Name: affinity purification of chloroplast translocon protein complexes using the tap tag
Uploaded: 2018-11-01T15:00:00
Duration: 7 min 1 s
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작품 (31003A_156998 및 31003A_176191) 스위스 국립 과학 재단에서 교부 금에 의해 그리고 뉴 샤 텔 대학에 의해 지원 되었다.

1입니다. 애기 식물의 준비
<ol><li>Skoog (MS)와 村 重 중간 포함 비타민 1% 자당의 절반 강도 1 리터를 준비 하 고 수산화 칼륨 (KOH)와 5.7에 pH를 조정. 120 ° c.에 phytoagar 및 20 분 압력솥의 0.8%를 추가</li>
	<li>페 트리 접시 당 MS 매체의 75 mL를 붓고 (직경 14.5 c m, 높이 3 c m) 1 시간에 대 한 응고를 허용.</li>
	<li>1.5 mL microfuge 관에 애기 thaliana 씨앗의 30 mg을 추가 그리고 표면 소독 0.05% (v/v)를 포함 하는 70% (v/v) 에탄올과 Triton X-100 5 분, 10 분에 대 한 (v/v) 에탄올 에탄올을 제거 뒤에 100%.</li>
	<li>건조 살 균 필터 종이에 씨앗을 전송 합니다. (각 유전자 형 필요 적어도 8-10 접시) MS 판에 균등 하 게 소독된 씨앗을 뿌려와 각 플레이트 외과 테이프와 인감.</li>
	<li>씨앗 발 아 동기화를 어둠 속에서 이틀 동안 4 ° C에서 번호판을 품 어. 다음 빛 주기와 성장 챔버에 전송: 120 µmol m−2의 − 1 , 8h와 22-20 ° c.에 어둠의 16 h</li>
</ol>2. 준비 HsIgG Agarose 구슬의
<ol><li>100 ml의 1 m HCl m CNBr 활성화 agarose 구슬 (4 g)를 중단 하십시오 하 고 실 온에서 30 분 동안 품 어.</li>
	<li>소 결된 유리 필터에 agarose 구슬 전송, 100 m m HCl의 100 mL와 진공에서 세척 하 고 2-3 회 반복. 참고: 쿨 워시 솔루션 4 ° c</li>
	<li>Agarose 구슬 찬 100 m m HCl의 1 ml에서 및 50 mL 원뿔 원심 분리기 튜브에 resuspend. 100 m m HCl 3 mL와 함께 소 결된 유리 필터를 세척 하 고 같은 튜브에 액체를 전송.</li>
	<li>4 ° C에서 5 분 동안 400 × g 에서 회전 시키십시오 그리고 제거는 피 펫과 상쾌한. 참고: 튜브를 가만히 따르다 하지 마십시오.</li>
	<li>커플링 버퍼 (표 1); 50 mL에 구슬 resuspend 짧게, 믹스와 다음 4 ° c.에서 5 분 동안 400 × g 에서 회전</li>
	<li>동결 건조 된 호모 사피엔스 IgG (Hs-IgG)의 50 밀리 그램 커플링 버퍼의 10 mL에 녹, 부드럽게, agarose 구슬 믹스 및 4 ° c.에 하룻밤 회전 통에서 품 어</li>
	<li>4 ° C에서 5 분 동안 400 × g 에서 회전 시키십시오 그리고 제거는 피 펫과 상쾌한.</li>
	<li>IgG agarose 구슬 커플링 버퍼 및 4 ° c.에서 5 분 동안 400 × g 에서 스핀의 50 mL로 씻으십시오</li>
	<li>4 ° c.에서 5 분 동안 400 × g 에서 블로킹 버퍼 (표 1)와 스핀의 50 mL와 IgG agarose 구슬 resuspend 한 번 반복 합니다.</li>
	<li>블로킹 버퍼의 50 mL에 IgG agarose 구슬 resuspend, RT에서 2 시간 및 4 ° c.에서 5 분 동안 400 × g 에서 스핀에 대 한 혼합물을 회전</li>
	<li>제거는 상쾌한 고 NaCl 커플링 버퍼 (표 1)의 200 mL에 IgG agarose 구슬 resuspend.</li>
	<li>모든 나머지 상호 CNBr 그룹을 차단 하려면 100 mL의 0.1 M 글리신-HCl, pH 2.8와 IgG agarose 구슬 세척. 4 ° C에서 5 분 동안 400 × g 에서 회전 시키십시오 그리고 제거는 상쾌한. 0.2 M 글리신-HCl, pH 2.8, 4 ° C에서 5 분 동안 400 × g 에서 회전으로 세척 하 고 제거 하는 상쾌한. 마지막으로, IgG agarose 구슬 초순 물 200 mL와 함께 씻는 다.</li>
	<li>워시 초순 물 200 mL와 200 mL PBS 버퍼 (표 1)의 IgG agarose 구슬.</li>
	<li>20 ml PBS 버퍼 0.01% 할머니3 (나트륨 아 지 드)와 함께 IgG agarose 구슬 resuspend 및 4 ° c.에 저장</li>
</ol>3. 격리와 막 분수의 가용 화
<ol><li>모래와 차가운 박격포 및 방 앗 공이 사용 하 여 액체 질소에 3 주 오래 된 A. thaliana 묘 10 g을 갈아.</li>
	<li>차가운 땅 조직의 10 g 버퍼 (표 1) 연 삭의 20 mL를 추가 하 고 잘, 얼음에 녹여.</li>
	<li>50 mL 원뿔 원심 분리기 튜브로 빠른 여과 물자의 2 개의 층을 통해 homogenate를 필터링 합니다. 여과 하기 전에 버퍼를 연 삭으로 빠른 여과 소재를 담근 다.</li>
	<li>4 ° C 및 이전에서 상쾌한 냉된 50 mL 원뿔 원심 분리기 튜브에서 1500 × g 에서 10 분 원심 분리기는 filtrate 같은 한 번 더 고는 상쾌한 수집을 반복 합니다. "총 분수"의 200 µ L의 샘플을 유지 하 고 나중에 분석-80 ° C에서 저장</li>
	<li>차가운 38.50 mL ultracentrifuge 관에는 상쾌한 전송 및 냉 연 삭 버퍼와 최대 35 mL 최고. ultracentrifuge에서 4 ° C에서 100000 × g 에서 1 시간에 대 한 원심 분리기.</li>
	<li>50 mL 원뿔 원심 분리기 튜브는 상쾌한 전송. "녹는 분수"와 나중에 분석-80 ° C에서 저장소의 200 µ L의 샘플을 유지 합니다.</li>
	<li>재 연 삭 버퍼에 유리 테 플 론 균질 화기를 사용 하 여 녹색 펠 릿을 일시 중단 합니다. ultracentrifuge에서 4 ° C에서 100000 × g 에서 1 h centrifuge 고는 상쾌한 삭제.</li>
	<li>18.75 ml 유리 테 플 론 균질 화기를 사용 하 여 버퍼를 연 삭 하는 x 1의 녹색 펠 릿을 resuspend 하 고 버퍼를 연 삭 하는 x 1의 9.375 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>주고 37.5 mL 4 ° c.에 "회전 통"에 30 분 동안 품 어 9.375 mL 4 x solubilisation 솔루션 (표 1) (TX-100 세제 포함)의 추가</li>
	<li>ultracentrifuge에서 4 ° C에서 100000 × g 에서 1 시간에 대 한 원심 분리기. 50 mL 원뿔 원심 분리기 튜브는 상쾌한 전송. 200 µ L 샘플 상쾌한 (미래 "부하 분수")와 나중에 분석-80 ° C에서 저장소의 유지 합니다.</li>
