Name: mechanisms underlying gut hormone secretion using the isolated perfused rat small intestine
Uploaded: 2019-02-26T13:30:00
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这项工作得到了诺和诺德基本代谢研究中心 (丹麦诺沃诺德基金会) 的 jens juul holst 教授不受限制的资助, 这是诺和诺德基金会为进行鼠患灌注研究而提供的一笔单独赠款 (赠款编号)。nnf15oc0016574), 欧洲研究理事会 (第66969号赠款) 和欧洲联盟第七个研究、技术发展和示范活动框架方案 (266408 赠款) 的霍尔斯特教授赠款以及博士后伦德贝克基金会向 rune e. kuhre 提供的赠款 (R264-2017-3492)。我们感谢詹娜·亨特和卡洛琳·迪肯仔细校对。

所有研究都是在丹麦动物实验监察局 (2013-15-2934-00833) 和地方道德委员会的许可下, 根据丹麦动物实验立法准则 (1987年) 和国家动物实验立法的准则进行的。卫生研究院 (出版物编号 85-23)。
1. 实验动物
<ol><li>获得雄性 wistar 大鼠 (250 克) 和每个笼子的房子 2, 与广告的脂肪访问标准的食物和水, 并保持在12:12 小时的光暗周期。我们的动物设施使用未经处理的水和 alrtromin 啮齿类动?...

