Name: mechanisms underlying gut hormone secretion using the isolated perfused rat small intestine
Uploaded: 2019-02-26T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mechanisms Underlying Gut Hormone Secretion Using the Isolated Perfused Rat Small Intestine at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af en ubegrænset tilskud til Prof. Jens Juul Holst fra Novo Nordisk Center for metaboliske grundforskning (Novo Nordisk Fonden, Danmark), en særskilt bevilling fra Novo Nordisk Fonden for at gøre gnaver perfusion undersøgelser (give nr. NNF15OC0016574), et tilskud til at Prof. Holst fra European Research Council (Grant no.695069) og det europæiske EU 's syvende rammeprogram for forskning, teknologiske og demonstrationsaktiviteter (Grant nr. 266408) samt en postdoc give Rune E. Kuhre fra Lundbeckfonden (R264-2017-3492). Vi takker Jenna E. Hunt og Carolyn F. Deacon for omhyggelig korrekturlæsning.

Alle undersøgelser blev gennemført med tilladelse fra den danske dyr eksperimenter Inspectorate (2013-15-2934-00833) og den lokale etiske udvalg, efter retningslinjerne i dansk lovgivning om dyreforsøg (1987) og nationale Institutter for sundhed (Publikationsnummer 85-23).
1. forsøgsdyr
<ol><li>Opnå mandlige Wistar rotter (250 g) og hus 2 pr. bur med ad libitum adgang til standard chow og vand, og vedligeholde i en 12:12 h lys-mørke cyklus. Vores dyr faciliteter bruger ubehandlede van...

<ol>
	<li>Rindi, G., Leiter, A. B., Kopin, A. S., Bordi, C., Solcia, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+&amp;#34;normal&amp;#34;+endocrine+cell+of+the+gut:+changing+concepts+and+new+evidences.">The &amp;#34;normal&amp;#34; endocrine cell of the gut: changing concepts and new evidences.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1014, 1-12 (2004).</li><li>Brighton, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bile+Acids+Trigger+GLP-1+Release+Predominantly+by+Accessing+Basolaterally+Located+G+Protein-Coupled+Bile+Acid+Receptors.">Bile Acids Trigger GLP-1 Release Predominantly by Accessing Basolaterally Located G Protein-Coupled Bile Acid Receptors.</a> Endocrinology. 156, 3961-3970 (2015).</li><li>Kuhre, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bile+acids+are+important+direct+and+indirect+regulators+of+the+secretion+of+appetite-+and+metabolism-regulating+hormones+from+the+gut+and+pancreas.">Bile acids are important direct and indirect regulators of the secretion of appetite- and metabolism-regulating hormones from the gut and pancreas.</a> Molecular Metabolism. , (2018).</li><li>Roberge, J. N., Brubacker, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretion+of+Proglucagon-Derived+Peptides+in+Response+to+Intestinal+Luminal+Nutrients.">Secretion of Proglucagon-Derived Peptides in Response to Intestinal Luminal Nutrients.</a> Endocrinology. 128, 3169-3174 (1991).</li><li>Brubaker, P. L., Schloos, J., Drucker, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+glucagon-like+peptide-1+synthesis+and+secretion+in+the+GLUTag+enteroendocrine+cell+line.">Regulation of glucagon-like peptide-1 synthesis and secretion in the GLUTag enteroendocrine cell line.</a> Endocrinology. 139, 4108-4114 (1998).</li><li>Jacobsen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+Gastrointestinal+Hormone+Responses,+Insulin+Sensitivity,+and+Beta-Cell+Function+Within+2+Weeks+After+Gastric+Bypass+in+Non-diabetic+Subjects.">Changes in Gastrointestinal Hormone Responses, Insulin Sensitivity, and Beta-Cell Function Within 2 Weeks After Gastric Bypass in Non-diabetic Subjects.</a> Obesity Surgery. 22, 1084-1096 (2012).</li><li>Kuhre, R. E., Frost, C. R., Svendsen, B., Holst, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+glucose-stimulated+GLP-1+secretion+from+perfused+rat+small+intestine.">Molecular mechanisms of glucose-stimulated GLP-1 secretion from perfused rat small intestine.</a> Diabetes. 64, 370 (2014).</li><li>Svendsen, B., Holst, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+gut+hormone+secretion.+Studies+using+isolated+perfused+intestines.">Regulation of gut hormone secretion. Studies using isolated perfused intestines.</a> Peptides. 77, 47-53 (2016).</li><li>Ratner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Peripheral+Neurotensin+on+Appetite+Regulation+and+Its+Role+in+Gastric+Bypass+Surgery.">Effects of Peripheral Neurotensin on Appetite Regulation and Its Role in Gastric Bypass Surgery.</a> Endocrinology. 157, 3482-3492 (2016).</li><li>Wewer Albrechtsen, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+glucagon+secretion+in+mice+and+rats+revealed+using+a+validated+sandwich+ELISA+for+small+sample+volumes.">Dynamics of glucagon secretion in mice and rats revealed using a validated sandwich ELISA for small sample volumes.