	<li>버퍼를 연 삭의 37.5 mL에 펠 릿을 resuspend. 불용 성 부분과 저장소-80 ° C에서의 샘플을 유지</li>
</ol>4입니다. Immunoprecipitation
<ol><li>포장된 IgG agarose 수 지 버퍼 A에에서 (표 1)와 4 ° c.에서 5 분 동안 100 × g 에서 스핀의 100 µ L equilibrate</li>
	<li>제거는 상쾌한 고 버퍼 A 4 ° c.의 100 µ L에서 IgG agarose 수 지 resuspend</li>
	<li>씻어 IgG agarose 수 지 solubilized 막의 37.5 mL 전송과 4 ° c.에 50 mL 원뿔 원심 분리기 튜브에 회전 통에 밤새 품 어</li>
	<li>앙금 IgG agarose 4 ° C에서 5 분 동안 100 × g 에서 수 지 하 고는 피 펫과 상쾌한을 제거 합니다. 통해 "흐름"의 200 µ L의 샘플을 유지 하 고 나중에 분석-80 ° C에 저장 합니다.</li>
	<li>버퍼 A의 37.5 ml에서 IgG agarose 수 지를 세척 하 고 회전 통에 10 분 동안 품 어.</li>
	<li>토사 4 ° C에서 5 분 동안 100 × g 에서 IgG agarose 수 지는 피 펫과 상쾌한 제거 하 고 "세척 1"의 200 µ L 샘플 버퍼 A 15 mL 원심 분리기 튜브와 원심 분리기에서 100 × g, 4 ° C, 5 분 유지 연 삭의 5 mL을 추가 하 고,-80 ° C에서 저장 나중 분석에 대 한.</li>
	<li>반복 단계 3 번 버퍼 A. 세척 5 mL</li>
	<li>억제제 (NaF, Protease 억제제와 PMSF) 없이 마지막 두 세척 단계 수행 참고: 억제제가이 단계에서 필요 이상 고 비용을 줄이기 위해 생략. 마지막 세척 단계 "최종 세척 (W6)"와 나중에 분석-80 ° C에서 저장소의 200 µ L의 샘플을 유지 합니다.</li>
	<li>35 µ m 필터 500 µ L 회전 열에 IgG agarose 수 지를 전송 하 고 구슬 TEV 차입 버퍼 (표 1)의 300 µ L로 두 번 (AcTEV를 포함 하지 않는) 평형에 대 한 씻어. 스핀 열을 닫습니다.</li>
	<li>AcTEV의 50 단위 (10 µ L)를 포함 하는 TEV 차입 버퍼의 300 µ L를 추가 합니다. 수 지에 추가 하기 전에 튜브에 믹스를 준비 합니다.</li>
	<li>16 ° C에서 thermomixer에 구슬 회전 열을 품 어, 2 헤 대 한 350 rpm 반전 열 부드럽게 여러 번 매일 30 분.</li>
	<li>스핀 열을 열고, 새로운 깨끗 한 1.5 mL 튜브에는 eluate 수집 하 4 ° C에서 5 분 동안 100 × g 에서 스핀 장소.</li>
	<li>건조 한 (예를 들어) 원심 증발 기에 eluted 샘플 (~ 25 µ L)의 10% (v/v) 및 질량 분석 또는 다른 추가 분석에 대 한 사용.</li>
	<li>Aliquot 나머지 eluate (~ 275 µ L)에서 분할 11 1.5 mL 원심 분리기 튜브 (25 µ L 각), 원심 증발 기에서 건조 하 고-80 ° c.에 저장 하기</li>
	<li>SDS 페이지 뒤 immunoblotting 표준 절차로는 있다 내내 유지 샘플을 분석 합니다. 샘플 준비, 촉진 50 µ g의 총 (T)에 대 한 부하 (L), (피트)을 통해 세척 1 (W1)와 클로 프롬/메탄올 추출16워시 6 (W6)의 200 µ L.</li>
	<li>SDS 페이지 로딩 버퍼 (표 1) 침전 된 샘플 x 2의 10 µ L eluted 말린된 샘플의 25 µ L를 추가 합니다. 소용돌이 열 블록에서 95 ° C에서 10 분 동안 끓인 다.</li>
	<li>총 (T), 로드 (L), (피트)을 통해 흐름, 워시 1 (W1), 분석 immunoblotting 안티-TOC159 항 체를 사용 하 여 격리 절차의 효율성을 결정 하 여 6 (W6) 및 차입 (E)를 씻어.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Jarvis, P., L&#243;pez-Juez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+and+homeostasis+of+chloroplasts+and+other+plastids.">Biogenesis and homeostasis of chloroplasts and other plastids.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 787-802 (2013).</li><li>Kessler, F., Schnell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloroplast+biogenesis:+diversity+and+regulation+of+the+protein+import+apparatus.">Chloroplast biogenesis: diversity and regulation of the protein import apparatus.</a> Current opinion in cell biology. 21 (4), 494-500 (2009).</li><li>Schnell, D. J., Kessler, F., Blobel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+components+of+the+chloroplast+protein+import+machinery.">Isolation of components of the chloroplast protein import machinery.</a> Science. 266 (5187), 1007-1012 (1994).</li><li>Kessler, F., Blobel, G., Patel, H. A., Schnell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+two+GTP-binding+proteins+in+the+chloroplast+protein+import+machinery.">Identification of two GTP-binding proteins in the chloroplast protein import machinery.</a> Science. 266 (5187), 1035-1039 (1994).</li><li>Jarvis, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Arabidopsis+mutant+defective+in+the+plastid+general+protein+import+apparatus.">An Arabidopsis mutant defective in the plastid general protein import apparatus.</a> Science. 282 (5386), 100-103 (1998).