Name: affinity purification of chloroplast translocon protein complexes using the tap tag
Uploaded: 2018-11-01T15:00:00
Duration: 7 min 1 s
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El trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación Nacional Suiza de ciencia (31003A_156998 y 31003A_176191) y por la Universidad de Neuchâtel.

1. preparación de las plantas de Arabidopsis
<ol><li>Preparar 1 L de medio fuerza de vitaminas incluya medio Murashige y Skoog (MS) con 1% de sacarosa y ajustar el pH a 5.7 con hidróxido de potasio (KOH). Agregar 0,8% del phytoagar y autoclave durante 20 min a 120 ° C.</li>
	<li>Poner 75 mL de medio MS por placa de Petri (diámetro 14,5 cm, alto 3 cm) y permitir la solidificación durante 1 hora.</li>
	<li>Añadir 30 mg de semillas de Arabidopsis thaliana a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y superficie esterilizar con etanol al 70% (v/v) que contiene 0,05% (v/v) Triton X-100 durante 5 minutos, seguido por 100% etanol (v/v) durante 10 minutos eliminar el etanol.</li>
	<li>Transferir las semillas a papel de filtro estéril para el secado. Espolvorear las semillas esterilizadas uniformemente sobre una placa de MS (cada genotipo requiere placas de al menos 8-10) y sello de cada placa con cinta quirúrgica.</li>
	<li>Incubar las placas a 4 ° C durante dos días en la oscuridad para sincronizar la germinación de la semilla. Traslado a una cámara de crecimiento con el siguiente ciclo de luz: 8 h de 120 μmol m−2 s−1 luz y 16 h de oscuridad a 22-20 ° C.</li>
</ol>2. preparación de perlas de agarosa HsIgG
<ol><li>Suspender cuentas de agarosa CNBr-activado (4 g) en 100 mL de ácido clorhídrico de 1 mM e incubar durante 30 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Transferencia de las perlas de agarosa a un filtro de vidrio sinterizado, la colada bajo vacío con 100 mL de ácido clorhídrico de 100 mM y repita 2 - 3 veces. Nota: Preenfriar la solución de lavado a 4 ° C.</li>
	<li>Resuspender las perlas de agarosa en 1 mL de frío 100 mM HCl y transfiéralo a un tubo de centrífuga cónico de 50 mL. Lavar el filtro de vidrio sinterizado con 3 mL de ácido clorhídrico de 100 mM y transferir el líquido al mismo tubo.</li>
	<li>Gira a 400 x g durante 5 min a 4 ° C y retirar el sobrenadante con una pipeta. Nota: No decantar el tubo.</li>
	<li>Resuspender los granos en 50 mL de tampón de unión (tabla 1); Mezclar brevemente y luego vuelta a 400 x g durante 5 min a 4 ° C.</li>
	<li>Disolver 50 mg de liofilizado Homo sapiens IgG (Hs-IgG) en 10 mL de tampón de Unión, mezcle suavemente las perlas de agarosa e incubar en agitador rotatorio durante la noche a 4 ° C.</li>
	<li>Gira a 400 x g durante 5 min a 4 ° C y retirar el sobrenadante con una pipeta.</li>
	<li>Lavar las perlas de agarosa IgG con 50 mL de acoplamiento de buffer y vuelta a 400 x g durante 5 min a 4 ° C.</li>
	<li>Resuspender las perlas de agarosa IgG con 50 mL de solución amortiguadora de bloqueo (tabla 1) y vuelta a 400 x g durante 5 min a 4 ° C. Repetir una vez.</li>
	<li>Suspender cuentas de IgG-agarosa en 50 mL de solución amortiguadora de bloqueo, gire la mezcla por 2 h a temperatura ambiente y vuelta a 400 x g durante 5 min a 4 ° C.</li>
	<li>Quite el sobrenadante y resuspender las perlas de agarosa IgG en 200 mL de tampón de unión de NaCl (tabla 1).</li>
	<li>Para bloquear cualquier grupos restantes de CNBr Cross-linking, lavar las perlas de agarosa IgG con 100 mL de HCl de 0,1 M glicina-pH 2.8. Gira a 400 x g durante 5 min a 4 ° C y eliminar el sobrenadante. Lavar con 0.2 M glicina-HCl, pH 2.8, centrifugado a 400 x g durante 5 min a 4 ° C y eliminar el sobrenadante. Por último, lavar las perlas de agarosa IgG con 200 mL de agua ultrapura.</li>
