Name: affinity purification of chloroplast translocon protein complexes using the tap tag
Uploaded: 2018-11-01T15:00:00
Duration: 7 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Affinity Purification of Chloroplast Translocon Protein Complexes Using the TAP Tag at JoVE.com

O trabalho foi apoiado por concessões do Swiss National Science Foundation (31003A_156998 e 31003A_176191) e da Universidade de Neuchâtel.

1. preparação das plantas de Arabidopsis
<ol><li>Preparar 1 L de metade da força de Murashige e Skoog (MS) médio incluindo vitaminas com 1% de sacarose e ajustar o pH a 5.7 com hidróxido de potássio (KOH). Adicionar 0,8% de phytoagar e autoclave por 20 min a 120 ° C.</li>
	<li>Despeje 75 mL de meio MS por placa de Petri (diâmetro de 14,5 cm, altura 3 cm) e permitir que a solidificação por 1h.</li>
	<li>Adicionar 30 mg de Arabidopsis thaliana sementes para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e superfície esterilizar com etanol a 70% (v/v) contendo 0,05% (v/v) Triton X-100 por 5 min, seguido por 100% de etanol (v/v) por 10 min. Retire o etanol.</li>
	<li>Transferi as sementes para o papel de filtro estéril para secar. Polvilhe as sementes esterilizadas uniformemente em uma placa de MS (cada genótipo requer placas de pelo menos 8-10) e cada placa com fita cirúrgica do selo.</li>
	<li>Incube as placas a 4 ° C durante dois dias no escuro para sincronizar a germinação das sementes. Transferência para uma câmara de crescimento com o seguinte ciclo de luz: 8 h de 120 µmol m− 2 s− 1 luz e 16 h de dark 22-20 ° c.</li>
</ol>2. preparação dos grânulos de HsIgG Agarose
<ol><li>Suspender contas de agarose ativada por CNBr (4 g) em 100 mL de HCl de 1 mM e incube por 30 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Transferir os grânulos de agarose em um filtro de vidro sinterizado, lavar sob vácuo com 100 mL de HCl a 100 mM e repita 2 - 3 vezes. Nota: Precool a solução de lavagem de 4 ° C.</li>
	<li>Ressuspender o grânulos de agarose em 1 mL de HCl frio de 100 milímetros e transferir para um tubo de centrifuga conico de 50 mL. Lavar o filtro de vidro sinterizado com 3 mL de HCl a 100 mM e transferir o líquido para o tubo mesmo.</li>
	<li>Girar a 400 × g por 5 min a 4 ° C e remover o sobrenadante com uma pipeta. Nota: Não decante o tubo.</li>
	<li>Resuspenda as gotas em 50 mL de tampão de ligação (tabela 1); Misture rapidamente e então giram em 400 × g por 5 min a 4 ° C.</li>
	<li>Dissolver 50 mg de liofilizado Homo sapiens IgG (Hs-IgG) em 10 mL de tampão de ligação, misture-os delicadamente os grânulos de agarose e incubar em agitador rotativo durante a noite a 4 ° C.</li>
	<li>Girar a 400 × g por 5 min a 4 ° C e remover o sobrenadante com uma pipeta.</li>
	<li>Lave os grânulos de IgG-agarose com 50 mL de acoplamento buffer e girar a 400 × g por 5 min a 4 ° C.</li>
	<li>Resuspenda os grânulos de IgG-agarose com 50 mL de tampão de bloqueio (tabela 1) e girar a 400 × g por 5 min a 4 ° C. Repeti uma vez.</li>
	<li>Resuspenda IgG-agarose grânulos em 50 mL de tampão de bloqueio, gire a mistura por 2 h no RT e girar a 400 × g por 5 min a 4 ° C.</li>
	<li>Remover o sobrenadante e ressuspender os grânulos de IgG-agarose em 200 mL de tampão de ligação de NaCl (tabela 1).</li>
	<li>Para bloquear qualquer restantes grupos de CNBr do cross-linking, lave os grânulos de IgG-agarose com 100 mL de HCl glicina 0,1 M, pH 2.8. Girar a 400 × g por 5 min a 4 ° C e remover o sobrenadante. Lavar com 0,2 M glicina-HCl, pH 2.8, girar a 400 × g por 5 min a 4 ° C e remover o sobrenadante. Finalmente, lave os grânulos de IgG-agarose com 200 mL de água ultrapura.</li>