</li><li>Bauer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+role+of+the+G-domain+in+targeting+of+the+protein+import+receptor+atToc159+to+the+chloroplast+outer+membrane.">Essential role of the G-domain in targeting of the protein import receptor atToc159 to the chloroplast outer membrane.</a> The Journal of cell biology. 159 (5), 845-854 (2002).</li><li>Kovacs-Bogdan, E., Soll, J., Bolter, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+import+into+chloroplasts:+the+Tic+complex+and+its+regulation.">Protein import into chloroplasts: the Tic complex and its regulation.</a> Biochimica et biophysica acta. 1803 (6), 740-747 (2010).</li><li>Nakai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+TIC+complex+uncovered:+The+alternative+view+on+the+molecular+mechanism+of+protein+translocation+across+the+inner+envelope+membrane+of+chloroplasts.">The TIC complex uncovered: The alternative view on the molecular mechanism of protein translocation across the inner envelope membrane of chloroplasts.</a> Biochimica et biophysica acta. 1847 (9), 957-967 (2015).</li><li>Kikuchi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncovering+the+protein+translocon+at+the+chloroplast+inner+envelope+membrane.">Uncovering the protein translocon at the chloroplast inner envelope membrane.</a> Science. 339 (6119), 571-574 (2013).</li><li>Kohler, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+chloroplast+protein+import+without+Tic56,+a+component+of+the+1-megadalton+translocon+at+the+inner+envelope+membrane+of+chloroplasts.">Characterization of chloroplast protein import without Tic56, a component of the 1-megadalton translocon at the inner envelope membrane of chloroplasts.</a> Plant physiology. 167 (3), 972-990 (2015).</li><li>Zufferey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+novel+chloroplast+outer+membrane+kinase+KOC1+is+a+required+component+of+the+plastid+protein+import+machinery.">The novel chloroplast outer membrane kinase KOC1 is a required component of the plastid protein import machinery.</a> The Journal of biological chemistry. 292 (17), 6952-6964 (2017).</li><li>Rigaut, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+generic+protein+purification+method+for+protein+complex+characterization+and+proteome+exploration.">A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration.</a> Nature biotechnology. 17 (10), 1030-1032 (1999).</li><li>Rohila, J. S., Chen, M., Cerny, R., Fromm, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+tandem+affinity+purification+tag+and+methods+for+isolation+of+protein+heterocomplexes+from+plants.">Improved tandem affinity purification tag and methods for isolation of protein heterocomplexes from plants.</a> The Plant journal. 38 (1), 172-181 (2004).</li><li>Rohila, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interactions+of+tandem+affinity+purified+protein+kinases+from+rice.">Protein-protein interactions of tandem affinity purified protein kinases from rice.</a> PloS one. 4 (8), 6685 (2009).</li><li>Agne, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acidic+A-domain+of+Arabidopsis+TOC159+occurs+as+a+hyperphosphorylated+protein.">The acidic A-domain of Arabidopsis TOC159 occurs as a hyperphosphorylated protein.</a> Plant physiology. 153 (3), 1016-1030 (2010).</li><li>Wessel, D., Flugge, U. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+quantitative+recovery+of+protein+in+dilute+solution+in+the+presence+of+detergents+and+lipids.">A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids.</a> Analytical biochemistry. 138 (1), 141-143 (1984).</li></ol>