	<li>Lavar las perlas de agarosa IgG con 200 mL de agua ultrapura y luego 200 mL de tampón PBS (tabla 1).</li>
	<li>Suspender las perlas de agarosa IgG en 20 mL de tampón PBS con 0,01% NaN3 (sódica) y almacenar a 4 ° C.</li>
</ol>3. aislamiento y solubilización de la fracción de membrana
<ol><li>Moler 10 g de plántulas de a. thaliana de tres semanas en nitrógeno líquido con un frío mortero y una maja de la arena.</li>
	<li>Añadir 20 mL de pulido buffer (tabla 1) a 10 g de tejido de tierra fría, mezcla bien y descongela el hielo.</li>
	<li>Filtrar el homogeneizado a través de dos capas de material de la filtración rápida en un tubo de centrífuga cónico de 50mL. Empapar el material de filtración rápida con el buffer antes de filtración de pulido.</li>
	<li>Centrifugar el filtrado durante 10 minutos a 1.500 × g a 4 ° C y transferencia el sobrenadante a un tubo de centrífuga cónico de 50 mL enfriado, repita el mismo paso una vez más y recoger el sobrenadante. Retener un 200 μL de muestra de la "fracción total" y almacenar a-80 ° C para su posterior análisis</li>
	<li>Transferir el sobrenadante a tubos de ultracentrífuga mL 38,50 fría y superior a 35 mL con tampón frío de pulido. Centrifugar por 1 h a 100.000 × g a 4 ° C en una ultracentrífuga.</li>
	<li>Transferir el sobrenadante a un tubo cónico de centrífuga de 50 mL. Retener un 200 μL de muestra de la "fracción soluble" y tienda a-80 ° C para su posterior análisis.</li>
	<li>Resuspenda el precipitado verde utilizando un homogenizador de vidrio teflon, en tampón de pulir. Centrifugar durante 1 h a 100.000 x g a 4 ° C en una ultracentrífuga y descarte el sobrenadante.</li>
	<li>Resuspender el precipitado verde en 18,75 mL de 1 x de Buffer utilizando un homogeneizador de vidrio teflon de pulido y añadir 9,375 mL de 1 x de tampón de pulir.</li>
	<li>Añadir 9,375 mL de solución de x solubilisation 4 (tabla 1) (contiene el TX-100 detergente) para dar 37,5 mL e incubar por 30 min en un "agitador rotativo" a 4 ° C.</li>
	<li>Centrifugar por 1 h a 100.000 × g a 4 ° C en una ultracentrífuga. Transferir el sobrenadante a un tubo cónico de centrífuga de 50 mL. Conservar una muestra de 200 μL del sobrenadante (futuro "fracción de la carga") y tienda a-80 ° C para su posterior análisis.</li>
	<li>Resuspender el precipitado en 37,5 mL de tampón de pulir. Conservar la muestra de la parte insoluble y conservar a-80 ° C</li>
</ol>4. inmunoprecipitación
<ol><li>Equilibrar 100 μl de la resina de IgG-agarosa embalada en tampón A (tabla 1) y vuelta a 100 × g durante 5 min a 4 ° C.</li>
	<li>Quite el sobrenadante y resuspender el IgG-agarosa resina en 100 μl de Buffer A 4 ° c.</li>
	<li>Transferencia de la resina lavada de IgG-agarosa al 37,5 mL de membranas solubilizadas e incubar durante una noche en un agitador rotatorio en un tubo de centrífuga cónico de 50 mL a 4 ° C.</li>
	<li>Sedimento la IgG-agarosa resina en 100 × g por 5 min a 4 ° C y retirar el sobrenadante con una pipeta. Retener un 200 μL de muestra del "flujo a través" y almacenar a-80 ° C para su posterior análisis.</li>
	<li>Lavar la resina IgG-agarosa en 37,5 mL de tampón A e incubar por 10 min en un agitador rotatorio.</li>
	<li>Sedimento la IgG-agarosa resina en 100 × g por 5 min a 4 ° C, retirar el sobrenadante con una pipeta, añadir 5 mL del Buffer A un tubo de centrífuga de 15 mL y centrifugar a 100 × g, 4 ° C, 5 minutos retener un 200 μL de muestra de la "colada de 1" y almacenar a-80 ° C para su posterior análisis.</li>
	<li>Repetir 5 mL lavado paso tres veces con Buffer A.</li>