	<li>Lave os grânulos de IgG-agarose com 200 mL de água ultrapura e, em seguida, 200 mL de tampão PBS (tabela 1).</li>
	<li>Resuspenda os grânulos de IgG-agarose em 20 mL de tampão PBS com 0.01% NaN3 (azida sódica) e armazenar a 4 ° C.</li>
</ol>3. isolamento e solubilização da fração de membrana
<ol><li>Moa 10 g de plântulas da . thaliana três semanas de idade em nitrogênio líquido, usando um pilão frio com areia.</li>
	<li>Adicionar 20 mL de frio retificadora Reserva (tabela 1) 10 g de tecido do chão, misture bem e descongele no gelo.</li>
	<li>Filtre o homogenate através de duas camadas de material de filtração rápida em um tubo de centrifuga conico de 50mL. Mergulhe o material de filtração rápida com moagem buffer antes da filtragem.</li>
	<li>Centrifugador do filtrado durante 10 minutos a 1.500 × g a 4 ° C e transferência o sobrenadante para um tubo de centrifuga conico 50ml refrigerados, repita o mesmo passo mais uma vez e recolher o sobrenadante. Uma amostra de 200 µ l da fração"total" de reter e armazenar a-80 ° C para posterior análise</li>
	<li>Transferir o sobrenadante para tubos de se frio 38,50 mL e superior a 35 mL com buffer moagem a frio. Centrífuga para 1h a 100.000 × g a 4 ° C em uma se.</li>
	<li>Transferi o sobrenadante para um tubo de centrifuga conico de 50 mL. Manter uma amostra de 200 µ l da "fração solúvel" e loja a-80 ° C para posterior análise.</li>
	<li>Ressuspender o pellet verde usando um homogeneizador de teflon de vidro, no buffer de moagem. Centrifugue durante 1 h a 100.000 × g a 4 ° C em um se e descartar o sobrenadante.</li>
	<li>Ressuspender o verde em 18,75 mL de 1x Buffer usando um homogeneizador de teflon vidro de moedura e adicionar 9,375 mL de 1x tampão de moagem.</li>
	<li>Adicionar 9,375 mL de solução de x solubilisation 4 (tabela 1) (contendo o detergente TX-100) para dar a 37,5 mL e incubar durante 30 min num "agitador rotativo" a 4 ° C.</li>
	<li>Centrífuga para 1h a 100.000 × g a 4 ° C em uma se. Transferi o sobrenadante para um tubo de centrifuga conico de 50 mL. Manter uma amostra de 200 µ l do sobrenadante (futuro "fração de carga") e loja a-80 ° C para posterior análise.</li>
	<li>Resuspenda o pellet em 37,5 mL de tampão de moagem. Manter a amostra da parte insolúvel e loja a-80 ° C</li>
</ol>4. imunoprecipitação
<ol><li>Equilibrar a 100 µ l de resina embalada IgG-agarose no tampão A (tabela 1) e girar a 100 × g por 5 min a 4 ° C.</li>
	<li>Remover o sobrenadante e ressuspender a resina de IgG-agarose em 100 µ l de tampão A 4 ° c.</li>
	<li>Transferir a resina de IgG-agarose lavada para a 37,5 mL de membranas solubilizadas e incubar durante uma noite num agitador rotativo em um tubo de centrifuga conico de 50 mL a 4 ° C.</li>
	<li>Sedimentos o IgG-agarose da resina em 100 × g por 5 min a 4 ° C e remover o sobrenadante com uma pipeta. Manter uma amostra de 200 µ l da "fluir" e armazenar a-80 ° C para posterior análise.</li>
	<li>Lave a resina de IgG-agarose em 37,5 mL de tampão A e incubar durante 10 minutos num agitador rotativo.</li>
	<li>Sedimentos a resina de IgG-agarose em 100 × g por 5 min a 4 ° C, remover o sobrenadante com uma pipeta, adicionar 5 mL de moagem tampão A um tubo de centrífuga de 15 mL e centrifugar 100 × g, 4 ° C, 5 min. reter um 200 µ l da amostra da "Lavagem de 1" e armazenar a-80 ° C para uma análise posterior.</li>
	<li>Repetir os 5 mL passo três vezes com Buffer A. de lavagem</li>
	<li>Realizar as duas últimas etapas de lavagem sem os inibidores (NaF, inibidor de Protease e PMSF) Nota: Inibidores já não são necessários nesta fase e omitidos para reduzir o custo. Manter uma amostra de 200 µ l da última lavagem etapa "final lavagem (W6)" e loja a-80 ° C para posterior análise.</li>