저자 아무 경쟁 관심사를 선언합니다.

우리는 한 번 탭 태그 정화 애기 목차 TIC 복합물의 정화에 대 한 구체적이 고 효율적인 방법을 시연 했다. 탭-태그 두 연속적인 정화 단계 (IgG-calmodulin 친 화력 정화 TEV 프로 테아 제-분열 후 다음) 허용, 하지만 우리는 많은 경우 TEV protease 분열 뒤 선호도 첫걸음 충분할 것 이다 믿습니다. 우리의 목표, TOC159, 풍부한 낮은 이며 두 번째 calmodulin 선호도 단계 포함 지나치게 우리의 현재 프로토콜에서 제외에 대 한 주요 이유는 단백질 수확량 감소. 그 자체로 TEV 차입 유지 됩니다 비-특히 IgG 수 지에 집착 하는 단백질을 오염 하는 동안 관련 된 상호 작용 협동자와 함께 탭 태그 대상 해제 됩니다 매우 특정 하 고 부드러운 정화 단계 이다. 따라서, IgG 선호도 단계와 함께, TEV 차입 결과 우리의 고 아마도 많은 다른 사람들의 목적을 위해 충분히 효율적인 정화.
해야 합니다 주의 탭 태그 구문 완전 한 기능 비보이다. 탭에 태그를 추가 하는 것은 단백질 활동, 안정성 또는 지역화에 잠재적으로 해로운 효과 있을 수 있었다. 3 개의 도메인, 신랄 한 N 맨끝 도메인, 중앙 GTP 바인딩 도메인 및 그 외부 엽록체 막2TOC159 앵커 C 터미널 막 도메인 TOC159에 의하여 이루어져 있다. 막 삽입 잠재적인 간섭을 유발 하지 않도록, 우리는 TOC159의 N-말단에 탭 태그 융합. N-말단에 퓨전 오히려 규칙 보다 예외입니다. 많은 단백질 N-터미널 대상 정보를 포함 하 고 C-말단에 의해 태그 따라서 한다. 우리는 TOC159 탭 TOC159와 기능 vivo에서 ppi2 돌연변이 (TOC159 부족 한 알 비 노 돌연변이)의 보완성은 안심. 녹색의 구조, 야생 타입 형 탭 TOC159 기능15가 표시 됩니다.
정화 프로토콜은 TOC159, KOC1 및 TIC5610,11을 포함의 새로운 상호 작용 파트너를 식별 하기 위해 사용 되었다. 합계에서는, 약 30 단백질 새로운 상호 파트너 격리 되며 가까운 미래에 특징을 제안 하는 복잡 한와 관련 되었다. 우리는 매우 복잡 한 정화에 대 한 탭 태그 권장, 우리 여전히 여기 하나 추가 버전 존재 하 고 일부 응용 프로그램에 매우 유용 수 있습니다 지적 고 싶습니다.

