Name: affinity purification of chloroplast translocon protein complexes using the tap tag
Uploaded: 2018-11-01T15:00:00
Duration: 7 min 1 s
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Il lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni da parte della Swiss National Science Foundation (31003A_156998 e 31003A_176191) e l'Università di Neuchâtel.

1. preparazione di piante di Arabidopsis
<ol><li>Preparare 1 L di mezza forza di Murashige e Skoog (MS) medie comprese vitamine con 1% di saccarosio e regolare il pH a 5,7 con idrossido di potassio (KOH). Aggiungere 0,8% di phytoagar e autoclave per 20 min a 120 ° C.</li>
	<li>Versare 75 mL di mezzo di MS per piastra di Petri (diametro 14,5 cm, altezza 3 cm) e consentire la solidificazione per 1 h.</li>
	<li>Aggiungere un tubo microfuge 1,5 mL, 30 mg di semi di Arabidopsis thaliana e superficie sterilizzare con etanolo al 70% (v/v) contenente 0,05% (v/v) X-100 Triton per 5 min, seguita da 100% (v/v) etanolo per 10 min. rimuovere l'etanolo.</li>
	<li>Trasferire i semi in carta da filtro sterile per l'essiccazione. Cospargere i semi sterilizzati in modo uniforme su una piastra di MS (ciascun genotipo richiede almeno 8-10 piastre) e ogni piatto con nastro chirurgico della guarnizione.</li>
	<li>Incubare le piastre a 4 ° C per due giorni al buio per sincronizzare la germinazione del seme. Trasferimento a una camera di crescita con il seguente ciclo di luce: 8 h di 120 µmol m− 2 s− 1 luce e 16 h di dark 22-20 ° c.</li>
</ol>2. preparazione di agarosio HsIgG perle
<ol><li>Sospendere CNBr-attivato dell'agarosi branelli (4 g) in 100 mL di HCl 1 mM ed incubare per 30 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Trasferire le perline di agarosio in un filtro di vetro sinterizzato, lavare sotto vuoto con 100 mL di HCl 100 mM e ripetere 2 - 3 volte. Nota: Preraffreddare la soluzione di lavaggio a 4 ° C.</li>
	<li>Risospendere il perline di agarosio in 1 mL di freddo 100 mM HCl e trasferirlo in una provetta conica per centrifuga da 50 mL. Lavare il filtro di vetro sinterizzato con 3 mL di HCl 100 mM e trasferire il liquido nella provetta stessa.</li>
	<li>Spin a 400 × g per 5 min a 4 ° C e rimuovere il surnatante con una pipetta. Nota: Non far decantare il tubo.</li>
	<li>Risospendere le sfere in 50 mL di tampone di accoppiamento (tabella 1); mescolare brevemente e poi girare a 400 × g per 5 min a 4 ° C.</li>
	<li>Sciogliere 50 mg di liofilizzato Homo sapiens IgG (Hs-IgG) in 10 mL di tampone per l'accoppiamento, mescolare delicatamente le perline di agarosio e incubare in agitatore rotativo durante la notte a 4 ° C.</li>
	<li>Spin a 400 × g per 5 min a 4 ° C e rimuovere il surnatante con una pipetta.</li>
	<li>Lavare le perle di IgG-agarosio con 50 mL di accoppiamento buffer e spin a 400 × g per 5 min a 4 ° C.</li>
	<li>Risospendere le perline di IgG-agarosio con 50 mL di tampone bloccante (tabella 1) e spin a 400 × g per 5 min a 4 ° C. Ripetere una volta.</li>
	<li>Risospendere IgG-agarosi branelli in 50 mL di tampone bloccante, ruotare la miscela per 2 h a RT e spin a 400 × g per 5 min a 4 ° C.</li>
	<li>Rimuovere il supernatante e risospendere le perline di IgG-agarosio in 200 mL di tampone di accoppiamento di NaCl (tabella 1).</li>
	<li>Per bloccare gruppi rimanenti cross-linking CNBr, lavare le perle di IgG-agarosio con 100 mL di HCl-glicina di 0,1 M, pH 2.8. Spin a 400 × g per 5 min a 4 ° C e rimuovere il surnatante. Lavare con 0,2 M glicina-HCl, pH 2.8, spin a 400 × g per 5 min a 4 ° C ed eliminare il surnatante. Infine, lavare le perle di IgG-agarosio con 200 mL di acqua ultrapura.</li>
	<li>Lavare le perle di IgG-agarosio con 200 mL di acqua ultrapura e poi 200 mL di tampone PBS (tabella 1).</li>
	<li>Risospendere le perline di IgG-agarosio in 20 mL di tampone PBS con 0,01% di NaN3 (sodio azide) e conservare a 4 ° C.</li>
</ol>3. isolamento e solubilizzazione della frazione della membrana
<ol><li>10 g di piantine di a. thaliana vecchio di tre settimane in azoto liquido utilizzando un freddo mortaio e pestello con sabbia di frantumazione.</li>