	<li>Llevar a cabo los dos últimos pasos de lavado sin los inhibidores (NaF, inhibidor de la proteasa y PMSF) Nota: Inhibidores ya no son necesarios en esta etapa y se omite para reducir los costos. Conservar una muestra de 200 μL de la última lavadora paso "lavado final (W6)" y tienda a-80 ° C para su posterior análisis.</li>
	<li>Transferencia de la resina de IgG-agarosa a una columna de centrifugado 500 μl con 35 μm filtro y lave los granos dos veces con 300 μL de tampón de elución de TEV (tabla 1) (no contiene AcTEV) para conseguir el equilibrio. Cerca de la columna de vuelta.</li>
	<li>Añadir 300 μL de tampón de elución de TEV que contiene 50 unidades (10 μl) de AcTEV. Preparar la mezcla en un tubo antes de agregar a la resina.</li>
	<li>Incubar la columna de vuelta con los granos en un Termomezcladores a 16 º C, 350 r.p.m. durante 2 h. invertir la columna suavemente varias veces cada 30 minutos.</li>
	<li>Abrir la columna de giro, colocarlo en un tubo limpio de 1.5 mL nuevo y vuelta a 100 × g por 5 min a 4 ° C para recoger el eluido.</li>
	<li>10% (v/v) de la muestra eluída (~ 25 μl) en un evaporador centrífugo en seco (por ejemplo) y usar para espectrometría de masas u otros análisis más.</li>
	<li>Alícuota del efluente restante (~ 275 μL) divididas en once centrífuga de 1,5 mL tubos (25 μl cada una), seco en un evaporador centrífugo y almacenar a-80 ° C.</li>
	<li>Analizar las muestras retenidas durante todo el procedimiento, así como los eluatos por estándar SDS-PAGE seguido immunoblotting. Para preparación de muestras, precipitado 50 μg de Total (T), carga (L), flujo (FT), lavar 1 (W1) y 200 μL de lavado 6 (W6) por Cloroformo/metanol extracción16.</li>
	<li>Añadir 10 μl de 2 x de tampón de carga SDS-PAGE (tabla 1) las muestras precipitadas y 25 μl de la muestra seca eluída. Mezclar y hervir durante 10 minutos a 95 ° C en un bloque de calor.</li>
	<li>Analizar la carga (L), flujo (FT), Total (T), lavado 1 (W1), lavar 6 (W6) y elución (E) immunoblotting usando anticuerpos anti-TOC159 para determinar la eficacia del procedimiento de aislamiento.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Jarvis, P., L&#243;pez-Juez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+and+homeostasis+of+chloroplasts+and+other+plastids.">Biogenesis and homeostasis of chloroplasts and other plastids.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 787-802 (2013).</li><li>Kessler, F., Schnell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloroplast+biogenesis:+diversity+and+regulation+of+the+protein+import+apparatus.">Chloroplast biogenesis: diversity and regulation of the protein import apparatus.</a> Current opinion in cell biology. 21 (4), 494-500 (2009).</li><li>Schnell, D. 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S., Chen, M., Cerny, R., Fromm, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+tandem+affinity+purification+tag+and+methods+for+isolation+of+protein+heterocomplexes+from+plants.">Improved tandem affinity purification tag and methods for isolation of protein heterocomplexes from plants.</a> The Plant journal. 38 (1), 172-181 (2004).</li><li>Rohila, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interactions+of+tandem+affinity+purified+protein+kinases+from+rice.">Protein-protein interactions of tandem affinity purified protein kinases from rice.</a> PloS one. 4 (8), 6685 (2009).</li><li>Agne, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acidic+A-domain+of+Arabidopsis+TOC159+occurs+as+a+hyperphosphorylated+protein.">The acidic A-domain of Arabidopsis TOC159 occurs as a hyperphosphorylated protein.</a> Plant physiology. 153 (3), 1016-1030 (2010).</li><li>Wessel, D., Flugge, U. 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Los autores declaran a no hay intereses contrapuestos.