식물은 광합성 및 photoautotrophic 성장1엽록체에 따라 달라 집니다. 엽록체 단백질의 대부분은 핵에서는 cytosol에서 합성 인코딩되고 봉투 막2TIC 및 목차 단지 통해 엽록체로 가져올. Toc75 단백질 실시 채널 및 2 개의 수용 체 GTPases Toc33 Toc1593,,45복잡 한 TOC의 핵심에 의하여 이루어져 있다. TOC159의 엽록체 속에 대 한 필수적 이며 광합성 관련 단백질6의 거 대 한 축적을 중재 한다. TIC20 단백질 실시 채널 뿐만 아니라 TIC110 및 TIC407,8TIC 복합물에 의하여 이루어져 있다. 최근, 1MD 단백질 전 내부 봉투 막에 복잡 한 격리 되었고 이전 미확인된 구성 요소9, 중 하나는 TIC56를 포함. 우리가 최근에 공동 격리 탭 TOC159 선호도 정화 프로토콜을 사용 하 여 복잡 한 1 MDa의 TIC56. 데이터 표시 및 1 MDa 복잡 한10"정식" 목차/TIC 단지 사이의 구조 중복. 이전 탭 메서드를 사용 하 여 목차와 TIC 단지의 새로운 상호 작용 파트너10,11여기 설명한 KOC1와 같은 알 수 없는 구성 요소 확인 또한 되었다.
따라서, 탭 태그 정화 단백질 복합물의 고립 및 후속 대량 spectrometric 분석12상호 작용 파트너의 식별에 대 한 효율적인 방법입니다. 탭 태그 이루어져 있다 두는 담배 calmodulin 바인딩 펩 티 드 (CBP)에서 구분 하는 IgG 바인딩 반복 에칭 바이러스 (TEV) 효소 분열 사이트. IgG 선호도 정화 단계 구성 된 원래 방법 TEV 분열 및 후속 calmodulin 친화성 크로마토그래피 허용 크고 높은 순수 단백질 단지13,14 의 네이티브 정화 . 우리 절차를 단순화 하 고는 포함 하는 TOC159 단백질 복합물 수 또한 정화 차입15TEV 분열 뒤 IgG 선호도 정화 단계만을 사용 하 여 효율적으로 시연 했다. 우리의 경험에서는, calmodulin 선호도 단계 생략 높은 수익률을 귀착되 고 그러므로 낮은 풍부한 단백질에 대 한 적절 한 있을 수 있습니다.
간단히 말해서, 우리는 안정적인 유전자 변형 A. thaliana 설계 탭-TOC159 ppi2 (toc159 코 돌연변이)에 표현 하는 라인 배경 및 목차-TIC 복합물의 정화에 대 한 신뢰할 수 있는 원본으로 설립. 목차-TIC 복합 절연에 대 한 프로토콜 세제 무료 버퍼에서 공장 설비 재료의 균질으로 시작합니다. 원심, 후에 상쾌한 삭제 됩니다. 펠 릿 총 막 분수를 포함 하는 세제를 포함 하는 버퍼를 사용 하 여 solubilized 이다. 울트라-원심 분리 단계 후 상쾌한 solubilized 목차 TIC 복합물을 포함 하는 친 화력 정화에 대 한 IgG-수 지에 적용 됩니다. 여러 후 세척 단계, 차입은 실시 IgG 바인딩 도메인의 및 부드럽게 선택적으로 하류 다니엘을 TEV protease 포함 된 버퍼를 사용 하 여 기본 TOC159 포함 된 단지를 출시. TEV eluate 부 럽 또는 TOC15910,,1115의 상호 파트너를 식별 하는 질량 분석에 의해 직접 분석할 수 있습니다. 메서드 또한 TOC15915의 포스트 번역 상 수정 식별 하기 위해 사용 되었습니다. 미래에, 기본 TOC159 포함 된 단지 구조 연구 cryoelectron 현미경 검사 법을 사용 하 여 사용할 수 있습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:783px;" width="783">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:312px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:185px;">PanReac&#160; AppliChem</td>
			<td style="width:119px;">A0384</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Tris</td>
			<td style="width:185px;">Biosolve</td>
			<td style="width:119px;">0020092391BS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:312px;">Na2HPO4</td>
			<td style="width:185px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S7909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:312px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:185px;">PanReac&#160; AppliChem</td>
			<td style="width:119px;">A2946</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">NaCl</td>
			<td style="width:185px;">PanReac&#160; AppliChem</td>
			<td style="width:119px;">A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">NaF</td>
			<td style="width:185px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S1509</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">PMSF</td>
			<td style="width:185px;">PanReac&#160; AppliChem</td>
			<td style="width:119px;">A0999</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Plant protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:185px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P9599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Glycerol</td>
			<td style="width:185px;">PanReac&#160; AppliChem</td>
			<td style="width:119px;">A0970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Triton X100</td>
			<td style="width:185px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">10789704001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Glycine</td>
			<td style="width:185px;">PanReac&#160; AppliChem</td>
			<td style="width:119px;">A1067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">EDTA</td>
			<td style="width:185px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:119px;">8043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:185px;">PanReac&#160; AppliChem</td>
			<td style="width:119px;">A1101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">SDS</td>
			<td style="width:185px;">PanReac&#160; AppliChem</td>
			<td style="width:119px;">A0675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Bromophenol blue</td>
			<td style="width:185px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">B0126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">HCl</td>
			<td style="width:185px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">20252-290</td>
			<td>Corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Sucrose</td>
			<td style="width:185px;">PanReac&#160; AppliChem</td>
			<td style="width:119px;">A3935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:312px;">Murashige and Skoog medium with vitamins</td>
			<td style="width:185px;">Duchefa Biochemie</td>
			<td style="width:119px;">M0222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Phytoagar</td>
			<td style="width:185px;">Duchefa Biochemie</td>
			<td style="width:119px;">P1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Petri plate</td>
			<td style="width:185px;">Greiner Bio-one</td>
			<td style="width:119px;">639102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">1.5 mL microfuge tubes</td>
			<td style="width:185px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:119px;">72.706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Ethanol</td>
			<td style="width:185px;">Fisher chemical</td>
			<td style="width:119px;">E/0600DF/15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Filter paper&#160;</td>
			<td style="width:185px;">Whatman</td>
			<td style="width:119px;">10311804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Surgical tape</td>
			<td style="width:185px;">3M</td>
			<td style="width:119px;">1530-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:312px;">CNBr-Activated agarose beads (sepharose 4B)</td>
			<td style="width:185px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">17-0430-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Sintered glass filter</td>
			<td style="width:185px;">DURAN</td>
			<td style="width:119px;">2515703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Centrifuge tube 50 mL</td>
			<td style="width:185px;">TPP</td>
			<td style="width:119px;">91050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Purified immunoglobulin G (HsIgG)</td>
			<td style="width:185px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:119px;">855908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Rotating shaker</td>
			<td style="width:185px;">IKA</td>
			<td>4016000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:312px;">NaN3 (sodium azide)</td>
			<td style="width:185px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">71290</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Quick filtration material (Miracloth)</td>
			<td style="width:185px;">Merk-Millipore</td>
			<td style="width:119px;">475855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Ultracentrifube XNP-80</td>
			<td style="width:185px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">A99839</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Rotor SW 32 Ti</td>
			<td style="width:185px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">369650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Ultracentrifuge tubes</td>
			<td style="width:185px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">326823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Glass teflon homogenizer (Potter)</td>
			<td style="width:185px;">Wheaton</td>
			<td style="width:119px;">357426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Spin column (Mobicol)</td>
			<td style="width:185px;">Mo Bi Tec</td>
			<td style="width:119px;">M1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Filter 35&#181;m for spin column (Mobicol)</td>
			<td style="width:185px;">Mo Bi Tec</td>
			<td style="width:119px;">M513515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">AcTEV</td>
			<td style="width:185px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">12575-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Centrifugal evaporator (Speed Vac)</td>
			<td style="width:185px;">Eppendorf</td>
			<td>5305000100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">FBN1A(PGL35) antibody</td>
			<td style="width:185px;">AgriSera</td>
			<td>AS06 116</td>
			<td>RRID:AB_2247012</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sand, Fontainebleau</td>
			<td style="width:185px;">VWR</td>
			<td>27460.295</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

affinity purification of chloroplast translocon protein complexes using the tap tag