</a> American Journal of Physiology Endocrinology and Metabolism. 311, E302-E309 (2016).</li><li>Vilsboll, T., Agerso, H., Krarup, T., Holst, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Similar+elimination+rates+of+glucagon-like+peptide-1+in+obese+type+2+diabetic+patients+and+healthy+subjects.">Similar elimination rates of glucagon-like peptide-1 in obese type 2 diabetic patients and healthy subjects.</a> The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 88, 220-224 (2003).</li><li>Windelov, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+is+it+so+difficult+to+measure+glucagon-like+peptide-1+in+a+mouse?.">Why is it so difficult to measure glucagon-like peptide-1 in a mouse?.</a> Diabetologia. 60, 2066-2075 (2017).</li><li>Gorboulev, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Na+-d-glucose+Cotransporter+SGLT1+is+Pivotal+for+Intestinal+Glucose+Absorption+and+Glucose-Dependent+Incretin+Secretion.">Na+-d-glucose Cotransporter SGLT1 is Pivotal for Intestinal Glucose Absorption and Glucose-Dependent Incretin Secretion.</a> Diabetes. 61, 187-196 (2012).</li><li>Kuhre, R. E., Bechmann, L. E., Wewer Albrechtsen, N. J., Hartmann, B., Holst, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+stimulates+neurotensin+secretion+from+the+rat+small+intestine+by+mechanisms+involving+SGLT1+and+GLUT2,+leading+to+cell+depolarization+and+calcium+influx.">Glucose stimulates neurotensin secretion from the rat small intestine by mechanisms involving SGLT1 and GLUT2, leading to cell depolarization and calcium influx.</a> American Journal of Physiology Endocrinology and Metabolism. 308, E1123-E1130 (2015).</li><li>Kuhre, R. E., Christiansen, C. B., Saltiel, M. Y., Wewer Albrechtsen, N. J., Holst, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+relationship+between+glucose+absorption+and+glucose-stimulated+secretion+of+GLP-1,+neurotensin,+and+PYY+from+different+intestinal+segments+in+the+rat.">On the relationship between glucose absorption and glucose-stimulated secretion of GLP-1, neurotensin, and PYY from different intestinal segments in the rat.</a> Physiological Reports. 5, (2017).</li><li>Svendsen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+cosecretion+and+coexpression+of+gut+hormones+from+male+rat+proximal+and+distal+small+intestine.">An analysis of cosecretion and coexpression of gut hormones from male rat proximal and distal small intestine.</a> Endocrinology. 156, 847-857 (2015).</li><li>Goldspink, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+insights+into+the+detection+of+free+fatty+and+bile+acids+by+ileal+glucagon-like+peptide-1+secreting+cells.">Mechanistic insights into the detection of free fatty and bile acids by ileal glucagon-like peptide-1 secreting cells.</a> Molecular Metabolism. 7, 90-101 (2018).</li><li>Sun, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+Controlling+Glucose-Induced+Glp-1+Secretion+in+Human+Small+Intestine.">Mechanisms Controlling Glucose-Induced Glp-1 Secretion in Human Small Intestine.</a> Diabetes. , (2017).</li><li>Kuhre, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+production+and+secretion+in+GLUTag,+NCI-H716+and+STC-1+cells:+a+comparison+to+native+L-cells.">Peptide production and secretion in GLUTag, NCI-H716 and STC-1 cells: a comparison to native L-cells.</a> Journal of Molecular Endocrinology. 56, 11 (2016).</li><li>Reimann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+sensing+in+L+cells:+a+primary+cell+study.">Glucose sensing in L cells: a primary cell study.</a> Cell Metabolism. 8, 532-539 (2008).</li><li>Reimann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+functional+role+of+voltage+gated+cation+conductances+in+the+glucagon-like+peptide-1+secreting+GLUTag+cell+line.">Characterization and functional role of voltage gated cation conductances in the glucagon-like peptide-1 secreting GLUTag cell line.</a> The Journal of Physiology. 563, 161-175 (2005).</li><li>Kuhre, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fructose+stimulates+GLP-1+but+not+GIP+secretion+in+mice,+rats+and+humans.">Fructose stimulates GLP-1 but not GIP secretion in mice, rats and humans.</a> American journal of physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 306, G622-G630 (2014).</li><li>Reimann, F., Tolhurst, G., Gribble, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G-Protein-Coupled+Receptors+in+Intestinal+Chemosensation.">G-Protein-Coupled Receptors in Intestinal Chemosensation.</a> Cell Metabolism. 15, 421-431 (2012).</li><li>Parker, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+underlying+bile+acid-stimulated+glucagon-like+peptide-1+secretion.">Molecular mechanisms underlying bile acid-stimulated glucagon-like peptide-1 secretion.