Hemos demostrado que un solo paso de purificación de etiqueta TAP es un método específico y eficiente para la purificación del complejo de TIC TOC de Arabidopsis . Aunque la etiqueta de llave permite dos pasos sucesivos de la purificación (IgG-seguido por la purificación de afinidad de calmodulina después de TEV proteasa-escote), creemos que en muchos casos el primer paso de afinidad seguido de escote de proteasa TEV serán suficiente. Nuestro objetivo, TOC159, es poco abundante y la inclusión de la segunda etapa de afinidad de calmodulina excesivamente disminuida la producción de proteína que fue la razón principal de excluir de nuestro presente Protocolo. La elución de TEV en sí mismo es un paso de purificación altamente específicos y suave que sólo dará a conocer el objetivo de TAP-con la etiqueta junto con socios de interacción asociada mientras que las proteínas no específicamente a la resina de IgG contaminantes seguirá allí. Así, en combinación con el paso de la afinidad de la IgG, la elución de TEV resulta en una purificación suficientemente eficiente para los nuestros y probablemente muchos otros propósitos.
Debe tenerse cuidado que la construcción de TAP-con la etiqueta es completamente funcional en vivo. Etiquetado grifo podría tener efectos potencialmente deletéreos sobre la actividad de la proteína, estabilidad o localización. TOC159 consiste en tres dominios, el dominio acídico N-terminal, el dominio central de unión a GTP y dominio de membrana C-terminal, que ancla la TOC159 en la membrana externa cloroplasto del2. Para evitar posibles interferencias con la inserción de la membrana, fundió el grifo-tag para el N-terminal de TOC159. Fusión a la N-terminal es más bien la excepción que la regla. Muchas proteínas contienen información dirigida a N-terminal y por lo tanto deben por etiquetadas en el C-terminal. Nos aseguró que TOC159 es funcional en vivo por la complementación de la mutante de ppi2 (un mutante albino falta TOC159) con llave-TOC159. El rescate de la verde, fenotipo tipo silvestre indicó que TAP-TOC159 funcional15.
El protocolo de purificación se utiliza para identificar a nuevos socios de la interacción de TOC159, que incluye KOC1 y TIC5610,11. En total, alrededor de 30 proteínas se asociaron con el complejo sugiriendo esa interacción nuevos socios serán aislados y caracterizados en un futuro cercano. Mientras que es muy recomendable el grifo-tag para la purificación del complejo, todavía queremos que versiones adicionales a la que aquí se presenta existen y pueden ser muy útiles para algunas aplicaciones.