엽록체 속에는 plastid 핵 인코딩 단백질의 수천의 가져오기를 필요합니다. 이 단백질의 가져오기 외부 (TOC)와 내부 (TIC) 엽록체 막에서 translocon에 따라 달라 집니다. 목차 및 TIC 단지 multimeric 이며 아마 아직 알 수 없는 구성 요소를 포함. 필드에 주요 목표 중 하나 목차 및 TIC 부품의 전체 인벤토리를 구축 하는 것입니다. 목차-TIC 단지의 절연 및 새로운 구성 요소 식별을 위한 TOC159 되었습니다 preprotein 수용 체 N 말기 탭 TOC159에서 결과 협동 선호도 정화 (꼭지) 태그를 추가 하 여 수정. 탭-태그 두 순차 선호도 정화 단계 위한 것 이다 (그러므로 "탠덤 선호도"). N 맨끝 IgG-바인딩 도메인 calmodulin 바인딩 펩 티 드 (CBP)에 의해 포도 상 구 균 단백질 (ProtA) 뒤에서 파생 된 이러한 연구에 사용 된 탭 태그에 의하여 이루어져 있다. 이러한 두 가지 선호도 태그 사이 담배 바이러스 (TEV) 효소 분열 엣지 사이트 포함 되었습니다. 따라서, TEV 프로 테아 제 바인딩 IgG 구슬에 후 TOC159 포함 된 단지의 부드러운 차입에 대 한 사용할 수 있습니다. 여기에 제시 된 프로토콜에서 두 번째 Calmodulin 선호도 정화 단계 생략 되었다. 정화 프로토콜 준비 및 총 세포 막의 가용 화와 함께 시작합니다. 세제-치료 후 solubilized 막 단백질 탭 TOC159 포함 된 단지의 immunoisolation에 대 한 IgG 구슬 알을 품는. 바인딩 및 광범위 한 세척, 탭-TOC159 포함 하 단지 죽 습 고 미 균 IgG-바인딩 도메인 제거에 의하여 TEV 프로 테아 제를 사용 하 여 IgG 구슬에서 발표. 서 부는 절연 blotting TOC159 포함 된 단지 사용할 수 있습니다 알려진 또는 의심 목차와 콩 단백질의 존재를 확인 하. 더 중요 한 것은, TOC159 포함 된 단지 사용 되었습니다 성공적으로 목차와 TIC 단지의 새로운 구성 요소를 식별 하는 질량 분석에 의해. 선물이 잠재적으로 프로토콜 어떤 막-바인딩 단백질의 효율적인 절연을 복잡 한 질량 분석에 의해 아직 알 수 없는 구성 요소 식별에 사용할 수 있습니다.

우리는 여기 유전자 변형 A. thaliana 에서 복잡 한 탭 태그 엽록체 봉투 단백질의 정화에 대 한 프로토콜을 설명 식물. 그림 1A같이 식물을 표현 하는 35S:NTAP-TOC159 구문 식물 35S:NTAP 구문 표현 컨트롤으로 사용 했다이 복잡 한 격리 하는 데 사용 했다. 그림 1 B 는 질량 분석 상호 작용 단백질의 식별 수 있도록 다음 탭 TOC159 단백질 복합물의 정화의 세부 단계를 보여 줍니다. Immunoblot 분석 (그림 2, 오른쪽) 격리 탭-TOC159 TOC75와 TOC33의 목차 복잡 한 상호 작용을 확인 합니다. 엽록체 외부 막 키 KOC1 TOC159 또한 탭 TOC159 복잡 한 (그림 2B, 오른쪽)와 함께 공동 절연 phosphorylate 알려져. TIC110의 존재 고립 된 탭 TOC159 복잡 한 TIC 복합 구성 요소 포함을 보여준다. FBN1A 항 체 단백질 가져오기 무관 plastoglobule 단백질에 대 한 발생 오염 결핍을 나타내는 탭 TOC159 복잡 한을 인식 하지 않았다. 부정적인 통제에서 immunoprecipitated NTAP 단백질 목차-콩 단백질 (그림 2, 왼쪽)의 공동 격리 하지 않았다 고 탭 TOC159 정화의 특이성을 확인 합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58532/58532fig1.jpg"> 그림 1 . 구문 및 선호도 정화 절차의 계획. (A).는 35S:NTAP-TOC159 NTAP TOC159 인코딩 구조는 안정적으로 애기 thaliana표현. 네거티브 제어 식물 인코딩 탭-태그 혼자 35S:NTAP 구문 표현. (B). 막 분리 및 가용 화, IgG agarose 면역-정화, 세척, TEV protease 절단, 차입의 단계 현명한 선호도 정화 프로토콜 구성. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58532/58532fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58532/58532fig2.jpg"> 그림 2 . TOC159 단백질의 탠덤 친 화력 정화. N-말기 탭 태그 TOC159 NTAP-TOC15에서 순화 했다:ppi2 애기 식물과 탭 탭: WT 식물에서 순화 하는 단백질은 부정적인 컨트롤으로 사용 되었다. 총 단백질 추출 물 (T), solubilized 막 단백질 = 부하 분수 (L), (피트)을 통해 먼저 하 고 마지막 세척 분수 (W1 및 W6)와 TEV eluate의 10%는 서쪽 blotting에 의해 분석 되었다. 멤브레인 TOC159에 대 한 항 체와 함께 조사 했다 (AT4G02510), TOC75 (AT3G46740), TOC33 (AT1G02280), KOC1 (AT4G32250), TIC110 (AT1G06950), 및 FBN1A (AT4G04020). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58532/58532fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>버퍼의 테이블</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>커플링 버퍼</td>
			<td>NaHCO3 조정 pH 8.5 0.1 m M 나2CO3 pH 조정
</td>
			<td>100 m m 
			 </td>
		</tr>
<tr>
<td>버퍼를 차단</td>
			<td>트리 스-HCl HCl로 pH 8로 조정 합니다.</td>
			<td>100 m m 
			 </td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS 버퍼</td>
			<td>나2HPO4 KH2PO4 NaCl KCl HCl로 pH 7.3으로 조정 됩니다.</td>
			<td>4.3 m m 1.4 m m 137 2.7 
			 </td>
		</tr>
<tr>
<td>NaCl 버퍼 커플링</td>
			<td>커플링 버퍼 NaCl</td>
			<td>  1 M</td>
		</tr>
<tr>
<td>버퍼를 연 삭 X 2</td>
			<td>Tris HCl, HCl로 pH 7.5 NaCl NaF PMSF 공장 프로 테아 제 억제 물 칵테일</td>
			<td>100 m m 200 mM 5 mM 1mm 0.20%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Solubilisation 솔루션 X 4</td>
			<td>글리세롤 트리톤 X100</td>
			<td>40% 3%</td>
		</tr>
<tr>
<td>버퍼 A</td>
			<td>  버퍼를 연 삭 X 2 버퍼를 갈기 X 1 Solubilisation 솔루션 X 4</td>
			<td>100 ml 50 ml 25 ml 25%</td>
		</tr>
<tr>
<td>TEV 차입 버퍼</td>
			<td>HCl로 pH 8 Tris HCl EDTA, HCl로 pH 8 NaCl 글리세롤 트리톤 X100 DTT</td>
			<td>50 mM 0.5 m m 100 m m 10% 0.75% 1mm</td>
		</tr>
<tr>
<td>SDS 페이지 로드 x 2 버퍼</td>
			<td>HCl와 Tris HCl pH 6.8 SDS 글리세롤 Bromophenol 블루 DTT</td>
			<td>0.1 M 4% 20% 0.20% 0.2 M</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1입니다. 버퍼 조리법입니다.