<ol>
	<li>Rindi, G., Leiter, A. B., Kopin, A. S., Bordi, C., Solcia, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+&amp;#34;normal&amp;#34;+endocrine+cell+of+the+gut:+changing+concepts+and+new+evidences.">The &amp;#34;normal&amp;#34; endocrine cell of the gut: changing concepts and new evidences.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1014, 1-12 (2004).</li><li>Brighton, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bile+Acids+Trigger+GLP-1+Release+Predominantly+by+Accessing+Basolaterally+Located+G+Protein-Coupled+Bile+Acid+Receptors.">Bile Acids Trigger GLP-1 Release Predominantly by Accessing Basolaterally Located G Protein-Coupled Bile Acid Receptors.</a> Endocrinology. 156, 3961-3970 (2015).</li><li>Kuhre, R. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+glucagon-like+peptide-1+synthesis+and+secretion+in+the+GLUTag+enteroendocrine+cell+line.">Regulation of glucagon-like peptide-1 synthesis and secretion in the GLUTag enteroendocrine cell line.</a> Endocrinology. 139, 4108-4114 (1998).</li><li>Jacobsen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+Gastrointestinal+Hormone+Responses,+Insulin+Sensitivity,+and+Beta-Cell+Function+Within+2+Weeks+After+Gastric+Bypass+in+Non-diabetic+Subjects.">Changes in Gastrointestinal Hormone Responses, Insulin Sensitivity, and Beta-Cell Function Within 2 Weeks After Gastric Bypass in Non-diabetic Subjects.</a> Obesity Surgery. 22, 1084-1096 (2012).</li><li>Kuhre, R. E., Frost, C. R., Svendsen, B., Holst, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+glucose-stimulated+GLP-1+secretion+from+perfused+rat+small+intestine.">Molecular mechanisms of glucose-stimulated GLP-1 secretion from perfused rat small intestine.</a> Diabetes. 64, 370 (2014).</li><li>Svendsen, B., Holst, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+gut+hormone+secretion.+Studies+using+isolated+perfused+intestines.">Regulation of gut hormone secretion. Studies using isolated perfused intestines.</a> Peptides. 77, 47-53 (2016).</li><li>Ratner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Peripheral+Neurotensin+on+Appetite+Regulation+and+Its+Role+in+Gastric+Bypass+Surgery.">Effects of Peripheral Neurotensin on Appetite Regulation and Its Role in Gastric Bypass Surgery.</a> Endocrinology. 157, 3482-3492 (2016).</li><li>Wewer Albrechtsen, N. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+stimulates+neurotensin+secretion+from+the+rat+small+intestine+by+mechanisms+involving+SGLT1+and+GLUT2,+leading+to+cell+depolarization+and+calcium+influx.">Glucose stimulates neurotensin secretion from the rat small intestine by mechanisms involving SGLT1 and GLUT2, leading to cell depolarization and calcium influx.</a> American Journal of Physiology Endocrinology and Metabolism. 308, E1123-E1130 (2015).</li><li>Kuhre, R. E., Christiansen, C. B., Saltiel, M. Y., Wewer Albrechtsen, N. J., Holst, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+relationship+between+glucose+absorption+and+glucose-stimulated+secretion+of+GLP-1,+neurotensin,+and+PYY+from+different+intestinal+segments+in+the+rat.">On the relationship between glucose absorption and glucose-stimulated secretion of GLP-1, neurotensin, and PYY from different intestinal segments in the rat.</a> Physiological Reports. 5, (2017).</li><li>Svendsen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+cosecretion+and+coexpression+of+gut+hormones+from+male+rat+proximal+and+distal+small+intestine.">An analysis of cosecretion and coexpression of gut hormones from male rat proximal and distal small intestine.</a> Endocrinology. 156, 847-857 (2015).</li><li>Goldspink, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+insights+into+the+detection+of+free+fatty+and+bile+acids+by+ileal+glucagon-like+peptide-1+secreting+cells.">Mechanistic insights into the detection of free fatty and bile acids by ileal glucagon-like peptide-1 secreting cells.</a> Molecular Metabolism. 7, 90-101 (2018).</li><li>Sun, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+Controlling+Glucose-Induced+Glp-1+Secretion+in+Human+Small+Intestine.">Mechanisms Controlling Glucose-Induced Glp-1 Secretion in Human Small Intestine.</a> Diabetes. , (2017).</li><li>Kuhre, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+production+and+secretion+in+GLUTag,+NCI-H716+and+STC-1+cells:+a+comparison+to+native+L-cells.">Peptide production and secretion in GLUTag, NCI-H716 and STC-1 cells: a comparison to native L-cells.</a> Journal of Molecular Endocrinology. 56, 11 (2016).</li><li>Reimann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+sensing+in+L+cells:+a+primary+cell+study.">Glucose sensing in L cells: a primary cell study.</a> Cell Metabolism. 8, 532-539 (2008).</li><li>Reimann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+functional+role+of+voltage+gated+cation+conductances+in+the+glucagon-like+peptide-1+secreting+GLUTag+cell+line.">Characterization and functional role of voltage gated cation conductances in the glucagon-like peptide-1 secreting GLUTag cell line.</a> The Journal of Physiology. 563, 161-175 (2005).</li><li>Kuhre, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fructose+stimulates+GLP-1+but+not+GIP+secretion+in+mice,+rats+and+humans.">Fructose stimulates GLP-1 but not GIP secretion in mice, rats and humans.</a> American journal of physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 306, G622-G630 (2014).</li><li>Reimann, F., Tolhurst, G., Gribble, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G-Protein-Coupled+Receptors+in+Intestinal+Chemosensation.">G-Protein-Coupled Receptors in Intestinal Chemosensation.</a> Cell Metabolism. 15, 421-431 (2012).</li><li>Parker, H. 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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Human+and+Murine+Enteroendocrine+Cells+by+Transcriptomic+and+Peptidomic+Profiling.">Comparison of Human and Murine Enteroendocrine Cells by Transcriptomic and Peptidomic Profiling.</a> Diabetes. , (2019).</li><li>Reimann, F., Gribble, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose-Sensing+in+Glucagon-Like+Peptide-1-Secreting+Cells.">Glucose-Sensing in Glucagon-Like Peptide-1-Secreting Cells.</a> Diabetes. 51, 2757-2763 (2002).</li><li>Drucker, D. J., Jin, T., Asa, S. L., Young, T. A., Brubaker, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+proglucagon+gene+transcription+by+protein+kinase-A+in+a+novel+mouse+enteroendocrine+cell+line.">Activation of proglucagon gene transcription by protein kinase-A in a novel mouse enteroendocrine cell line.</a> Molecular Endocrinology. 8, 1646-1655 (1994).</li><li>Svendsen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GLP1-+and+GIP-producing+cells+rarely+overlap+and+differ+by+bombesin+receptor-2+expression+and+responsiveness.">GLP1- and GIP-producing cells rarely overlap and differ by bombesin receptor-2 expression and responsiveness.</a> The Journal of Endocrinology. 228, 39-48 (2016).</li><li>Bak, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity+and+sensitivity+of+commercially+available+assays+for+glucagon-like+peptide-1+(GLP-1):+implications+for+GLP-1+measurements+in+clinical+studies.">Specificity and sensitivity of commercially available assays for glucagon-like peptide-1 (GLP-1): implications for GLP-1 measurements in clinical studies.</a> Diabetes, Obesity &amp; Metabolism. 16, 1155-1164 (2014).</li><li>Jacobsen, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+gastric+bypass+surgery+on+glucose+absorption+and+metabolism+during+a+mixed+meal+in+glucose-tolerant+individuals.">Effects of gastric bypass surgery on glucose absorption and metabolism during a mixed meal in glucose-tolerant individuals.</a> Diabetologia. 56, 2250-2254 (2013).</li></ol>