Las plantas dependen de cloroplastos para la fotosíntesis y crecimiento Chlorobiaceae1. La gran mayoría de las proteínas del cloroplasto es codificada en el núcleo, sintetizada en el citosol e importada en el cloroplasto a través de los complejos en los sobres de las membranas2TIC y TOC. La base de la tabla de contenido complejo consiste en el canal proteína-que conduce Toc75 y los dos receptores GTPases Toc33 y Toc1593,4,5. TOC159 es fundamental para la biogénesis de los cloroplastos y la acumulación masiva de proteínas asociadas a fotosíntesis6de media. El TIC complejo consiste en el canal proteína-que conduce TIC20 así como TIC110 y TIC407,8. Recientemente, un desplazamiento de la proteína 1MD complejo en la membrana sobre interno fue aislado y contiene componentes previamente no identificado9, uno de los cuales fue TIC56. Recientemente aislamos Co TIC56 del complejo utilizando el protocolo de purificación de afinidad TOC159 grifo 1 MDa. Los datos indicaron una superposición estructural entre los complejos TOC, TIC "canónicos" y el complejo de MDa 110. Previamente desconocidos componentes como KOC1 también fueron identificados como nuevos socios de la interacción de los complejos TOC y TIC usando el método TAP se ha descrito aquí de10,11.
Así, la purificación de grifo-tag es un método eficiente para el aislamiento de complejos de la proteína y la identificación de socios interactúan por posteriores análisis de espectrometría de masa12. La etiqueta TAP consiste en dos repeticiones de atascamiento de IgG separadas de un péptido de unión a calmodulina (CBP) por un tabaco etch sitio de la hendidura de proteasa de virus (TEV). El método original, que consiste en un paso de purificación de la afinidad de la IgG seguida por escote TEV y cromatografía de afinidad de calmodulina posterior permite la purificación natural de complejos de proteínas grandes y altamente puro13,14 . Hemos simplificado el procedimiento y demostraron que los complejos de proteínas que contiene el TOC159 se pueden también purificar eficientemente usar sólo la afinidad de IgG purificación paso seguido por TEV-escote para elución15. En nuestra experiencia, la omisión del paso de afinidad de calmodulina resultaron en mayores rendimientos y por lo tanto puede ser apropiada para las proteínas de baja abundancia.
En definitiva, nos ingeniería transgénica estable a. thaliana líneas expresando TOC159 grifo de ppi2 (toc159 KO mutante) de fondo y establecido como una fuente confiable para la purificación de complejos de TIC TOC. El protocolo para el aislamiento del complejo TIC TOC comienza con la homogeneización del material vegetal en solución tampón libre de detergente. Después de la centrifugación, el sobrenadante se descarta. El precipitado que contiene la fracción de membrana total es solubilizado mediante un búfer que contiene el detergente. Después de un paso de la ultra centrifugación, el sobrenadante que contiene complejos solubles de TIC TOC se aplica a la resina de IgG para la purificación de la afinidad. Después de varios pasos de lavado, elución se lleva a cabo utilizando un búfer que contiene la proteasa TEV hender selectivamente aguas abajo de los dominios de unión de IgG y suavemente suelte nativos complejos que contienen TOC159. El efluente de la TEV puede ser analizado directamente por Western blotting o espectrometría de masas para identificar a los socios de la interacción de TOC15910,11,15. El método también se ha utilizado para identificar las modificaciones post-traduccionales de TOC15915. En el futuro, nativo que contiene la TOC159 complejos pueden usarse para estudios estructurales usando microscopia del cryoelectron.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:783px;" width="783">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:312px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:185px;">PanReac&#160; AppliChem</td>
			<td style="width:119px;">A0384</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Tris</td>
			<td style="width:185px;">Biosolve</td>
			<td style="width:119px;">0020092391BS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:312px;">Na2HPO4</td>
			<td style="width:185px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S7909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:312px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:185px;">PanReac&#160; AppliChem</td>
			<td style="width:119px;">A2946</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">NaCl</td>
			<td style="width:185px;">PanReac&#160; AppliChem</td>
			<td style="width:119px;">A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">NaF</td>
			<td style="width:185px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S1509</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">PMSF</td>
			<td style="width:185px;">PanReac&#160; AppliChem</td>
			<td style="width:119px;">A0999</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Plant protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:185px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P9599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Glycerol</td>
			<td style="width:185px;">PanReac&#160; AppliChem</td>
			<td style="width:119px;">A0970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Triton X100</td>
			<td style="width:185px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">10789704001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Glycine</td>
			<td style="width:185px;">PanReac&#160; AppliChem</td>
			<td style="width:119px;">A1067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">EDTA</td>
			<td style="width:185px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:119px;">8043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:185px;">PanReac&#160; AppliChem</td>
			<td style="width:119px;">A1101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">SDS</td>
			<td style="width:185px;">PanReac&#160; AppliChem</td>
			<td style="width:119px;">A0675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Bromophenol blue</td>
			<td style="width:185px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">B0126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">HCl</td>
			<td style="width:185px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">20252-290</td>
			<td>Corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Sucrose</td>
			<td style="width:185px;">PanReac&#160; AppliChem</td>
			<td style="width:119px;">A3935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:312px;">Murashige and Skoog medium with vitamins</td>
			<td style="width:185px;">Duchefa Biochemie</td>
			<td style="width:119px;">M0222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Phytoagar</td>
			<td style="width:185px;">Duchefa Biochemie</td>
			<td style="width:119px;">P1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Petri plate</td>
			<td style="width:185px;">Greiner Bio-one</td>
			<td style="width:119px;">639102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">1.5 mL microfuge tubes</td>
			<td style="width:185px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:119px;">72.706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Ethanol</td>
			<td style="width:185px;">Fisher chemical</td>
			<td style="width:119px;">E/0600DF/15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Filter paper&#160;</td>
			<td style="width:185px;">Whatman</td>
			<td style="width:119px;">10311804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Surgical tape</td>
			<td style="width:185px;">3M</td>
			<td style="width:119px;">1530-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:312px;">CNBr-Activated agarose beads (sepharose 4B)</td>
			<td style="width:185px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">17-0430-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Sintered glass filter</td>
			<td style="width:185px;">DURAN</td>
			<td style="width:119px;">2515703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Centrifuge tube 50 mL</td>
			<td style="width:185px;">TPP</td>
			<td style="width:119px;">91050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Purified immunoglobulin G (HsIgG)</td>
			<td style="width:185px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:119px;">855908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Rotating shaker</td>
			<td style="width:185px;">IKA</td>
			<td>4016000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:312px;">NaN3 (sodium azide)</td>
			<td style="width:185px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">71290</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Quick filtration material (Miracloth)</td>
			<td style="width:185px;">Merk-Millipore</td>
			<td style="width:119px;">475855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Ultracentrifube XNP-80</td>
			<td style="width:185px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">A99839</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Rotor SW 32 Ti</td>
			<td style="width:185px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">369650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Ultracentrifuge tubes</td>
			<td style="width:185px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">326823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Glass teflon homogenizer (Potter)</td>
			<td style="width:185px;">Wheaton</td>
			<td style="width:119px;">357426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Spin column (Mobicol)</td>
			<td style="width:185px;">Mo Bi Tec</td>
			<td style="width:119px;">M1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Filter 35&#181;m for spin column (Mobicol)</td>
			<td style="width:185px;">Mo Bi Tec</td>
			<td style="width:119px;">M513515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">AcTEV</td>
			<td style="width:185px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">12575-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Centrifugal evaporator (Speed Vac)</td>
			<td style="width:185px;">Eppendorf</td>
			<td>5305000100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">FBN1A(PGL35) antibody</td>
			<td style="width:185px;">AgriSera</td>
			<td>AS06 116</td>
			<td>RRID:AB_2247012</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sand, Fontainebleau</td>
			<td style="width:185px;">VWR</td>
			<td>27460.295</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