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Affinity Purification of Chloroplast Translocon Protein Complexes Using the TAP Tag

여기 선물이 엽록체의 정화에 대 한 검증 및 테스트 프로토콜 가져오기 단백질 복합물 (복잡 한 TIC TOC) 탭-태그를 사용 하 여. 1 단계 선호도 격리 프로토콜 잠재적으로 어떤 단백질에 적용 될 수 있습니다 그리고 질량 분석에 의해 새로운 상호 파트너를 식별 하는 데.

탭 태그를 사용 하 여 엽록체 Translocon 단백질 복합물의 친 화력 정화

Chloroplast biogenesis requires the import of thousands of nucleus-encoded proteins into the plastid. The import of these proteins depends on the ...

이 방법은 엽록소세포 분야에서 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다, 예를 들어, 엽록체 단백질 수입 기계의 조성. 그것은 녹색과 광합성에 필수적이며, 따라서 지구상식량 생산을 위해서이다. 분자 기계는 TOC 및 TIC라고 불리는 엽록소의 외부 및 내부 부재내의 두 개의 별도 복합체로 구성되지만 조성물은 완전히 알려져 있지 않다.이 기술의 주요 장점은 아라비도시스 TOC/TIC 복합체의 정제가 단일 단계 정화 방법, TAP-TOC 정제로 달성될 수 있다는 것입니다. 그것은 구체적이고 효율적인 방법입니다. 일반적으로, 이 방법에 새로운 연구원은 엽록세막 분수, 세제, 용용화 또는 친화성 정화의 격리에 익숙하지 않기 때문에 투쟁할 수 있습니다.아라비독시스 식물을 준비한 후, 차가운 박격포를 사용하여 액체 질소로 3주 된 묘목 10그램을 갈아서 모래로 유봉합니다. 20 밀리리터의 냉간 분쇄 버퍼를 분쇄 조직에 추가합니다. 잘 섞어서 혼합물을 얼음 위에 해동시키세요.다음으로, 분쇄 버퍼와 빠른 여과 재료의 두 층을 담그십시오. 여과 재료의 두 층을 통해 균질을 50 밀리리터 원심 분리 튜브로 필터링합니다. 10분 동안 섭씨 4도에서 1, 500g의 필기를 원심분리하고 상류물을 신선하고 미리 냉각된 50밀리리터 원심분리튜브로 옮긴다.동일한 조건에서 원심분리를 한 번 더 반복합니다. 상체를 차가운 38.50 밀리리터 초원심분리기 튜브로 옮기고 차가운 분쇄 버퍼로 최대 35밀리리터까지 위로 올려다보십시오. 초원심분리기를 사용하여 샘플을 100, 000배, 섭씨 4도에서 1시간 동안 원심분리합니다.유리 테플론 균질화제를 사용하여 분쇄 버퍼에서 녹색 펠릿을 다시 놓습니다. 원심분리기는 1시간 동안 100g, 000배, 섭씨 4도에 달하며 상신기를 폐기합니다. 유리 Teflon 균질화제를 사용하여 1x 연삭 버퍼의 18.75 밀리리터에서 녹색 펠릿을 다시 재생합니다.그런 다음 하나의 x 연삭 버퍼의 또 다른 9.375 밀리리터를 추가합니다. 4x 용용화 솔루션의 9.375 밀리리터를 추가하여 최종 볼륨을 37.5 밀리리터로 가져오고 30분 동안 섭씨 4도의 회전 셰이커에 배양합니다. 그 후 초원심분리기를 사용하여 샘플을 100, 000배, 섭씨 4도에서 1시간 동안 원심분리합니다.용해된 멤브레인을 포함하는 상체를 신선한 50 밀리리터 원심 분리튜브로 옮기. IGG 아가로즈 수지를 준비한 후, 이전에 세척된 IGG 아가로즈 수지들을 용해막 37.5밀리리터를 함유한 50밀리리터 원내 튜브로 이송한다. 섭씨 4도에서 회전 셰이커에 밤새 배양.다음 날, 퇴적물 IGG 아가로즈 수지는 100배, 섭씨 4도에서 5분간. 파이펫을 사용하여 상퍼를 제거합니다. IGG 아가로즈 수지37.5 밀리리터의 완충 A를 10분 동안 실온에서 회전 셰이커에 배양하였다.텍스트 프로토콜에 설명된 대로 침전및 세척을 계속합니다. 그 후 IGG 아가로즈 수지를 35 마이크론 필터로 500 마이크로리터 스핀 컬럼으로 옮긴다. 구슬을 TEV 용출 버퍼 300마이크로리터로 두 번 세척하여 평형을 위해 세척합니다.다음으로, TEV 용출 버퍼의 300 마이크로 리터를 추가 TEV 프로테아제 10 마이크로 리터를 포함. 스핀 컬럼을 온도 16도, 350 rpm에서 2시간 동안 Thermomixer에 구슬로 배양합니다. 그런 다음 스핀 컬럼을 열고 새롭고 깨끗한 1.5 밀리리터 튜브에 놓습니다.이 튜브를 100배, 섭씨 4도에서 5분간 회전하여 용액을 채집합니다. 이 연구에서는 형질전환 A.thaliana 식물로부터 TAP 태그 엽록소 봉투 단백질 복합체가 정제된다. 면역블롯 분석은 TAP-TOC159를 격리하여 TOC 컴플렉스의 TOC75 및 TOC33과 상호 작용하는 것을 확인합니다.