	<li>Transferir a resina de IgG-agarose para uma coluna de rotação 500 µ l com um 35 µm filtro e lave os grânulos duas vezes com 300 µ l de tampão de eluição do PEV (tabela 1) (não contendo AcTEV) para o equilíbrio. Feche a coluna de rotação.</li>
	<li>Adicione 300 µ l de tampão de eluição de TEV contendo 50 unidades (10 µ l) de AcTEV. Prepare a mistura em um tubo antes de adicionar à resina.</li>
	<li>Incubar a coluna de rotação com grânulos em um thermomixer a 16 ° C, 350 rpm por 2 h. inverter a coluna suavemente várias vezes cada 30 min.</li>
	<li>Abra a coluna giro, colocá-lo em um novo tubo limpo 1,5 mL e a rotação em 100 × g por 5 min a 4 ° C, para recolher o eluato.</li>
	<li>Seca (por exemplo) 10% (v/v) da amostra eluted (~ 25 µ l) em um evaporador centrífugo e usar para espectrometria de massa ou outra uma análise mais aprofundada.</li>
	<li>Alíquota o eluato restante (~ 275 µ l) dividido em onze centrífuga 1,5 mL tubos (25 µ l cada), secar em um evaporador centrífugo e armazenar a-80 ° C.</li>
	<li>Analise as amostras mantidas durante todo o procedimento, bem como os eluídos pelo padrão de SDS-PAGE seguido immunoblotting. Para a preparação da amostra, precipitado de 50 µ g do Total (T), carga (L), fluxo (FT), lavar 1 (W1) e 200 µ l de lavagem 6 (W6) pela extração de clorofórmio/metanol16.</li>
	<li>Adicione 10 µ l de 2x do amortecedor do carregamento de SDS-PAGE (tabela 1) para as amostras precipitadas e 25 µ l de amostra seca eluted. Vórtice e ferver durante 10 minutos a 95 ° C, em um bloco de calor.</li>
	<li>Analisar Total (T), carga (L), fluxo (FT) através de lavagem 1 (W1), lavar 6 (W6) e eluição (E) pelo immunoblotting utilizando anticorpos anti-TOC159 para determinar a eficiência do processo de isolamento.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Jarvis, P., L&#243;pez-Juez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+and+homeostasis+of+chloroplasts+and+other+plastids.">Biogenesis and homeostasis of chloroplasts and other plastids.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 787-802 (2013).</li><li>Kessler, F., Schnell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloroplast+biogenesis:+diversity+and+regulation+of+the+protein+import+apparatus.">Chloroplast biogenesis: diversity and regulation of the protein import apparatus.</a> Current opinion in cell biology. 21 (4), 494-500 (2009).</li><li>Schnell, D. 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S., Chen, M., Cerny, R., Fromm, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+tandem+affinity+purification+tag+and+methods+for+isolation+of+protein+heterocomplexes+from+plants.">Improved tandem affinity purification tag and methods for isolation of protein heterocomplexes from plants.</a> The Plant journal. 38 (1), 172-181 (2004).</li><li>Rohila, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interactions+of+tandem+affinity+purified+protein+kinases+from+rice.">Protein-protein interactions of tandem affinity purified protein kinases from rice.</a> PloS one. 4 (8), 6685 (2009).</li><li>Agne, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acidic+A-domain+of+Arabidopsis+TOC159+occurs+as+a+hyperphosphorylated+protein.">The acidic A-domain of Arabidopsis TOC159 occurs as a hyperphosphorylated protein.</a> Plant physiology. 153 (3), 1016-1030 (2010).</li><li>Wessel, D., Flugge, U. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+quantitative+recovery+of+protein+in+dilute+solution+in+the+presence+of+detergents+and+lipids.">A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids.</a> Analytical biochemistry. 138 (1), 141-143 (1984).</li></ol>