affinity purification of chloroplast translocon protein complexes using the tap tag

Biogénesis del cloroplasto requiere la importación de miles de proteínas codificadas por el núcleo en el Plastidio. La importación de estas proteínas depende del translocon en el exterior (TOC) y membranas internas de cloroplasto (TIC). Los complejos de TOC y TIC son multiméricas y probablemente contienen componentes desconocidos. Uno de los principales objetivos en el campo es establecer el inventario completo de componentes de TOC y TIC. Para el aislamiento de complejos de TIC TOC y la identificación de nuevos componentes, el receptor preprotein que toc159 ha sido modificado N-terminal mediante la adición de la etiqueta de purificación (TAP) de afinidad tándem en TAP-TOC159. La etiqueta de TAP está diseñada para dos pasos de purificación de la afinidad secuencial (por lo tanto "afinidad de tándem"). La etiqueta de llave utilizada en estos estudios consiste en un dominio N-terminal de unión de IgG derivado de proteína de Staphylococcus aureus (ProtA) seguido por un péptido de unión a calmodulina (CBP). Entre estas etiquetas de dos afinidad, un tabaco etch escote de proteasa del virus (TEV) ha incluido el sitio. Por lo tanto, proteasa TEV puede utilizarse para elución suave de complejos que contienen TOC159 después a cuentas de IgG. En el protocolo presentado aquí, se omite el segundo paso de purificación de afinidad de calmodulina. El protocolo de purificación comienza con la preparación y la solubilización de las membranas celulares total. Después del tratamiento de detergente, las proteínas de membrana solubilizadas se incuban con granos de IgG para el immunoisolation de los complejos que contienen grifo-TOC159. Vinculante y lavado extenso, complejos que contienen grifo TOC159 son troceados y liberados de los granos de IgG mediante la proteasa TEV por el que se quita el dominio de unión de IgG de S. aureus . Western blot de los aislados complejos que contienen TOC159 pueden utilizarse para confirmar la presencia de proteínas conocidas o sospechas de TOC y TIC. Más importante aún, los complejos que contienen TOC159 han sido utilizados exitosamente para identificar nuevos componentes de los complejos de TOC y TIC por espectrometría de masas. El protocolo que presentamos potencialmente permite el aislamiento eficaz de cualquier proteína de membrana-limitan complejos para ser utilizado para la identificación de componentes desconocidos por espectrometría de masas.