인광TOC159로 알려진 엽록혈성 외막 키나아제, KOC1도 공동 분리된다. TIC110의 존재는 격리 된 TAP-TOC159 단지가 TIC 복합체의 구성 요소를 포함하고 있음을 보여줍니다. FBN1A 항체는 TAP-TOC159 복합체를 인식하지 못하여 오염이 없다는 것을 나타냅니다.음의 대조군에서, 면역 침전된 NTAP 단백질은 TOC, TIC 단백질중 어느 한 쪽과 공동 분리되지 않았으며 TAP-TOC159 정제의 특이성을 확인하였다. 이 방법은 엽록소 단백질 수입에 대한 통찰력을 제공 할 수 있지만, 잠재적으로 아라비도시스 탈리아나 병 시스템의 다른 복합체에 적용 될 수있다. 이 절차에 따라, 알려진 구성 요소의 존재를 입증하거나 TOC 및 TIC 복합체의 새로운 구성 요소를 식별하기 위해 서부 블로팅 또는 질량 분석과 같은 다른 방법을 적용 할 수 있습니다.이 기술은 TOC 및 TIC 복합체의 새로운 성분의 기능을 탐구하기 위해 엽록소 단백질 수입 분야에서 연구를 위한 길을 열었습니다.

Research

Education

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Cell Biology

Biochemistry

Unit 1

Intracellular Compartments and Protein Sorting

SCIENTISTS IN ACTION

Isolation of Cognate RNA-protein Complexes from Cells Using Oligonucleotide-directed Elution

올리고 뉴클레오티드 지시 용출을 사용하여 세포에서 동족 RNA 단백질 단지의 분리

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. ...

연구

생화학

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Cryomilled 포유 동물 세포에서 단백질 단지 선호도 캡처

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

진핵 세포에서 단백질 복합체의 탠덤 선호도 정화

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Identification of Plant Ice-binding Proteins Through Assessment of Ice-recrystallization Inhibition and Isolation Using Ice-affinity Purification

식물은 아이스 친화 정제를 사용하여 얼음의 재결정 억제 및 절연의 평가를 통해 단백질을 아이스 결합의 식별

Ice-binding proteins (IBPs) belong to a family of stress-induced proteins that are synthesized by certain organisms exposed to subzero temperatures. In ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

블루 기본 페이지와 단백질 상관 관계 프로파일 링에 의한 선호도 정제 단백질 복합체 해결

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

Proximity Ligation Assay를 이용한 현탁 세포 배양에서의 DNA 손상 유발 단백질 복합체의 검출 및 가시화

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Rab10 인 산화 탐지 LRRK2 활동 인산 염-바인딩 태그와 SDS 페이지를 사용 하 여

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 1: 원스텝 단백질 단백질과 단백질 대사 산물 단지의 병렬 분석에 대 한 친 화력 정화

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Preparation of Chloroplast Sub-compartments from Arabidopsis for the Analysis of Protein Localization by Immunoblotting or Proteomics

단백질 지 방화 Immunoblotting 또는 단백질의 분석에 대 한 애기에서 엽록체 하위 구획의 준비

Chloroplasts are major components of plant cells. Such plastids fulfill many crucial functions, such as assimilation of carbon, sulfur and nitrogen as ...