孤立的灌注大鼠小肠是一个强大的研究工具, 使动态和分子机制下的肠道激素分泌的细节研究。使用此模型成功生成数据的最关键步骤是手术。肠道的处理将不可避免地对肠道造成一些损害, 因此应保持在绝对的最低限度。更重要的是, 手术速度是关键, 特别是在肠系膜动脉中放置导管的时间方面。我们的经验是, 导尿管应该成功放置, 在切断血管上的洞之后, 应该在几分钟内启动灌注。导管的放置?...

肠道是人体最大的内分泌器官, 产生超过15种不同的肽激素, 调节营养吸收和营养倾向, 肠道生长和调节食欲1。因此, 肠道激素参与了许多基本的生理过程, 了解这些分泌模式和控制各自激素分泌的分子细节对我们的基本生理很重要了解和解决肠道激素作用的翻译方面;但如何研究肠道激素分泌的分子传感机制呢？一般来说, 激素分泌可以研究完整的生物体 (人或实验动物), 从孤立的肠道制剂或肠道激素分泌的原代细胞培养物或永生细胞培养 2,3,4 个,5,6. 我们喜欢的模型是孤立的灌注大鼠小肠, 这是一个生理上相关的模型, 可以用最佳的时间分辨率详细研究肠道激素的分泌 (分泌率可以随时确定从下面到第二个), 结果很可能是可转移到体内的情况7。在这里, 我们提供了一个详细的协议, 如何执行这个程序, 但首先, 我们将讨论研究肠道激素分泌的其他方法, 包括这些模型相比, 孤立的灌注大鼠小肠的好处和局限性。
如果你想确定一个特定的化合物是否调节某些肠道激素的分泌, 在人类的研究是最终目标。因此, 如果一种化合物对啮齿类动物 (体内或灌注) 或激素分泌细胞 (细胞系或原生细胞) 中的一种或几种肠道激素的分泌有很大影响, 这种作用只有在能够得到证实的情况下, 才与医学和人体生理有关在人类。然而, 可以在人类身上进行的研究类型有明确的限制, 因此, 对实验动物的体内研究往往是此类研究的第二好选择。老鼠和老鼠是最常用的实验动物, 大概是因为它们体积小、成本低, 而且可以选择从基因上改变被怀疑参与特定研究问题的基因 (例如, 击倒某个传送器或受体)。一般来说, 体内模型受益于生理上的完整, 但也有几个局限性。最重要的是, 啮齿类动物, 特别是老鼠的小尺寸是一个限制因素, 因为大多数肠道激素定量检测需要至少20μl 的血浆 (而且往往更多), 这意味着至少需要提取100μl 的血液才能复制量化。因此, 只能获得与基线样本和一个或两个刺激后样本相对应的极少数样本 (小鼠的总血量为 ~ 1.4 ml)。因此, 可能会漏掉潜在的分泌反应 (例如, 快速或后期发生的反应)。
在灌注模型中, 这个问题被克服了, 因为获得了大量的样品量 (流量: 7.5 mL/min), 并且可以根据需要调整收集间隔, 以确保快速和短期的反应不会被错过 (我们每分钟收集样本)7.啮齿类动物体内研究的另一个问题是, 大多数肠道激素的消除或代谢速度甚至比人类8、9、10 更快, 这可能会使随后的生化分析复杂化。例如, 我们表明, glp-1 在小鼠体内的代谢速度甚至比人类快 (其中 t-----一半是 1-2分钟11), 更重要的是, 在小鼠体内的 glp-1 裂解除了 n 端裂解外, 还包括 n 端裂解。二肽肽酶-4 (dpp4) (是人类主要的 glp-1 降解酶), 进一步裂解酶中性内皮肽酶 24.11 12.因此, 目前对 glp-1 定量的商业检测, 要么是基于 glp-1 (7-36amide 胺) 的完整异形, 要么是基于 dpp-4 切割异形 (9-39 酰胺), 大大低估了小鼠的 glp-1 分泌, 导致了误导的结果12. 在孤立的灌注大鼠小肠中, 分泌激素的大部分代谢被消除或明显减少, 因为可以避免血浆介导的降解, 并防止肝肾肺/肺分泌降解 (因为香水是收集, 因为它离开肠道)。
当然, 使用转基因动物可以产生重要的洞察力, 例如钠葡萄糖转运体- 1 淘汰赛小鼠 13, 但对参与分泌的分子传感器进行详细评估往往需要考虑多个分子位点, 从分子转运到离子通道, 从不同的 g-蛋白质偶联受体到细胞内蛋白质。例如, 当我们分解负责葡萄糖刺激 glp-1 分泌的分子传感器 7时, 我们针对九个不同分子位点的活动.在体内不可能进行类似的调查, 因为所使用的一些化合物具有不具体或有害的致命影响。例如, 当使用灌注肠道时, 可以通过用 2-4-dinitro酚7, 14 阻断 atp 形成来评估细胞内葡萄糖代谢对 glp-1 和神经紧张素分泌的作用, 以及压门控钙通道对胆汁酸刺激 glp-1、nt 和 pyy 分泌物 3。事实上, 剧毒钠通道阻滞剂河豚毒素可以成功地应用于灌注研究。最后, 在灌注模型中, 可以直接评估在肠道中某种化合物刺激某种激素分泌的地方, 因为研究者可以简单地选择和准备所需的区域进行灌注, 同时也可以对其进行调查刺激是否通过激活来自肠道腔侧或血管侧的分子传感器引起分泌 3,15,16。
肠道激素分泌的分泌机制也可以通过肠道组织块 (包括人体组织)、初级肠道培养 (通常来自小鼠)、永生激素分泌细胞系 (老鼠或人类来源)、肠道来研究安装在使用室或由有机体 (最常见的是从小鼠)2,3,4,5, 6,17,18的组织。与肠道灌注相比, 对人体肠道溃疡的研究、原代细胞培养物和细胞系在技术上更容易进行, 是一种更快、更便宜的数据生成方式, 但当然, 对肠道碎片的研究需要获得新鲜的人体肠道标本。然而, 在这些模型中, 肠道的正常细胞极化本质上是丢失的, 这意味着这些模型不能用来评估分子传感器的正常激活, 吸收过程也不能研究。此外, 这类研究通常采用静态孵育 (长达几个 h), 这是高度非生理的, 与细胞的正常分泌动力学无关, 因为分泌的产品没有被去除, 因此可能会反馈影响激素的分泌。相反, 在灌注的肠道中, 分泌和吸收的分子在体内被黏膜微循环有效去除, 从而确保黏膜上的梯度得到维持, 从而以正常的速度进行吸收和分泌。此外, 细胞培养物可能与其本地肠内分泌细胞起源的分化, 这意味着它们在肽含量和分子传感器表达方面不再代表原生细胞, 尽管它们可能仍然存在分泌有问题的激素。例如, glp-1 分泌细胞系19的情况就是如此.
因此, 我们认为, 初级细胞培养物或细胞系研究最适合于筛查目的, 也最适合进行体内或孤立的灌注肠道内无法进行的类型实验。例如, 原代细胞培养物和细胞系培养物的真正强度是, 可以实时监测细胞内的二级信使 (如 ca2 +、camp、nad (p) h), 并可实时监测激素分泌细胞的电信号。调查了 20,21,22。此外, sirna 击倒可以做, 这是特别有用的, 如果没有特定的抑制剂没有20,21,22,23,24。最近, 安装在 ussing 室内的小鼠的肠道组织被用来研究胆汁酸刺激 glp-1 分泌的分子机制, 而肠道有机体 (来自小鼠) 和人类肠道碎片也被用来研究肠道激素分泌的分子细节17,25。而前者的好处是从两极分化2所有这些模型涉及静态孵化。然而, 对人类肠道碎片的研究受益于使用人类而不是啮齿类动物组织, 这一点很重要, 因为7tm 受体和分子转运体在组织表达方面的物种差异可能会导致它们之间的分子传感路径不同物种。事实上, 这一领域的大多数数据都是通过对猪、老鼠或老鼠的研究产生的, 这些发现能否转移到人类身上仍然是难以捉摸的。然而, 令人放心的是, 葡萄糖刺激的 glp-1 分泌的分子传感机制在小鼠、大鼠、人、细胞的转录和肽分析中似乎相似, 显示出强大的全球强这两个物种之间的相似性7,18,26,27。