Aquí se describe un protocolo para la purificación de una proteína de envoltura de cloroplasto de TAP-con la etiqueta compleja de transgénicos a. thaliana plantas. Como se muestra en la figura 1A, plantas expresando el 35S:NTAP-TOC159 de construcción fueron utilizados para aislar este complejo mientras que plantas que expresan la construcción de 35S:NTAP fueron utilizadas como control. Figura 1 B muestra pasos detallados de la purificación de complejos de proteínas TAP-TOC159 seguida de espectrometría de masas para permitir la identificación de proteínas interactuantes. El análisis de immunoblot (figura 2, derecha) confirma que TAP-TOC159 aislados interacciona con TOC75 y TOC33 del complejo TOC. La kinasa de membrana externa de cloroplasto KOC1 sabido que fosforilan TOC159 también aislada conjuntamente con el complejo de grifo-TOC159 (figura 2B, lado derecho). La presencia de TIC110 revela que el complejo TOC159 grifo aislado contiene los componentes del complejo TIC. El FBN1A anticuerpos contra una proteína de plastoglobule sin relación a la importación de proteínas no reconoció el complejo de grifo-TOC159 indicando la ausencia de contaminaciones. En el control negativo, proteína NTAP immunoprecipitated no aislar conjuntamente con cualquiera de las proteínas de TIC TOC (figura 2, izquierda) y confirma la especificidad de la purificación de grifo-TOC159.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58532/58532fig1.jpg"> Figura 1 . Esquema de las construcciones y el procedimiento de purificación afinidad. (A). el 35S:NTAP-TOC159 construcción, codificación de NTAP TOC159 fue estable expresado en Arabidopsis thaliana. Las plantas control negativo expresan el constructo 35S:NTAP, codificación de la etiqueta de TAP solo. (B). el protocolo de purificación paso sabio afinidad consiste en membrana aislamiento y solubilización, IgG agarosa inmuno-purificación, lavado, escote de proteasa TEV y elución. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58532/58532fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58532/58532fig2.jpg"> Figura 2 . Purificación de la afinidad del tándem de la proteína de TOC159. N-terminal TAP-con la etiqueta TOC159 se purificó de NTAP TOC15: plantas deArabidopsis ppi2 y grifo proteína purificada a partir de plantas TAP: WT fue utilizada como control negativo. Total proteína solubilizados los extractos (T), proteínas de la membrana = fracción de la carga (L), flujo (FT), primero y por último lavar fracciones (W1 y W6) y el 10% de la elución TEV se analizaron por Western blot. La membrana fue sondada con los anticuerpos contra TOC159 (AT4G02510), TOC75 (AT3G46740), TOC33 (AT1G02280), KOC1 (AT4G32250), TIC110 (AT1G06950) y FBN1A (AT4G04020). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58532/58532fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Tabla de buffers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Tampón de Unión</td>
			<td>NaHCO3 Ajustar a pH 8.5 ajustar el pH con 0,1 M de Na2CO3
</td>
			<td>100 mM 
			 </td>
		</tr>
<tr>
<td>Tampón de bloqueo</td>
			<td>Tris-HCl Ajustar pH a 8 con HCl.</td>
			<td>100 mM 
			 </td>
		</tr>
<tr>
<td>Tampón PBS</td>
			<td>Na2HPO4 KH2PO4 NaCl KCl Ajustar el pH a 7.3 con ácido clorhídrico.</td>
			<td>4,3 mM 1.4 mM 137 2.7 
			 </td>
		</tr>
<tr>
<td>Tampón de unión de NaCl</td>
			<td>Tampón de Unión NaCl</td>
			<td>  1 M</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 x de Buffer de pulido</td>
			<td>Tris-HCl, pH 7.5 con ácido clorhídrico. NaCl NaF PMSF Cóctel de inhibidor de proteasa vegetal</td>
			<td>100 mM 200 mM 5 mM 1 mM 0.20%</td>
		</tr>
<tr>
<td>4 x solución de solubilización</td>
			<td>Glicerol Triton-X100</td>
			<td>40% 3%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Buffer A</td>
			<td>  2 x de Buffer de pulido 1 x Buffer de pulido 4 x solución de solubilización</td>
			<td>100 ml 50 ml 25 ml 25%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Elución de TEV Buffer</td>
			<td>Tris-HCl, pH 8 con HCl EDTA, pH 8 con HCl NaCl Glicerol Triton-X100 TDT</td>
			<td>50 mM 0,5 mM 100 mM 10% 0,75% 1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 x carga de SDS-PAGE del almacenador intermediario</td>
			<td>Tris-HCl pH 6.8 con HCl SDS Glicerol Azul de bromofenol TDT</td>
			<td>0.1 M 4% 20% 0.20% 0.2 M</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1. Recetas del almacenador intermediario.

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Affinity Purification of Chloroplast Translocon Protein Complexes Using the TAP Tag

Aquí presentamos un protocolo probado y comprobado para la purificación del cloroplasto importación complejos (complejo TIC TOC) usando la etiqueta de grifo. El protocolo de aislamiento de afinidad de un paso potencialmente se puede aplicar a cualquier proteína y se utiliza para identificar a nuevos socios de interacción por espectrometría de masas.

Purificación de la afinidad del cloroplasto Translocon complejos utilizando la etiqueta de grifo