</a> British Journal of Pharmacology. 165, 414-423 (2012).</li><li>Petersen, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+L+cells+in+mouse+and+human+small+intestine+organoids.">Generation of L cells in mouse and human small intestine organoids.</a> Diabetes. 63, 410-420 (2014).</li><li>Parker, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predominant+role+of+active+versus+facilitative+glucose+transport+for+glucagon-like+peptide-1+secretion.">Predominant role of active versus facilitative glucose transport for glucagon-like peptide-1 secretion.</a> Diabetologia. 55, 2445-2455 (2012).</li><li>Roberts, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Human+and+Murine+Enteroendocrine+Cells+by+Transcriptomic+and+Peptidomic+Profiling.">Comparison of Human and Murine Enteroendocrine Cells by Transcriptomic and Peptidomic Profiling.</a> Diabetes. , (2019).</li><li>Reimann, F., Gribble, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose-Sensing+in+Glucagon-Like+Peptide-1-Secreting+Cells.">Glucose-Sensing in Glucagon-Like Peptide-1-Secreting Cells.</a> Diabetes. 51, 2757-2763 (2002).</li><li>Drucker, D. J., Jin, T., Asa, S. L., Young, T. A., Brubaker, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+proglucagon+gene+transcription+by+protein+kinase-A+in+a+novel+mouse+enteroendocrine+cell+line.">Activation of proglucagon gene transcription by protein kinase-A in a novel mouse enteroendocrine cell line.</a> Molecular Endocrinology. 8, 1646-1655 (1994).</li><li>Svendsen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GLP1-+and+GIP-producing+cells+rarely+overlap+and+differ+by+bombesin+receptor-2+expression+and+responsiveness.">GLP1- and GIP-producing cells rarely overlap and differ by bombesin receptor-2 expression and responsiveness.</a> The Journal of Endocrinology. 228, 39-48 (2016).</li><li>Bak, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity+and+sensitivity+of+commercially+available+assays+for+glucagon-like+peptide-1+(GLP-1):+implications+for+GLP-1+measurements+in+clinical+studies.">Specificity and sensitivity of commercially available assays for glucagon-like peptide-1 (GLP-1): implications for GLP-1 measurements in clinical studies.</a> Diabetes, Obesity &amp; Metabolism. 16, 1155-1164 (2014).</li><li>Jacobsen, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+gastric+bypass+surgery+on+glucose+absorption+and+metabolism+during+a+mixed+meal+in+glucose-tolerant+individuals.">Effects of gastric bypass surgery on glucose absorption and metabolism during a mixed meal in glucose-tolerant individuals.</a> Diabetologia. 56, 2250-2254 (2013).</li></ol>

Isolerede perfunderet rotte tyndtarmen er en kraftfuld forskningsværktøj, der giver dynamik og molekylære mekanismer bag gut hormon sekretion studeres i detaljer. Det mest afgørende skridt for den vellykkede produktion af data med denne model er den kirurgiske operation. Håndtering af tarmen medfører uundgåeligt nogle skader på tarmen og bør derfor holdes på et absolut minimum. Endnu vigtigere, er hastigheden af operation nøglen, især med hensyn til tidspunktet for kateter placering i den mesenterica arterie....

Tarmen er de største endokrine organ i kroppen, producerer mere end 15 forskellige peptid hormoner, der regulerer næringsstof absorption og næringsstof disposition, intestinal vækst og modulere appetit1. Tarmhormoner derfor involveret i mange grundlæggende fysiologiske processer, og at forstå disse mønstre af sekretion og molekylær detaljer, der styrer udskillelsen af de respektive hormoner er således vigtige for vores grundlæggende fysiologiske forståelse og for adressering translationel aspekter af gut hormon handlinger; men hvordan kan man studere de underliggende gut hormon sekretion molekylære sensing mekanismer? I almindelighed, hormon sekretion kan studeres i intakt organismer (mennesker eller forsøgsdyr), fra isolerede gut præparater eller fra gut hormon-secernerende primære cellekulturer eller udødeliggjort celle kulturer2,3, 4 , 5 , 6. vores foretrukne model er isolerede perfunderet rotte tyndtarmen, som er en fysiologisk relevante model, der tillader sekretion af tarmhormoner studeres i detaljer med optimal tidsopløsning (sekretion satser kan fastsættes med enhver tid base ned til andet), og resultaterne er sandsynligvis overføres til en in vivo situation7. Her, vi leverer en detaljeret protokol om, hvordan du udfører denne procedure, men først vil vi diskutere andre metoder til at studere gut hormon sekretion, herunder fordele og begrænsninger af disse modeller i forhold til den isolerede perfunderet rotte tyndtarmen.