然而, 孤立的灌注大鼠小肠也有一些局限性, 应该加以考虑。最重要的是, 不可能确定特定分泌反应是由目标激素产生细胞的测试物质直接激活产生的结果, 还是由间接机制引起的。例如, kcl 立即增加 glp-1 分泌从灌注肠 7, 但它仍然是未知的是 l 细胞的直接去极化的结果, 或由靠近 l 细胞的神经元去极化或影响同时释放副分泌物刺激物抑制剂。因此, 利用灌注肠道进行的研究所产生的数据, 其目的是阐明分泌物背后的分子机制, 应始终结合从其他更具体的模型获得的数据, 以提高建立因果 关系。例如, 葡萄糖刺激的 glp-1 分泌细胞系 glutag28、29和原代小鼠 l 细胞的葡萄糖刺激 glp-1 分泌依赖于葡萄糖转运体 (sglt1 和 glut2) 的活性。将这些转运体阻断在灌注大鼠小肠中也会减弱分泌物20, 这意味着葡萄糖刺激的 glp-1 分泌物很可能主要是由葡萄糖对 l 细胞的直接作用介导的。孤立的灌注肠的另一个重要限制是, 由于脂质的疏水性, 一些脂质难以研究。虽然有可能研究脂质消化的最终产物 (脂肪酸、二乙酰甘油、溶血磷脂酰甘油等), 虽然制剂可能能够重新酯化细胞内的脂质, 也许可以将其包装成细胞内的脂质乳胶, 从细胞中运输的子, 以及它们随后被绒毛的乳汁吸收, 都被破坏了, 因为孤立的肠道中的淋巴流动无法得到保障。因此, 一旦被吸收的产物开始在细胞中积累, 脂质吸收很可能会停止。体外细胞系统由于缺乏极化而更不适合进行脂质研究。显然, 这种限制只适用于通过乳牙吸收和运输的脂类, 而通过肠道血管吸收的脂质很可能得到正常处理。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals for perfusion buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.12018.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate (CaCl2 x 2 H2O)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>102382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran 70</td>
			<td>Pharmacosmos</td>
			<td>40014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fumaric acid disodium salt (C4H2Na2O4)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F9642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose (C6H12O6)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate hepatahydrate (MgSO4)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>105886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potasium chloride (KCl)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>104936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>104873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvic acid sodium salt (C3H3NaO4)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106619</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Merck</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium L-glutamate monohydrate (C5H8NNaO4 x H2O)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion equitment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universial perfusion system</td>
			<td>Harvard Bioscience, Inc.</td>
			<td>732316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BASIC UNIT UNIPER UP-100, TYPE 834</td>
			<td>Harvard Bioscience, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roller Pump, with four channels</td>
			<td>Harvard Bioscience, Inc.</td>
			<td>730100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Windkessel</td>
			<td>Harvard Bioscience, Inc.</td>
			<td>732068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostatic Circulator,Bath Volume 3L, 230V/50Hz</td>
			<td>Harvard Bioscience, Inc.</td>
			<td>730125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating table, heated on tripod stand, type 873</td>
			<td>Harvard Bioscience, Inc.</td>
			<td>733776</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cannula with basked, OD= 2.0mm, ID= 1.0mm</td>
			<td>Harvard Bioscience, Inc.</td>
			<td>733313</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mechanisms underlying gut hormone secretion using the isolated perfused rat small intestine