Chloroplast biogenesis requires the import of thousands of nucleus-encoded proteins into the plastid. The import of these proteins depends on the ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del cloroplasto, por ejemplo, la composición de la maquinaria de importación de proteínas de cloroplasto. Es esencial para el reverdeciente y la fotosíntesis y por lo tanto para la producción de alimentos en el planeta. La máquina molecular consta de dos complejos separados en el miembro externo e interno del cloroplasto llamado TOC y TIC, pero la composición no es completamente conocida.La principal ventaja de esta técnica es que la purificación del complejo Arabidopsis TOC/TIC se puede lograr en un método de purificación de un solo paso, la purificación TAP-TOC. Es un método específico y eficiente. Generalmente, los investigadores nuevos en este método pueden tener problemas porque no están familiarizados con el aislamiento de fracciones de membrana de cloroplasto, detergente, solubilización o purificación de afinidad.Después de preparar las plantas de Arabidopsis, moler 10 gramos de plántulas de tres semanas de edad en nitrógeno líquido, utilizando un mortero frío y pestillo con arena. Añadir 20 mililitros de tampón de molienda en frío a los tejidos del suelo. Mezclar bien y dejar que la mezcla se descongele sobre hielo.A continuación, remoje dos capas de material de filtración rápida con tampón de molienda. Filtrar el homogeneizar a través de las dos capas de material de filtración en un tubo de centrífuga cónica de 50 mililitros. Centrifugar el filtrado a 1.500 veces g en cuatro grados Centígrados durante 10 minutos y transfiera el sobrenadante a un tubo de centrífugo cónico fresco y preenfriado de 50 mililitros.Repita la centrifugación una vez más en las mismas condiciones. Transfiera el sobrenadante a un tubo de ultracentrífuga frío de 38,50 mililitros y recarje hasta 35 mililitros con tampón de molienda en frío. Utilice una ultracentrífuga para centrifugar la muestra a 100.000 veces g y cuatro grados centígrados durante una hora.Usando un homogeneizador de teflón de vidrio, resuspender el pellet verde en el tampón de molienda. Centrifugar a 100.000 veces g y cuatro grados celsius durante una hora y deseche el sobrenadante. Utilice el homogeneizador de teflón de vidrio para resuspender el pellet verde en 18,75 mililitros de un tampón de molienda x.A continuación, agregue otros 9.375 mililitros de un tampón de molienda x. Añadir 9.375 mililitros de cuatro x solución de solubilización para llevar el volumen final a 37,5 mililitros e incubar en una coctelera giratoria a cuatro grados centígrados durante 30 minutos. Después de esto, utilice una ultracentrífuga para centrifugar la muestra a 100.000 veces g y cuatro grados celsius durante una hora.Transfiera el sobrenadante que contiene las membranas solubilizadas a un tubo de centrífuga cónica fresco de 50 mililitros. Después de preparar la resina de agarosa IGG, transfiera la resina de agarosa IGG previamente lavada al tubo cónico de 50 mililitros que contiene los 37,5 mililitros de membranas solubilizadas. Incubar durante la noche en una coctelera giratoria a cuatro grados centígrados.Al día siguiente, sedimento de la resina de agarosa IGG a 100 veces g y cuatro grados celsius durante cinco minutos. Utilice una pipeta para quitar el sobrenadante. Era la resina de agarosa IGG en 37,5 mililitros de tampón A e incubar en una coctelera giratoria a temperatura ambiente durante 10 minutos.Continúe sedimentando y lavando la resina como se describe en el protocolo de texto. Después de esto, transfiera la resina de agarosa IGG a una columna de giro de 500 microlitrotro con un filtro de 35 micras. Lave las perlas dos veces con 300 microlitros de tampón de elución TEV para el equilibrio.A continuación, añada 300 microlitros de tampón de elución TEV que contengan 10 microlitros de TEV proteasa. Incubar la columna de espín con perlas en un termomezclador a 16 grados celsius y 350 rpm durante dos horas. A continuación, abra la columna de centrifugado y colóquela en un tubo nuevo, limpio y de 1,5 mililitros.Gire este tubo a 100 veces g y cuatro grados Celsius durante cinco minutos para recoger el eluido. En este estudio se purifica un complejo de proteína de sobre de cloroplasto etiquetado con etiqueta DE TAP de plantas transgénicas de A.thaliana. El análisis de inmunoblot confirma que el aislado TAP-TOC159 interactúa con TOC75 y TOC33 del complejo de TOC.La membrana exterior de cloroplasto quinasa, KOC1, que se sabe que fosforilato TOC159 también está co-aislada. La presencia de TIC110 revela que el complejo TAP-TOC159 aislado también contiene los componentes del complejo TIC. El anticuerpo FBN1A no reconoció el complejo TAP-TOC159, lo que indica la ausencia de contaminaciones.En el control negativo, la proteína NTAP inmunoprepitada no se coaisla con ninguna de las proteínas TCA, TIC y confirma la especificidad de la purificación TAP-TOC159. Aunque este método puede proporcionar información sobre la importación de proteínas de cloroplasto, potencialmente se puede aplicar a cualquier otro complejo en el sistema de botellas Arabidopsis thaliana. Siguiendo este procedimiento, se pueden aplicar otros métodos, como la hinchazón occidental o la espectrometría de masas, para demostrar la presencia de componentes conocidos o para identificar nuevos componentes de los complejos TOC y TIC.Esta técnica allanó el camino para la investigación en el campo de importación de proteínas de cloroplasto para explorar la función de los nuevos componentes de los complejos TOC y TIC.

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Intracellular Compartments and Protein Sorting

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Rab10 detección de fosforilación por la actividad de LRRK2 mediante SDS-PAGE con una etiqueta de enlace de fosfato

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

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2 en 1: purificación de la afinidad para el análisis paralelo de proteínas y complejos de proteína-metabolito de un solo paso

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