Os autores declaram não interesses concorrentes.

Temos demonstrado que uma única etapa de purificação de marca de torneira é um método eficiente e específico para a purificação do complexo Arabidopsis TIC-TOC. Embora a TAP-tag permitiria duas etapas sucessivas de purificação (IgG-seguido de purificação da afinidade de calmodulina depois TEV protease-clivagem), acreditamos que, em muitos casos, o primeiro passo de afinidade, seguido por clivagem de protease TEV serão suficiente. Nosso alvo, TOC159, é baixo o abundante e a inclusão da segunda etapa calmodulina-afinidade diminuída excessivamente o rendimento de proteína, que foi a principal razão para excluí-lo do nosso presente protocolo. O PEV-eluição em si é uma etapa de purificação altamente específico e suave que só vai liberar o alvo com a TAP-tag juntamente com os parceiros de interação associado enquanto contaminar as proteínas degola não especìfica para a resina de IgG permanecerá lá. Assim, em combinação com a etapa de IgG-afinidade, a eluição de TEV resulta em uma purificação suficientemente eficiente para nosso e provavelmente muitos outros fins.
Cuidado deve ser tomado que a construção com a TAP-tag é totalmente funcional em vivo. TOQUE de marcação poderia ter efeitos potencialmente deletérios na atividade da proteína, a estabilidade ou a localização. TOC159 consiste em três domínios, o domínio de ácido N-terminal, o domínio de GTP-ligando central e domínio C-terminal da membrana, que ancora TOC159 no exterior cloroplasto membrana2. Para evitar potenciais interferências com inserção de membrana, nós fundidos a TAP-tag para o N-terminal da TOC159. Fusão de N-terminal é bastante a exceção que a regra. Muitas proteínas contêm informações de direcionamento de N-terminal e, portanto, devem por a tag no C-terminal. Estamos garantido que TOC159 é funcional na vivo pela complementação do mutante ppi2 (um mutante de albino falta TOC159) com torneira-TOC159. O resgate do verde, o fenótipo tipo selvagem indicou que a TAP-TOC159 era funcional15.
O protocolo de purificação foi usado para identificar novos parceiros de interação de TOC159, que incluiu KOC1 e TIC5610,11. No total, cerca de 30 proteínas foram associadas com o complexo, sugerindo que a interação nova parceiros serão isolados e caracterizados em um futuro próximo. Enquanto é altamente recomendável a TAP-tag para purificação complexa, gostaríamos ainda de salientar que versões adicionais para aquele apresentado aqui existem e podem ser muito útil para algumas aplicações.