	<li>Aggiungere 20 mL di freddo macinazione buffer (tabella 1) per 10 g di tessuto terra, mescolare bene e scongelare su ghiaccio.</li>
	<li>Filtrare l'omogenato attraverso due strati di materiale di filtrazione rapida in una provetta conica per centrifuga da 50mL. Immergere il materiale di filtrazione rapida con rettifica buffer prima della filtrazione.</li>
	<li>Centrifugare il filtrato per 10 min 1.500 × g a 4 ° C e trasferimento del surnatante in una provetta conica per centrifuga refrigerata 50 mL, ripetere lo stesso passo ancora una volta e raccogliere il surnatante. Conservare un campione di 200 µ l della frazione"totale" e conservare a-80 ° C per un'analisi successiva</li>
	<li>Trasferire il surnatante in freddo mL 38,50 ultracentrifuga provette e superiore a 35 mL con buffer di rettifica fredda. Centrifugare per 1 h a 100.000 × g a 4 ° C in un'ultracentrifuga.</li>
	<li>Trasferire il surnatante in una provetta conica per centrifuga da 50 mL. Mantenere un 200 µ l di campione del "frazione solubile" e conservare a-80 ° C per un'analisi successiva.</li>
	<li>Risospendere il pellet verde utilizzando un omogeneizzatore del teflon di vetro, nel buffer di macinazione. Centrifugare per 1 h a 100.000 × g a 4 ° C in un'ultracentrifuga e scartare il surnatante.</li>
	<li>Risospendere il pellet verde in 18,75 mL di 1x Buffer utilizzando un omogeneizzatore di teflon vetro di macinazione e aggiungere 9,375 mL di 1x buffer di macinazione.</li>
	<li>Aggiungere 9,375 mL di soluzione di x solubilisation 4 (tabella 1) (contenente il detergente TX-100) per dare 37,5 mL e incubare per 30 min in un "agitatore rotante" a 4 ° C.</li>
	<li>Centrifugare per 1 h a 100.000 × g a 4 ° C in un'ultracentrifuga. Trasferire il surnatante in una provetta conica per centrifuga da 50 mL. Conservare un campione di 200 µ l del surnatante (futuro "frazione di carico") e conservare a-80 ° C per un'analisi successiva.</li>
	<li>Risospendere il pellet in 37,5 mL di tampone di macinazione. Mantenere il campione da parte insolubile e conservare a-80 ° C</li>
</ol>4. immunoprecipitazione
<ol><li>Equilibrare 100 µ l di pranzo resina IgG-agarosio in tampone A (tabella 1) e spin a 100 × g per 5 min a 4 ° C.</li>
	<li>Rimuovere il supernatante e risospendere la resina di IgG-agarosio in 100 µ l di tampone A 4 ° c.</li>
	<li>Trasferire la resina di IgG-agarosio lavata i 37,5 mL di membrane solubilizzate e incubare per una notte su un agitatore rotante in un tubo di centrifuga a fondo conico da 50 mL a 4 ° C.</li>
	<li>Sedimento l'IgG-agarosio in resina a 100 × g per 5 min a 4 ° C e rimuovere il surnatante con una pipetta. Mantenere un 200 µ l di campione del "attraversa" e conservare a-80 ° C per un'analisi successiva.</li>
	<li>Lavare la resina di IgG-agarosio in 37,5 mL di tampone A e incubare per 10 minuti su un agitatore rotante.</li>
	<li>Sedimento della resina di IgG-agarosio a 100 × g per 5 min a 4 ° C, eliminare il surnatante con una pipetta, aggiungere 5 mL di tampone A di rettifica di una provetta da centrifuga da 15 mL e centrifugare a 100 × g, 4 ° C, 5 min. Mantieni un 200 µ l di campione del "Wash 1" e conservare a-80 ° C per un'analisi successiva.</li>
	<li>Ripetere i 5 mL fase tre volte con tampone di A. di lavaggio</li>
	<li>Svolgere gli ultimi due passaggi di lavaggio senza gli inibitori (NaF, inibitore della proteasi e PMSF) Nota: Inibitori non sono necessari in questa fase e omesso per ridurre i costi. Conservare un campione di 200 µ l dell'ultimo lavaggio passo finale "lavaggio" (W6) e conservare a-80 ° C per un'analisi successiva.</li>
	<li>Trasferire la resina di IgG-agarosio a una colonna di spin 500 µ l con filtro 35 µm e lavare le perle due volte con 300 µ l di tampone di eluizione di TEV (tabella 1) (non contenente AcTEV) di equilibramento. Chiudere la colonna di spin.</li>
	<li>Aggiungere 300 µ l di tampone di eluizione di TEV contenente 50 unità (10 µ l) di AcTEV. Preparare la miscela in un tubo prima di aggiungere alla resina.</li>