肠道是人体最大的内分泌器官, 产生超过15种不同的肽激素, 调节食欲和食物的摄入、消化、营养的吸收和分配, 以及餐后葡萄糖出游。了解调节肠道激素分泌的分子机制是理解和转化肠道激素生理的基础。传统上, 肠道激素分泌的机制要么在体内研究 (在实验动物或人类), 要么使用肠道激素分泌的初级黏膜细胞培养或细胞系。在这里, 我们介绍了一个孤立的灌注大鼠小肠作为研究肠道激素分泌的替代方法。该模型的优点是, 它依赖于完整的肠道, 这意味着它重述了大多数生理上重要的参数, 负责分泌在体内的研究, 包括粘膜极化, 副父母关系和途径刺激暴露。此外, 与体内研究不同的是, 孤立的灌注大鼠小肠可以进行几乎完整的实验控制和直接评估分泌物。与体外研究不同的是, 有可能研究分泌物的大小和动态, 并解决重要的问题, 比如什么刺激会导致不同肠道激素的分泌, 肠道的哪一侧 (腔或血管) 是分泌物刺激, 并详细分析分泌反应背后的分子传感器。此外, 该制剂是研究肠道吸收的有力模型, 也是包括负责运输者在内的肠道吸收动力学细节的有力模型。