As plantas dependem de cloroplastos para fotossíntese e crescimento photoautotrophic1. A grande maioria das proteínas do cloroplasto é codificada no núcleo, sintetizada no citosol e importada para o cloroplasto através dos complexos TIC e TOC no envelope membranas2. O núcleo do complexo do TOC consiste no canal de proteína-realização de Toc75 e dos dois receptores GTPases Toc33 e Toc1593,4,5. TOC159 é essencial para a biogênese de cloroplastos e Medeia a acumulação maciça de proteínas associadas a fotossíntese6. O complexo TIC consiste no canal de proteína-realização de TIC20, bem como TIC110 e TIC407,8. Recentemente, uma translocação de proteínas 1MD complexa na membrana interna do envelope foi isolada e continha componentes inéditas9, um dos quais era TIC56. Estamos isolados recentemente co TIC56 a 1 MDA complexo usando o protocolo de purificação de afinidade de torneira-TOC159. Os dados indicaram uma sobreposição estrutural entre os complexos TOC/TIC "canônicos" e o 1 complexo MDa10. Anteriormente desconhecidos componentes como KOC1 também foram identificados como novos parceiros de interação dos TOC e TIC complexos usando o TAP-método descrito aqui10,11.
Assim, a purificação de torneira-marca é um método eficiente para o isolamento de complexos de proteínas e a identificação de parceiros interagindo por subsequente análise de espectrometria de massa12. A TAP tag consiste em duas repetições de ligação de IgG separadas um calmodulina-ligação do peptide (CBP) por um tabaco etch local de clivagem de protease de vírus (TEV). O método original, que consiste de uma etapa de purificação de IgG-afinidade seguido por clivagem do PEV e cromatografia de afinidade-calmodulina subsequentes permitido nativa purificação da proteína altamente puro e grandes complexos13,14 . Nós temos o procedimento simplificado e demonstrou que os complexos de proteína que contêm TOC159 também podem ser purificados com eficiência usando somente a etapa de purificação de IgG-afinidade seguida de TEV-clivagem por eluição15. Em nossa experiência, a omissão da etapa de calmodulina-afinidade resultou em rendimentos mais elevados e, portanto, pode ser apropriada para proteínas de baixa abundância.
Em suma, temos engenharia transgênica estável a. thaliana linhas expressando TAP-TOC159 no ppi2 (toc159 KO mutante) fundo e estabeleceu como uma fonte confiável para a purificação de complexos de TIC-TOC. O protocolo para o isolamento do complexo TIC-TOC começa com a homogeneização do material vegetal em um buffer livre de detergente. Após a centrifugação, o sobrenadante é Descartado. A pelota que contém a fração do total da membrana é solubilizada usando um buffer contendo detergente. Após uma etapa de ultracentrifugação, o sobrenadante contendo complexos de TIC-TOC solubilizados é aplicado à IgG-resina para purificação da afinidade. Depois de várias etapas de lavagem, eluição é efectuada utilizando um buffer contendo protease TEV para seletivamente cleave a jusante dos domínios de IgG-vinculação e suavemente nativo TOC159 contendo complexos de lançamento. O eluato de PEV pode ser analisado diretamente pela mancha ocidental ou espectrometria de massa para identificar os parceiros de interação de TOC15910,11,15. O método também tem sido usado para identificar modificações borne-translational de TOC15915. No futuro, nativo TOC159 contendo complexos podem ser utilizados para estudos estruturais usando microscopia de cryoelectron.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:783px;" width="783">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:312px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:185px;">PanReac&#160; AppliChem</td>
			<td style="width:119px;">A0384</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Tris</td>
			<td style="width:185px;">Biosolve</td>
			<td style="width:119px;">0020092391BS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:312px;">Na2HPO4</td>
			<td style="width:185px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S7909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:312px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:185px;">PanReac&#160; AppliChem</td>
			<td style="width:119px;">A2946</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">NaCl</td>
			<td style="width:185px;">PanReac&#160; AppliChem</td>
			<td style="width:119px;">A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">NaF</td>
			<td style="width:185px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S1509</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">PMSF</td>
			<td style="width:185px;">PanReac&#160; AppliChem</td>
			<td style="width:119px;">A0999</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Plant protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:185px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P9599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Glycerol</td>
			<td style="width:185px;">PanReac&#160; AppliChem</td>
			<td style="width:119px;">A0970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Triton X100</td>
			<td style="width:185px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">10789704001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Glycine</td>
			<td style="width:185px;">PanReac&#160; AppliChem</td>
			<td style="width:119px;">A1067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">EDTA</td>
			<td style="width:185px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:119px;">8043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:185px;">PanReac&#160; AppliChem</td>
			<td style="width:119px;">A1101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">SDS</td>
			<td style="width:185px;">PanReac&#160; AppliChem</td>
			<td style="width:119px;">A0675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Bromophenol blue</td>
			<td style="width:185px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">B0126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">HCl</td>
			<td style="width:185px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">20252-290</td>
			<td>Corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Sucrose</td>
			<td style="width:185px;">PanReac&#160; AppliChem</td>
			<td style="width:119px;">A3935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:312px;">Murashige and Skoog medium with vitamins</td>
			<td style="width:185px;">Duchefa Biochemie</td>
			<td style="width:119px;">M0222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Phytoagar</td>
			<td style="width:185px;">Duchefa Biochemie</td>
			<td style="width:119px;">P1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Petri plate</td>
			<td style="width:185px;">Greiner Bio-one</td>
			<td style="width:119px;">639102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">1.5 mL microfuge tubes</td>
			<td style="width:185px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:119px;">72.706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Ethanol</td>
			<td style="width:185px;">Fisher chemical</td>
			<td style="width:119px;">E/0600DF/15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Filter paper&#160;</td>
			<td style="width:185px;">Whatman</td>
			<td style="width:119px;">10311804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Surgical tape</td>
			<td style="width:185px;">3M</td>
			<td style="width:119px;">1530-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:312px;">CNBr-Activated agarose beads (sepharose 4B)</td>
			<td style="width:185px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">17-0430-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Sintered glass filter</td>
			<td style="width:185px;">DURAN</td>
			<td style="width:119px;">2515703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Centrifuge tube 50 mL</td>
			<td style="width:185px;">TPP</td>
			<td style="width:119px;">91050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Purified immunoglobulin G (HsIgG)</td>
			<td style="width:185px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:119px;">855908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Rotating shaker</td>
			<td style="width:185px;">IKA</td>
			<td>4016000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:312px;">NaN3 (sodium azide)</td>
			<td style="width:185px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">71290</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Quick filtration material (Miracloth)</td>
			<td style="width:185px;">Merk-Millipore</td>
			<td style="width:119px;">475855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Ultracentrifube XNP-80</td>
			<td style="width:185px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">A99839</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Rotor SW 32 Ti</td>
			<td style="width:185px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">369650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Ultracentrifuge tubes</td>
			<td style="width:185px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">326823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Glass teflon homogenizer (Potter)</td>
			<td style="width:185px;">Wheaton</td>
			<td style="width:119px;">357426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Spin column (Mobicol)</td>
			<td style="width:185px;">Mo Bi Tec</td>
			<td style="width:119px;">M1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Filter 35&#181;m for spin column (Mobicol)</td>
			<td style="width:185px;">Mo Bi Tec</td>
			<td style="width:119px;">M513515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">AcTEV</td>
			<td style="width:185px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">12575-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Centrifugal evaporator (Speed Vac)</td>
			<td style="width:185px;">Eppendorf</td>
			<td>5305000100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">FBN1A(PGL35) antibody</td>
			<td style="width:185px;">AgriSera</td>
			<td>AS06 116</td>
			<td>RRID:AB_2247012</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sand, Fontainebleau</td>
			<td style="width:185px;">VWR</td>
			<td>27460.295</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

affinity purification of chloroplast translocon protein complexes using the tap tag