	<li>Incubare la colonna di spin con perline in un thermomixer a 16 ° C, 350 giri/min per 2 h. invertire la colonna delicatamente più volte ogni 30 min.</li>
	<li>Aprire la colonna di spin, posto in una nuova provetta di pulito da 1,5 mL e spin a 100 × g per 5 min a 4 ° C per raccogliere l'eluato.</li>
	<li>A secco (per esempio) 10% (v/v) del campione eluito (~ 25 µ l) in un evaporatore centrifugo e utilizzare per spettrometria di massa o altre ulteriori analisi.</li>
	<li>Aliquotare l'eluato rimanente (~ 275 µ l) diviso in undici centrifuga 1,5 mL provette (25 µ l ciascuna), a secco in un evaporatore centrifugo e conservare a-80 ° C.</li>
	<li>Analizzare i campioni conservati in tutta la procedura, nonché gli eluati da standard SDS-PAGE seguita da immunoblotting. Per la preparazione del campione, precipitato 50 µ g di totale (T), carico (L), flusso attraverso (FT), lavare 1 (W1) e 200 µ l di Wash 6 (W6) di cloroformio/metanolo estrazione16.</li>
	<li>Aggiungere 10 µ l di tampone di caricamento SDS-PAGE (tabella 1) per i campioni precipitati: 2x e 25 µ l di campione essiccato eluito. Vortice e far bollire per 10 minuti a 95 ° C in un blocco di calore.</li>
	<li>Analizzare totale (T), carico (L), flusso attraverso (FT), lavaggio 1 (W1), lavare 6 (W6) ed eluizione (E) immunoblotting usando gli anticorpi anti-TOC159 per determinare l'efficienza della procedura di isolamento.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Jarvis, P., L&#243;pez-Juez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+and+homeostasis+of+chloroplasts+and+other+plastids.">Biogenesis and homeostasis of chloroplasts and other plastids.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 787-802 (2013).</li><li>Kessler, F., Schnell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloroplast+biogenesis:+diversity+and+regulation+of+the+protein+import+apparatus.">Chloroplast biogenesis: diversity and regulation of the protein import apparatus.</a> Current opinion in cell biology. 21 (4), 494-500 (2009).</li><li>Schnell, D. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interactions+of+tandem+affinity+purified+protein+kinases+from+rice.">Protein-protein interactions of tandem affinity purified protein kinases from rice.</a> PloS one. 4 (8), 6685 (2009).</li><li>Agne, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acidic+A-domain+of+Arabidopsis+TOC159+occurs+as+a+hyperphosphorylated+protein.">The acidic A-domain of Arabidopsis TOC159 occurs as a hyperphosphorylated protein.</a> Plant physiology. 153 (3), 1016-1030 (2010).</li><li>Wessel, D., Flugge, U. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+quantitative+recovery+of+protein+in+dilute+solution+in+the+presence+of+detergents+and+lipids.">A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids.</a> Analytical biochemistry. 138 (1), 141-143 (1984).</li></ol>

Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.

Abbiamo dimostrato che un singolo passaggio di purificazione tag TAP è un metodo specifico ed efficiente per la depurazione del complesso di TOC-TIC di Arabidopsis . Anche se il rubinetto-tag permetterebbe due passaggi successivi di purificazione (IgG-seguita da purificazione di affinità calmodulina dopo TEV proteasi-fenditura), crediamo che in molti casi il primo passo di affinità seguito dalla scissione della proteasi TEV sarà sufficiente. Il nostro obiettivo, TOC159, è bassa abbondante e l'inclusione del secondo passaggio della calmodulina-affinità eccessivamente diminuito il rendimento di proteina che era il motivo principale per escluderlo dalla nostra presente protocollo. L'eluizione di TEV in sé è un passo di purificazione altamente specifico e delicato che rilascerà solo la destinazione TAP-tag insieme ai partner di interazione associato mentre contaminando le proteine che attacca non specifico per la resina di IgG rimarrà lì. Così, in combinazione con il passo di IgG-affinità, l'eluizione di TEV risulta in una purificazione sufficientemente efficiente per nostro e probabilmente molti altri scopi.
