनए नुकसान-प्रेरित प्रोटीन परिसरों का पता लगाने और विज़ुअलाइज़ेशन निकटता के बंधन परख का उपयोग करना

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

एसडीएस-पृष्ठ के साथ एक फॉस्फेट-बाइंडिंग टैग का उपयोग करके LRRK2 गतिविधि द्वारा फास्फारिलीकरण डिटेक्शन Rab10

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 में 1: प्रोटीन और प्रोटीन-Metabolite परिसरों के समानांतर विश्लेषण के लिए एक कदम संबध शुद्धि

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Preparation of Chloroplast Sub-compartments from Arabidopsis for the Analysis of Protein Localization by Immunoblotting or Proteomics

Immunoblotting या प्रोटियोमिक् द्वारा प्रोटीन स्थानीयकरण के विश्लेषण के लिए Arabidopsis से Chloroplast उप-डिब्बों की तैयारी

Chloroplasts are major components of plant cells. Such plastids fulfill many crucial functions, such as assimilation of carbon, sulfur and nitrogen as ...