Biogênese cloroplasto requer a importação de milhares de proteínas codificadas núcleo para o plastídeo. A importação destas proteínas depende do translocon no exterior (TOC) e membranas de cloroplastos internas (TIC). Os complexos TOC e TIC são multiméricas e provavelmente contêm componentes ainda desconhecidos. Um dos principais objetivos no campo é estabelecer o inventário completo de componentes TOC e TIC. Para o isolamento de complexos de TIC-TOC e a identificação de novos componentes, o receptor preprotein que toc159 tem sido modificado N-terminal pela adição da marca de purificação (torneira) de afinidade em tandem resultando em TAP-TOC159. A TAP-tag destina-se a dois passos de purificação da afinidade sequencial (daí "afinidade em tandem"). A TAP-tag usada nestes estudos consiste de um domínio N-terminal IgG-ligação derivado de proteína de Staphylococcus aureus , um (ProtA) seguido por um calmodulina-ligação do peptide (CBP). Entre essas marcas de dois afinidade, um tabaco etch clivagem de protease do vírus (TEV) site foi incluído. Portanto, protease do PEV pode ser usado para a eluição suave de complexos contendo TOC159 após a ligação de IgG grânulos. O protocolo apresentado aqui, a segunda etapa de purificação de calmodulina-afinidade foi omitida. O protocolo de purificação começa com a preparação e solubilização das membranas celulares totais. Após o tratamento de detergente, as proteínas de membrana solubilizado são incubadas com grânulos de IgG para o immunoisolation de torneira-TOC159-contendo complexos. Mediante vinculação e lavagem extensa, TAP-TOC159 contendo complexos são clivados e liberados os grânulos de IgG usando a protease TEV, pelo qual o domínio de S. aureus IgG-ligação é removido. Mancha de isolados ocidental TOC159 contendo complexos podem ser usados para confirmar a presença de proteínas TOC e TIC conhecidas ou suspeitas. Mais importante, os complexos contendo TOC159 têm sido utilizados com sucesso para identificar novos componentes dos complexos TOC e TIC por espectrometria de massa. O protocolo que apresentamos potencialmente permite o isolamento eficiente de qualquer proteína de membrana-limite complexo para ser usado para a identificação dos componentes ainda desconhecidos por espectrometria de massa.