Deve prestare attenzione che il costrutto di TAP-etichetta è completamente funzionale in vivo. TAP-tagging potrebbe avere effetti potenzialmente deleteri sulla attività della proteina, la stabilità o la localizzazione. TOC159 è costituito da tre domini, il dominio di acido N-terminale, il dominio GTP-associazione centrale e dominio di membrana C-terminale, che ancora TOC159 nella membrana esterna cloroplasto2. Per evitare potenziali interferenze con l'inserimento della membrana, abbiamo fuso il rubinetto-tag al N-terminale di TOC159. La fusione al N-terminale è piuttosto l'eccezione che la regola. Molte proteine contengono informazioni sulla destinazione del N-terminale e pertanto dovrebbero contrassegnati al C-terminale. Siamo certi che TOC159 è funzionale in vivo di complementazione del mutante ppi2 (un mutante di albino manca TOC159) con rubinetto-TOC159. Il salvataggio del verde, fenotipo wild type indicato che TAP-TOC159 era funzionale15.
Il protocollo di purificazione è stato utilizzato per identificare nuovi partners di interazione di TOC159, che comprendeva10,KOC1 e TIC5611. In totale, circa 30 proteine sono stati associati con il complesso suggerendo che l'interazione nuovo partner sarà isolata e caratterizzata nel prossimo futuro. Mentre consigliamo vivamente il rubinetto-tag per depurazione complessi, vorremmo ancora sottolineare che ulteriori versioni a quello presentato qui esistano e possono essere molto utile per alcune applicazioni.

Piante dipendono da cloroplasti per la fotosintesi e la crescita autotrofe1. La maggior parte delle proteine del cloroplasto è codificata nel nucleo, sintetizzata nel citosol e importata in cloroplasto attraverso i complessi TIC e TOC in busta membrane2. Il nucleo del sommario complesso è costituito dal canale di conduzione di proteina di Toc75 e i due recettori GTPases Toc33 e Toc1593,4,5. TOC159 è essenziale per la biogenesi dei cloroplasti e media l'accumulazione voluminosa di proteine associate fotosintesi6. Il complesso TIC è costituito dal TIC20 lo svolgimento di proteina canale così come TIC110 e TIC407,8. Recentemente, una traslocazione di proteine 1MD complessa alla membrana busta interna è stata isolata e conteneva componenti precedentemente non identificato9, uno dei quali era TIC56. Abbiamo recentemente co-isolato in TIC56 di 1 MDa complessa utilizzando il protocollo di purificazione di affinità TAP-TOC159. I dati hanno indicato una sovrapposizione strutturale tra i complessi TOC/TIC "canonici" e la 1 MDa complesso10. In precedenza sconosciuti componenti quali KOC1 inoltre sono stati identificati come nuovo partner di interazione dei TIC e TOC complessi utilizzando il metodo di rubinetto descritto qui10,11.
Così, la purificazione di TAP-tag è un metodo efficace per l'isolamento dei complessi della proteina e l'identificazione di interattori di successive analisi spettrometria totale12. Il tag TAP è costituito da due ripetizioni di IgG leganti separati da un peptide di calmodulin-associazione (CBP) da un tabacco etch sito di clivaggio della proteasi virus (TEV). Il metodo originale, costituito da una fase di purificazione di affinità IgG seguita dal clivaggio TEV e successive calmodulina-cromatografia consentito la purificazione nativa di grandi e altamente pura proteina complessi13,14 . Abbiamo semplificato la procedura e ha dimostrato che i complessi di proteine contenenti TOC159 possono anche essere purificati in modo efficiente utilizzando solo la fase di purificazione di affinità IgG seguita da TEV-fenditura per eluizione15. Nella nostra esperienza, l'omissione del passo del calmodulin-affinità provocato rendimenti più elevati e pertanto può essere appropriato per le proteine di scarsa abbondanza.