确定某一刺激是否会导致感兴趣的肠道激素分泌的能力依赖于稳定的基线分泌。此外, 如果没有观察到对刺激的反应, 对积极控制的强有力的分泌反应必须明显排除对刺激措施缺乏反应并不反映普遍缺乏反应。图 2 a 和2A显示了高质量数据的一个示例;glp-1 分泌从孤立的灌注大鼠小肠显示在1分钟的间隔 (手段±sem)。在基础条件下, 分泌物是稳...

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Mechanisms Underlying Gut Hormone Secretion Using the Isolated Perfused Rat Small Intestine

利用隔离的完美大鼠小肠进行肠道激素分泌的机制

在这里, 我们提出了一个强大的生理模型, 研究肠道激素分泌和肠道吸收的分子机制-孤立的灌注大鼠小肠。

The gut is the largest endocrine organ of the body, producing more than 15 different peptide hormones that regulate appetite and food intake, digestion, ...

我们在这里开发的方法已经被证明是非常有用的，在我们的工作中，试图找出从肠道中分泌激素的分子机制，但也吸收营养物质，以及两者之间的耦合。这种高度生理技术的主要优点是肠道原位，同时允许详细的研究，通常只在体外模型内进行。首先将大鼠放在加热手术台上，确认对手趾捏没有反应，并做皮肤和腹膜切除以暴露腹腔。将小肠移动到一侧以暴露结肠的终端区域。并给结肠的供给血管。逐渐提取结肠，从终端区域开始，向小肠移动，用同位素盐水使组织保湿，并必要时使用棉签去除结缔组织。当所有结肠都被切除后，将一块15厘米的塑料管插入小肠流明的近端，用缝合线固定管子。然后使用10毫升注射器和注射器泵，以每分钟25毫升的流速用室温同位素盐水小心冲洗小肠。当组织被清空时，调整组织，使上肠动脉被访问，并去除结缔组织和脂肪组织，以暴露动脉。使用细点钳将两个缝合线放在肠动脉下，在门户静脉下放置两个缝合线。用灌注缓冲液填充连接到滚动泵的塑料 22 量导管，并使用一把手术剪刀在肠动脉上切一个小孔，立即将导管插入切口。在动脉上切一个洞后两分钟内插入导管，否则肠道可能会遭受缺血性损伤。一旦导管用缝合固定，启动滚动泵，以每分钟 7.5 毫升的流速启动灌注。当肠道和入口静脉的血管变得苍白时，在入口静脉上切一个洞。插入金属导管，用另一根缝合线固定金属导管。将导管插入入口静脉时小心，因为静脉是薄壁。然而，由于护罩现在被注入，快速插入不是关键。收集灌注输出一分钟后，测量音量，在压力记录程序中单击执行实验，启动灌注压力采集记录。然后用湿润的实验室组织覆盖肠道，防止其干燥，并确认肠道的远端没有阻塞，发光的倍体可以退出。为了测量氧气和二氧化碳的部分压力，在输液时间约三分钟后，立即通过三向止回式缓冲阀收集灌注缓冲液，然后从导管插入入口静脉。将样品放在冰上，并使用自动血气分析仪在采集样品后进行测量。使用分数收集器获取第一个基线样本。经过10至15分钟的基线采集后，使用注射器泵以每分钟35毫升的流量，通过三向止血器，通过三路止压式兴奋剂进行管理。在刺激前五分钟以每分钟 2.5 毫升的流速进行初始刺激 Boas 注射，然后以每分钟 5 毫升的流速对测试溶液进行管理。一旦发光刺激期结束，以每分钟 2.5 毫升的流速用同位素盐水冲洗流明五分钟。然后以每分钟5毫升的基准样本收集15至30分钟，然后施用下一个测试物质。在实验结束时，进行适当的阳性控制，以测试制备的响应能力5至10分钟，在阳性控制刺激期结束时收集和增加10至15分钟的基线样本。下面是一个高质量的数据示例，演示了胰高血糖蛋白样肽-1或GLP-1，从每隔一分钟收集的隔离的感染大鼠小肠中分泌。在基础条件下，分泌物是稳定的，而在测试刺激和阳性控制管理之前和之后，一个有力的分泌反应是显而易见的。这些GLP-1分泌数据从孤立的富鼠小肠获得，质量较差，在基础条件下测量的不稳的分泌物在整个测试过程中向上漂移，似乎与测试物质管理或阳性控制无关。因此，无法得出在血管果糖刺激结束时观察到的GLP-1分泌物是否为果糖中量反应的结论是无法得出的。在尝试此程序时，注意正确固定导管，并彻底清洁灌注设备，因为灌注缓冲液为细菌生长提供了极好的介质。按照这个程序，其他方法，如在体外研究激素分泌细胞系的初级肠道细胞培养，可以进行直接研究细胞内产生循环AMP或细胞内钙。因此，我们已经使用的方法，现在阐明一些过程背后的吸收营养和激素的分泌机制，它被证明是非常有用的。不要忘记，使用分子位位阻滞剂或活化剂可能非常危险，并且在执行此过程时应始终使用实验室外套、手套和安全眼镜等预防措施。