Descrevemos aqui um protocolo para a purificação de uma proteína de envelope de cloroplasto TAP-tag complexa de transgénicos a. thaliana plantas. Como mostrado na Figura 1A, plantas expressando a 35S:NTAP-TOC159 construção foram usadas para isolar este complexo enquanto plantas expressando a construção de 35S:NTAP foram usadas como um controle. Figura 1 B mostra as etapas detalhadas da purificação de complexos de proteínas TAP-TOC159 seguido por espectrometria de massa para permitir a identificação das proteínas de interação. A análise de immunoblot (Figura 2, lado direito) confirma que isolado TAP-TOC159 interage com TOC75 e TOC33 do complexo TOC. A quinase de membrana externa de cloroplasto KOC1 conhecido para fosforilar TOC159 co também isolado com o complexo de torneira-TOC159 (Figura 2B, lado direito). A presença de TIC110 revela que o complexo isolado de torneira-TOC159 também contém os componentes do complexo TIC. O anticorpo contra uma proteína de plastoglobule não relacionada com a importação de proteínas FBN1A não reconheceu o complexo TAP-TOC159, indicando a ausência de contaminações. No controle negativo, proteína NTAP immunoprecipitated não co isolar com qualquer das proteínas TIC-TOC (Figura 2, lado esquerdo) e confirma a especificidade da purificação TAP-TOC159.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58532/58532fig1.jpg"> Figura 1 . Esquema do processo de purificação da afinidade e construções. (A). O 35S:NTAP-TOC159 construção, codificação NTAP-TOC159 estàvel foi expressa em Arabidopsis thaliana. Plantas de controlo negativo expressaram a construção de 35S:NTAP, a TAP-tag sozinha de codificação. B. O protocolo de purificação de afinidade sábio passo consiste de membrana isolamento e solubilização, IgG agarose imuno-purificação, lavagens, clivagem de protease TEV e eluição. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58532/58532fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58532/58532fig2.jpg"> Figura 2 . Purificação de afinidade em tandem da proteína TOC159. N-terminal com a TAP-tag TOC159 foi purificado de NTAP-TOC15: plantasppi2 Arabidopsis e torneira proteína purificada a partir de plantas de torneira: WT foi usada como um controle negativo. Total de proteínas de membrana de extratos (T), solubilizados proteína = fração de carga (L), fluxo (FT), primeiro e último lavar fracções (W1 e W6) e 10% do eluato TEV foram analisados pela mancha ocidental. A membrana foi sondada com os anticorpos contra o TOC159 (AT4G02510), TOC75 (AT3G46740), TOC33 (AT1G02280), KOC1 (AT4G32250), TIC110 (AT1G06950) e FBN1A (AT4G04020). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58532/58532fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Tabela de buffers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Tampão de ligação</td>
			<td>NaHCO3 Ajustar para pH 8,5 ajustar o pH com 0,1 M Na2CO3
</td>
			<td>100 mM 
			 </td>
		</tr>
<tr>
<td>Bloqueio de Buffer</td>
			<td>Tris-HCl Ajuste o pH 8 com HCl.</td>
			<td>100 mM 
			 </td>
		</tr>
<tr>
<td>Tampão PBS</td>
			<td>Na2HPO4 KH2PO4 NaCl KCl Ajuste o pH 7.3 com HCl.</td>
			<td>4,3 mM 1.4 mM 137 2.7 
			 </td>
		</tr>
<tr>
<td>NaCl, tampão de ligação</td>
			<td>Tampão de ligação NaCl</td>
			<td>  1 M</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 x Buffer de moagem</td>
			<td>Tris-HCl, pH 7,5 com HCl. NaCl NaF PMSF Coquetel de inibidor de protease de planta</td>
			<td>100 mM 200 mM 5 mM 1 mM 0,20%</td>
		</tr>
<tr>
<td>4 x solução de solubilização</td>
			<td>Glicerol Triton-X100</td>
			<td>40% 3%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tampão A</td>
			<td>  2 x Buffer de moagem 1 x Buffer de moagem 4 x solução de solubilização</td>
			<td>100 ml 50 ml 25 ml 25%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Eluição de TEV Buffer</td>
			<td>Tris-HCl, pH 8 com HCl EDTA, pH 8 com HCl NaCl Glicerol Triton-X100 DTT</td>
			<td>50 mM 0.5 mM 100 mM 10% 0,75% 1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Buffer de 2 x carregamento SDS-PAGE</td>
			<td>Tris-HCl pH 6,8 com HCl SDS Glicerol Azul de bromofenol DTT</td>
			<td>0,1 M 4% 20% 0,20% 0,2 M</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1. Receitas do amortecedor.

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Affinity Purification of Chloroplast Translocon Protein Complexes Using the TAP Tag

Aqui apresentamos um protocolo testado e comprovado para a purificação do cloroplasto complexos de importação de proteínas (complexo de TIC-TOC) usando a torneira-tag. O protocolo de afinidade-isolamento de uma etapa potencialmente pode ser aplicado a qualquer proteína e ser usado para identificar novos parceiros de interação por espectrometria de massa.

Purificação da afinidade do cloroplasto Translocon proteínas complexos usando a marca de torneira

Chloroplast biogenesis requires the import of thousands of nucleus-encoded proteins into the plastid. The import of these proteins depends on the ...