In breve, abbiamo progettato transgenici stabile a. thaliana linee che esprimono TAP-TOC159 in ppi2 (toc159 KO mutante) di base e ha stabilito come una fonte affidabile per la purificazione di complessi di TOC-TIC. Il protocollo per l'isolamento del complesso TOC-TIC inizia con l'omogeneizzazione del materiale vegetale in un amplificatore senza detersivo. Dopo centrifugazione, il sovranatante viene scartato. Il pellet contenente la frazione totale della membrana viene solubilizzato utilizzando un buffer contenente detersivo. Dopo un passaggio di ultra-centrifugazione, il sovranatante contenente solubilizzate complessi di TOC-TIC viene applicato alla IgG-resina per purificazione di affinità. Dopo varie fasi di lavaggio, eluizione viene effettuata utilizzando un buffer contenenti proteasi TEV selettivamente fendere a valle i domini di IgG-binding e delicatamente rilasciare complessi contenenti TOC159 nativi. L'eluato TEV può essere analizzato direttamente mediante Western blotting o spettrometria di massa per identificare i partner di interazione di TOC15910,11,15. Il metodo è stato utilizzato anche per identificare le modifiche post-traduzionali di TOC15915. In futuro, nativi complessi contenenti TOC159 possono essere utilizzati per studi strutturali utilizzando criomicroscopia elettronica.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:783px;" width="783">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:312px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:185px;">PanReac&#160; AppliChem</td>
			<td style="width:119px;">A0384</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Tris</td>
			<td style="width:185px;">Biosolve</td>
			<td style="width:119px;">0020092391BS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:312px;">Na2HPO4</td>
			<td style="width:185px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S7909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:312px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:185px;">PanReac&#160; AppliChem</td>
			<td style="width:119px;">A2946</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">NaCl</td>
			<td style="width:185px;">PanReac&#160; AppliChem</td>
			<td style="width:119px;">A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">NaF</td>
			<td style="width:185px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S1509</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">PMSF</td>
			<td style="width:185px;">PanReac&#160; AppliChem</td>
			<td style="width:119px;">A0999</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Plant protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:185px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P9599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Glycerol</td>
			<td style="width:185px;">PanReac&#160; AppliChem</td>
			<td style="width:119px;">A0970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Triton X100</td>
			<td style="width:185px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">10789704001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Glycine</td>
			<td style="width:185px;">PanReac&#160; AppliChem</td>
			<td style="width:119px;">A1067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">EDTA</td>
			<td style="width:185px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:119px;">8043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:185px;">PanReac&#160; AppliChem</td>
			<td style="width:119px;">A1101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">SDS</td>
			<td style="width:185px;">PanReac&#160; AppliChem</td>
			<td style="width:119px;">A0675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Bromophenol blue</td>
			<td style="width:185px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">B0126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">HCl</td>
			<td style="width:185px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">20252-290</td>
			<td>Corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Sucrose</td>
			<td style="width:185px;">PanReac&#160; AppliChem</td>
			<td style="width:119px;">A3935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:312px;">Murashige and Skoog medium with vitamins</td>
			<td style="width:185px;">Duchefa Biochemie</td>
			<td style="width:119px;">M0222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Phytoagar</td>
			<td style="width:185px;">Duchefa Biochemie</td>
			<td style="width:119px;">P1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Petri plate</td>
			<td style="width:185px;">Greiner Bio-one</td>
			<td style="width:119px;">639102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">1.5 mL microfuge tubes</td>
			<td style="width:185px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:119px;">72.706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Ethanol</td>
			<td style="width:185px;">Fisher chemical</td>
			<td style="width:119px;">E/0600DF/15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Filter paper&#160;</td>
			<td style="width:185px;">Whatman</td>
			<td style="width:119px;">10311804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Surgical tape</td>