Research

JoVE Journal

Medicine

Isolating and Using Sections of Bovine Mesenteric Artery and Vein as a Bioassay to Test for Vasoactivity in the Small Intestine

隔离和使用的牛肠系膜动脉和静脉部分，作为生物测定在小肠测试的Vasoactivity

Mammalian gastrointestinal systems are constantly exposed to compounds (desirable and undesirable) that can have an effect on blood flow to and from that ...

科研

医学

Glutamate and Hypoxia as a Stress Model for the Isolated Perfused Vertebrate Retina

谷氨酸和缺氧作为离体脊椎动物视网膜应力模型

Neuroprotection has been a strong field of investigation in ophthalmological research in the past decades and affects diseases such as glaucoma, retinal ...

Method of Isolated Ex Vivo Lung Perfusion in a Rat Model: Lessons Learned from Developing a Rat EVLP Program

Method of Isolated Ex Vivo Lung Perfusion in a Rat Model: Lessons Learned from Developing a Rat EVLP Program

的隔离方法<em&gt;离体</em&gt;肺灌注的大鼠模型：教训制定鼠EVLP课程中学

The number of acceptable donor lungs available for lung transplantation is severely limited due to poor quality. Ex-Vivo Lung Perfusion (EVLP) has allowed ...

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

一个<em&gt;体外</em&gt;模型在乳腺癌研究激素的作用

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

Induction and Assessment of Ischemia-reperfusion Injury in Langendorff-perfused Rat Hearts

诱导和缺血再灌注损伤评估中的Langendorff灌注鼠心

The biochemical events surrounding ischemia reperfusion injury in the acute setting are of great importance to furthering novel treatment options for ...

The Inverted Heart Model for Interstitial Transudate Collection from the Isolated Rat Heart

从孤立的大鼠心脏的间质渗出物收集的倒置心脏模型

The present protocol describes a unique approach that enables the collection of cardiac transudate (CT) from the isolated, saline-perfused rat heart. ...

Evaluation of Vascular Control Mechanisms Utilizing Video Microscopy of Isolated Resistance Arteries of Rats

利用大鼠离体阻力动脉的视频显微镜对血管控制机制的评价

This protocol describes the use of in vitro television microscopy to evaluate vascular function in isolated cerebral resistance arteries (and other ...

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一种从成年大鼠肾脏中分离完整型肾小球的有效筛分方法

Preservation of glomerular structure and function is pivotal in the prevention of glomerulonephritis, a category of kidney disease characterized by ...

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机器人辅助全直肠系膜切除术和盆腔外侧淋巴结清扫术治疗局部晚期中低直肠癌

Since their approval for clinical use, da Vinci surgical robots have shown great advantages in gastrointestinal surgical operations, especially in complex ...

A Model of Long-Term Ventricular Fibrillation in Isolated Rat Hearts

孤立大鼠心脏长期心室颤动模型

Ventricular fibrillation (VF) is a fatal arrhythmia with a high incidence in cardiac patients, but VF arrest under perfusion is a neglected method of ...