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo do cloroplasto, por exemplo, a composição do maquinário de importação de proteínas cloroplastas. É essencial para o esverdeamento e fotossíntese e, portanto, para a produção de alimentos no planeta. A máquina molecular consiste em dois complexos separados no membro externo e interno do cloroplasto chamado TOC e TIC, mas a composição não é totalmente conhecida.A principal vantagem desta técnica é que a purificação do complexo Arabidopsis TOC/TIC pode ser realizada em um método de purificação de uma única etapa, purificação tap-toc. É um método específico e eficiente. Geralmente, pesquisadores novos neste método podem lutar porque não estão familiarizados com o isolamento de frações de membrana de cloroplasto, detergente, solubilização ou purificação de afinidade.Depois de preparar as plantas arabidopsis, triture 10 gramas de mudas de três semanas de idade em nitrogênio líquido, usando uma argamassa fria e pilão com areia. Adicione 20 mililitros de tampão de moagem a frio aos tecidos moído. Misture bem e deixe a mistura descongelar no gelo.Em seguida, mergulhe duas camadas de material de filtragem rápida com tampão de moagem. Filtre o homogeneizar através das duas camadas de material de filtragem em um tubo de centrífuga cônica de 50 mililitros. Centrifugar o filtrado a 1.500 vezes g em quatro graus Celsius por 10 minutos e transferir o supernasal para um tubo de centrífuga córica fresco de 50 mililitros.Repita a centrifugação mais uma vez nas mesmas condições. Transfira o supernatante para um tubo de ultracentrifuge frio de 38,50 mililitros e cubra-o até 35 mililitros com tampão de moagem a frio. Use uma ultracentrifugação para centrifugar a amostra a 100.000 vezes g e quatro graus Celsius durante uma hora.Usando um homogeneizador de Teflon de vidro, resuspenque a pelota verde no tampão de moagem. Centrifugar a 100.000 vezes g e quatro graus Celsius por uma hora e descartar o supernaspe. Use o homogeneizador de teflon de vidro para resuspensar a pelota verde em 18,75 mililitros de um x tampão de moagem.Em seguida, adicione outros 9.375 mililitros de um x buffer de moagem. Adicione 9.375 mililitros de quatro x solução de solubilização para trazer o volume final para 37,5 mililitros e incubar em um agitador rotativo a quatro graus Celsius por 30 minutos. Depois disso, use uma ultracentrifugação para centrifugar a amostra a 100.000 vezes g e quatro graus Celsius por uma hora.Transfira o supernatante contendo as membranas solubilizadas para um tubo de centrífuga cônica fresco de 50 mililitros. Depois de preparar a resina de agarose IGG, transfira a resina de agarose IGG anteriormente lavada para o tubo cônico de 50 mililitros contendo os 37,5 mililitros de membranas solubilizadas anteriormente lavadas. Incubar durante a noite em um shaker rotativo a quatro graus Celsius.No dia seguinte, sedimente a resina IGG agarose a 100 vezes g e quatro graus Celsius por cinco minutos. Use uma pipeta para remover o supernatante. Foi a resina de agarose IGG em 37,5 mililitros de tampão A e incubar em um shaker rotativo à temperatura ambiente por 10 minutos.Continue sedimentando e lavando a resina conforme descrito no protocolo de texto. Depois disso, transfira a resina de agarose IGG para uma coluna de giro de 500 microliter com um filtro de 35 mícrons. Lave as contas duas vezes com 300 microliters de tampão de eluição TEV para equilíbrio.Em seguida, adicione 300 microliters de tampão de eluição TEV contêm 10 microliters de protease TEV. Incubar a coluna de giro com contas em um Thermomixer a 16 graus Celsius e 350 rpm por duas horas. Em seguida, abra a coluna de giro e coloque-a em um tubo novo, limpo, de 1,5 mililitro.Gire este tubo a 100 vezes g e quatro graus Celsius por cinco minutos para coletar o elunato. Neste estudo, um complexo proteico de envelope de cloroplasto da TAP das plantas transgênicas A.thaliana é purificado. A análise do imunoblot confirma que o isolar o TAP-TOC159 interage com TOC75 e TOC33 do complexo TOC.A quinase da membrana externa do cloroplasto, KOC1, que é conhecida por fosforilato TOC159 também é co-isolada. A presença do TIC110 revela que o complexo isolado TAP-TOC159 também contém os componentes do complexo TIC. O anticorpo FBN1A não reconheceu o complexo TAP-TOC159, indicando a ausência de contaminações.No controle negativo, a proteína NTAP imunoprecipitada não co-isolou com nenhuma das proteínas TOC, TIC e confirma a especificidade da purificação TAP-TOC159. Embora este método possa fornecer informações sobre a importação de proteínas de cloroplasto, ele pode potencialmente ser aplicado a qualquer outro complexo no sistema de garrafas Arabidopsis thaliana. Após este procedimento, outros métodos podem ser aplicados, como manchas ocidentais ou espectrometria de massa para demonstrar a presença de componentes conhecidos ou identificar novos componentes dos complexos TOC e TIC.Esta técnica abriu caminho para a pesquisa no campo de importação de proteínas cloroplásticas para explorar a função de novos componentes dos complexos TOC e TIC.

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Unit 1

Intracellular Compartments and Protein Sorting

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Isolamento de complexos de ARN-proteína a partir de células Cognate usando eluição Oligonucleotide-directed

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. ...

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A purificação de afinidade em tandem de complexos de proteínas a partir de células eucarióticas

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Deteção de fosforilação Rab10 pela atividade LRRK2 utilizando SDS-PAGE com um Tag de ligação de fosfato

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 em 1: uma etapa de purificação da afinidade para a análise paralela de proteína-proteína e proteína-metabólito complexos

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Preparation of Chloroplast Sub-compartments from Arabidopsis for the Analysis of Protein Localization by Immunoblotting or Proteomics

Preparação de cloroplasto sub compartimentos de Arabidopsis para a análise da localização da proteína pelo Immunoblotting ou Proteomics

Chloroplasts are major components of plant cells. Such plastids fulfill many crucial functions, such as assimilation of carbon, sulfur and nitrogen as ...