			<td style="width:185px;">3M</td>
			<td style="width:119px;">1530-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:312px;">CNBr-Activated agarose beads (sepharose 4B)</td>
			<td style="width:185px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">17-0430-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Sintered glass filter</td>
			<td style="width:185px;">DURAN</td>
			<td style="width:119px;">2515703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Centrifuge tube 50 mL</td>
			<td style="width:185px;">TPP</td>
			<td style="width:119px;">91050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Purified immunoglobulin G (HsIgG)</td>
			<td style="width:185px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:119px;">855908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Rotating shaker</td>
			<td style="width:185px;">IKA</td>
			<td>4016000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:312px;">NaN3 (sodium azide)</td>
			<td style="width:185px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">71290</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Quick filtration material (Miracloth)</td>
			<td style="width:185px;">Merk-Millipore</td>
			<td style="width:119px;">475855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Ultracentrifube XNP-80</td>
			<td style="width:185px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">A99839</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Rotor SW 32 Ti</td>
			<td style="width:185px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">369650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Ultracentrifuge tubes</td>
			<td style="width:185px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">326823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Glass teflon homogenizer (Potter)</td>
			<td style="width:185px;">Wheaton</td>
			<td style="width:119px;">357426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Spin column (Mobicol)</td>
			<td style="width:185px;">Mo Bi Tec</td>
			<td style="width:119px;">M1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Filter 35&#181;m for spin column (Mobicol)</td>
			<td style="width:185px;">Mo Bi Tec</td>
			<td style="width:119px;">M513515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">AcTEV</td>
			<td style="width:185px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">12575-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Centrifugal evaporator (Speed Vac)</td>
			<td style="width:185px;">Eppendorf</td>
			<td>5305000100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">FBN1A(PGL35) antibody</td>
			<td style="width:185px;">AgriSera</td>
			<td>AS06 116</td>
			<td>RRID:AB_2247012</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sand, Fontainebleau</td>
			<td style="width:185px;">VWR</td>
			<td>27460.295</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

affinity purification of chloroplast translocon protein complexes using the tap tag

Biogenesi cloroplasto richiede l'importazione di migliaia di proteine codificate dal nucleo in del plastidio. L'importazione di queste proteine dipende il Traslocone all'esterno (TOC) e membrane interne di cloroplasti (TIC). I complessi TIC e TOC sono multimerici e probabilmente contengono componenti ancora sconosciuti. Uno degli obiettivi principali nel campo è quello di stabilire l'inventario completo dei componenti TIC e TOC. Per l'isolamento dei complessi di TOC-TIC e l'identificazione di nuovi componenti, il recettore preprotein che toc159 è stato modificato N-terminalmente con l'aggiunta del tag di purificazione (TAP) affinità tandem conseguente TAP-TOC159. Il rubinetto-tag è stato progettato per due fasi di purificazione di affinità sequenziale (quindi "affinità tandem"). Il rubinetto-tag utilizzato in questi studi è costituito da un dominio N-terminale IgG-associazione derivato dalla proteina di Staphylococcus aureus un (ProtA) seguita da un peptide di calmodulin-associazione (CBP). Tra questi tag due affinità, un tabacco etch clivaggio proteasi virus (TEV) sito è stato incluso. Di conseguenza, della proteasi TEV può essere utilizzata per eluizione delicato di complessi contenenti TOC159 dopo l'associazione ai branelli di IgG. Nel protocollo presentato qui, è stato omesso il secondo passaggio di purificazione calmodulina-affinità. Il protocollo di purificazione inizia con la preparazione e la solubilizzazione delle membrane cellulari totale. Dopo il trattamento detergente, le proteine di membrana solubilizzate vengono incubate con IgG perline per la immunoisolation del rubinetto-TOC159-contenere i complessi. All'associazione e vasto lavaggio, TAP-TOC159 contenenti complessi sono spaccati e rilasciati dalle perle di IgG usando la proteasi TEV per cui il dominio di S. aureus IgG-binding viene rimosso. Macchiare dell'isolato occidentale complessi contenenti TOC159 possono essere utilizzati per confermare la presenza delle proteine TIC e TOC note o sospette. Ancora più importante, il TOC159-contenere i complessi sono stati utilizzati con successo per identificare nuovi componenti dei complessi TIC TOC mediante spettrometria di massa. Il protocollo che presentiamo potenzialmente consente l'isolamento efficiente di qualsiasi proteina di membrana complessi da utilizzare per l'identificazione di componenti ancora sconosciuti tramite spettrometria di massa.

Abbiamo descritto qui un protocollo per la purificazione di una proteina di busta di TAP-etichetta cloroplasto complessa da transgenici a. thaliana piante. Come illustrato nella Figura 1A, piante che esprimono il 35S:NTAP-TOC159 costrutto sono stati usati per isolare questo complesso mentre piante esprimenti il costrutto di 35S:NTAP sono stati usati come controllo. Figura 1 B Mostra procedura dettagliata della purificazione dei complessi della proteina TAP-TOC159 seguita da spettrometria di massa per consentire l'identificazione di proteine interagenti. L'analisi di immunoblot (Figura 2, lato destro) conferma che isolato TAP-TOC159 interagisce con TOC75 e TOC33 del complesso TOC. Chinasi di membrana esterna del cloroplasto KOC1 noto di fosforilare TOC159 anche co-isolato con il complesso di TAP-TOC159 (Figura 2B, lato destro). La presenza di TIC110 rivela che il complesso di TAP-TOC159 isolato contiene inoltre i componenti del complesso TIC. L'anticorpo FBN1A sollevata contro una proteina di plastoglobule estraneo alla importazione di proteina non ha riconosciuto il complesso TAP-TOC159 che indica l'assenza di contaminazioni. Nel controllo negativo, immunoprecipitati NTAP proteina non ha fatto co-isolare con una qualsiasi delle proteine TOC-TIC (Figura 2, lato sinistro) e conferma la specificità della purificazione TAP-TOC159.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58532/58532fig1.jpg"> Figura 1 . Schema della procedura di purificazione di affinità e costrutti. (A). il 35S:NTAP-TOC159 costrutto, codifica NTAP-TOC159 era stabilmente espressa in Arabidopsis thaliana. Impianti di controllo negativo espresso il costrutto 35S:NTAP, codifica il rubinetto-tag da solo. (B). il protocollo di purificazione di affinità saggio passo è costituito da membrana isolamento e solubilizzazione, IgG dell'agarosi immuno-purificazione, lavaggi, TEV proteasi fenditura ed eluizione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58532/58532fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58532/58532fig2.jpg"> Figura 2 . Purificazione di affinità tandem della proteina TOC159. N-terminalmente TOC159 TAP-tag è stato purificato da NTAP-TOC15: piante diArabidopsis ppi2 e rubinetto proteina purificata dalle piante di rubinetto: WT è stata usata come controllo negativo. Totale proteine di membrana proteina estratti (T), solubilizzati = frazione di carico (L), flusso attraverso (FT), primo e ultimo lavare le frazioni (W1 e W6) e 10% dell'eluato TEV sono stati analizzati mediante Western blotting. La membrana è stata sondata con gli anticorpi contro TOC159 (AT4G02510), TOC75 (AT3G46740), TOC33 (AT1G02280), KOC1 (AT4G32250), TIC110 (AT1G06950) e FBN1A (AT4G04020). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58532/58532fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Tabella di buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Tampone per l'accoppiamento</td>
			<td>NaHCO3 Regolare a pH 8,5 regolare il pH con 0,1 M Na2CO3
</td>
			<td>100 mM 
			 </td>
		</tr>
<tr>
<td>Blocco Buffer</td>
			<td>Tris-HCl Regolare il pH 8 con HCl.</td>
			<td>100 mM 
			 </td>
		</tr>
<tr>
<td>Tampone PBS</td>
			<td>Na2HPO4 KH2PO4 NaCl KCl Regolare il pH 7,3 con HCl.</td>
			<td>4,3 mM 1,4 mM 137 2.7 
			 </td>
		</tr>
<tr>
<td>NaCl Buffer di accoppiamento</td>
			<td>Tampone per l'accoppiamento NaCl</td>
			<td>  1 M</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 x Buffer di macinazione</td>
			<td>Tris-HCl, pH 7.5 con HCl. NaCl NaF PMSF Pianta della proteasi inibitore cocktail</td>
			<td>100 mM 200 mM 5 mM 1 mM 0,20%</td>
		</tr>
<tr>
<td>4 x soluzione di solubilizzazione</td>
			<td>Glicerolo Triton-X100</td>
			<td>40% 3%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tampone A</td>
			<td>  2 x Buffer di macinazione 1x Buffer di macinazione 4 x soluzione di solubilizzazione</td>
			<td>100 ml 50 ml 25 ml 25%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Eluizione di TEV Buffer</td>
			<td>Tris-HCl, pH 8 con HCl EDTA, pH 8 con HCl NaCl Glicerolo Triton-X100 DTT</td>
			<td>50 mM 0,5 mM 100 mM 10% 0,75% 1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Buffer di caricamento SDS-PAGE: 2x</td>
			<td>Tris-HCl pH 6.8 con HCl SDS Glicerolo Azzurro del bromofenolo DTT</td>
			<td>0.1 M 4% 20% 0,20% 0,2 M</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1. Ricette del buffer.

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Affinity Purification of Chloroplast Translocon Protein Complexes Using the TAP Tag

Qui presentiamo un protocollo collaudato e testato per la purificazione del cloroplasto complessi di importazione della proteina (complesso di TOC-TIC) utilizzando il rubinetto-tag. Il protocollo di affinità-isolamento di uno stadio potenzialmente può essere applicato a qualsiasi proteina ed essere utilizzato per identificare nuovi partners di interazione mediante spettrometria di massa.

Purificazione di affinità del cloroplasto Translocon proteina complessi usando il Tag di rubinetto

Chloroplast biogenesis requires the import of thousands of nucleus-encoded proteins into the plastid. The import of these proteins depends on the ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dei cloroplasti, ad esempio la composizione dei macchinari per l'importazione di proteine cloroplaste. È essenziale per l'invernimento e la fotosintesi e quindi per la produzione alimentare sul pianeta. La macchina molecolare è costituita da due complessi separati nel membro esterno ed interno del cloroplasto chiamato TOC e TIC, ma la composizione non è completamente nota.Il principale vantaggio di questa tecnica è che la purificazione del complesso Arabidopsis TOC/TIC può essere realizzata in un unico metodo di purificazione in un unico passaggio, la purificazione TAP-TOC. Si tratta di un metodo specifico ed efficiente. Generalmente, i ricercatori nuovi a questo metodo possono avere difficoltà perché non hanno familiarità con l'isolamento delle frazioni di membrana cloroplasta, detergente, solubilizzazione o purificazione dell'affinità.Dopo aver preparato le piante di Arabidopsis, macinare 10 grammi di piantine vecchie di tre settimane in azoto liquido, usando una malta fredda e pestello con sabbia. Aggiungere 20 millilitri di tampone di macinazione a freddo ai tessuti macinati. Mescolare bene e lasciare scongelare la miscela sul ghiaccio.Quindi, immergere due strati di materiale di filtrazione rapida con tampone di rettifica. Filtrare l'omogeneizzato attraverso i due strati di materiale filtrante in un tubo di centrifuga conico da 50 millilitri. Centrifugare il filtrato a 1.500 volte g in quattro gradi Celsius per 10 minuti e trasferire il supernatante in un tubo di centrifuga conico fresco pre-refrigerato da 50 millilitri.Ripetere la centrifugazione ancora una volta alle stesse condizioni. Trasferire il supernatante in un tubo ultracentrifugo freddo da 38,50 millilitri e completarlo fino a 35 millilitri con tampone di macinazione a freddo. Utilizzare un ultracentrifugo per centrifugare il campione a 100.000 volte g e quattro gradi Celsius per un'ora.Utilizzando un omogeneizzatore in teflon in vetro, rimescolare il pellet verde nel tampone di rettifica. Centrifugare a 100.000 volte g e quattro gradi Celsius per un'ora e scartare il supernatante. Utilizzare l'omogeneizzatore teflon in vetro per rimescolare il pellet verde in 18,75 millilitri di un tampone di rettifica x.Quindi aggiungere altri 9.375 millilitri di un buffer di rettifica x. Aggiungere 9,375 millilitri di quattro x soluzione di solubilizzazione per portare il volume finale a 37,5 millilitri e incubare su uno shaker rotante a quattro gradi Celsius per 30 minuti. Successivamente, utilizzare un ultracentrifugo per centrifugare il campione a 100.000 volte g e quattro gradi Celsius per un'ora.Trasferire il supernatante contenente le membrane solubilizzate in un tubo di centrifuga conico fresco da 50 millilitri. Dopo aver preparato la resina di agarosio IGG, trasferire la resina di agarosio IGG precedentemente lavata nel tubo conico da 50 millilitri contenente i 37,5 millilitri delle membrane solubilizzate. Incubare durante la notte su uno shaker rotante a quattro gradi Celsius.Il giorno dopo, sedimentare la resina di agarosio IGG a 100 volte g e quattro gradi Celsius per cinque minuti. Utilizzare una pipetta per rimuovere il supernatante. Era la resina di agarosio IGG in 37,5 millilitri di tampone A e incubare su uno shaker rotante a temperatura ambiente per 10 minuti.Continuare a sedimentare e lavare la resina come delineato nel protocollo di testo. Successivamente, trasferire la resina di agarosio IGG in una colonna di spin da 500 microliter con un filtro da 35 micron. Lavare le perline due volte con 300 microlitri di tampone di eluizione TEV per l'equilibrazione.Successivamente, aggiungere 300 microlitri di tampone di eluizione TEV contenenti 10 microlitri di proteasi TEV. Incubare la colonna di spin con perline in un Thermomixer a 16 gradi Celsius e 350 giri/min per due ore. Quindi, aprire la colonna di rotazione e posizionarla in un nuovo tubo pulito da 1,5 millilitri.Ruotare questo tubo a 100 volte g e quattro gradi Celsius per cinque minuti per raccogliere l'eluato. In questo studio viene purificato un complesso proteico di involucro di cloroplasto taggato TAP da piante transgeniche di A.thaliana. L'analisi immunoblot conferma che l'isolamento TAP-TOC159 interagisce con TOC75 e TOC33 del complesso TOC.Anche la membrana esterna cloroplasta chinasi, KOC1, nota per il fosforilato TOC159, è co-isolata. La presenza di TIC110 rivela che il complesso isolato TAP-TOC159 contiene anche i componenti del complesso TIC. L'anticorpo FBN1A non ha riconosciuto il complesso TAP-TOC159, indicando l'assenza di contaminazioni.Nel controllo negativo, la proteina NTAP immunoprecipitata non si è co-isolata con nessuna delle proteine TOC, TIC e conferma la specificità della purificazione TAP-TOC159. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sull'importazione di proteine cloroplaste, può potenzialmente essere applicato a qualsiasi altro complesso nel sistema di bottiglie arabidopsis thaliana. Seguendo questa procedura, possono essere applicati altri metodi come l'assorbimento occidentale o la spettrometria di massa per dimostrare la presenza di componenti noti o per identificare nuovi componenti dei complessi TOC e TIC.Questa tecnica ha aperto la strada alla ricerca nel campo dell'importazione di proteine cloroplaste per esplorare la funzione di nuovi componenti dei complessi TOC e TIC.

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