Hvis man ønsker at fastslå, om en bestemt sammensatte regulerer udskillelsen af visse tarmhormoner, er undersøgelser hos mennesker det ultimative mål. Således, hvis et stof, der viser store effekter på sekretion af én eller flere tarmhormoner i gnavere (i vivo eller perfusions) eller fra hormon hemmelig celler (cellelinjer eller primærelementer), denne effekt er kun relevante for medicin og human fysiologi hvis det kan bekræftes hos mennesker. Men der er klare grænser for typen af undersøgelser, der kan udføres på mennesker, og in vivo-undersøgelser på forsøgsdyr er derfor ofte den næstbedste løsning for sådanne undersøgelser. Mus og rotter er de hyppigst anvendte forsøgsdyr formentlig på grund af deres bekvemme størrelse, lave omkostninger og mulighed for at genetisk ændre de gener, der mistænkes for at være involveret i de konkrete undersøgelse spørgsmål (f.eks. banke ud af en visse transporter eller receptor). I almindelighed, in vivo modeller drage fordel af fysiologisk intakt, men har også flere begrænsninger. Vigtigst, den lille størrelse af gnavere, især mus, er en begrænsende faktor, da de fleste assays til gut hormon kvantificering kræver mindst 20 µL plasma (og ofte meget mere), hvilket betyder, at mindst 100 µL af blod har tilbage at gøre en dublet kvantificering. Derfor er det kun muligt at opnå meget få prøver svarende til baseline prøver og en eller to efter stimulation prøver (total blodvolumen i en mus på 20 g er ~1.4 mL). Derfor potentielle sekretoriske reaktioner (fx, hurtigt eller sene forekommende svar) kan derfor blive savnet.
I modellen perfusion problemet er overvundet, som stor stikprøve diskenheder er opnået (strømningshastighed: 7,5 mL/min) og samling intervaller kan justeres efter behov for at sikre, ikke glip af de hurtige og korte langvarige svar (vi indsamle prøver hver min)7 . Et andet problem med i vivo studier i gnavere er at de fleste tarmhormoner er endnu mere hurtigt elimineret eller metaboliseres end i mennesker8,9,10, hvilket kan komplicere den efterfølgende biokemiske analyser. For eksempel, vi viste at GLP-1 metaboliseres i mus i en endnu hurtigere tempo end i mennesker (hvor T1/2 er 1-2 min.11) og endnu vigtigere, at kløvningen af GLP-1 i mus omfatter, ud over N-terminale spaltning af dipeptidyl-peptidase-4 (DPP4) (som er den store GLP-1 nedværdigende enzym i mennesker), yderligere spaltning af enzymet neutrale endopeptidase 24.1112. Derfor, nuværende kommercielle assays til kvantificering af GLP-1, som enten er baseret på den intakte isoform af GLP-1 (7-36amide) eller DPP-4 kløvet isoform (9-39amide), langt undervurdere GLP-1 sekretion i mus og resultere i misvisende resultater 12. i tyndtarmen isolerede perfunderet rotte de fleste af metabolismen af udskilles hormoner er elimineret eller markant reduceret, da plasma-medieret nedbrydning er undgået, og lever/nyre/lunge udvinding/nedbrydning forhindres fordi ( perfusate er indsamlet som det forlader tarmen).
Selvfølgelig vigtigt indsigt kan genereres ved hjælp af genetisk modificerede dyr, fx, natrium-glucose transporter-1 knockout mus13, men en detaljeret vurdering af de molekylære sensorer involveret i sekretionen ofte kræver betragtning af flere molekylære sites, spænder fra molekylære transportvirksomheder til ionkanaler og fra forskellige G-protein-koblede receptorer til intracellulære proteiner. For eksempel, målrettet vi aktivitet af ni forskellige molekylære sites når optrevling molekylære sensorerne ansvarlig for glucose-stimuleret GLP-1-sekretion7. En lignende undersøgelse ville ikke være muligt in vivo, som nogle af de forbindelser der anvendes har uspecifik eller skadelige/dødelige virkninger. For eksempel, når du bruger den perfused gut, var det muligt at vurdere intra cellulære glukosemetabolismen for udskillelsen af GLP-1 og neurotensin rolle ved at blokere ATP dannelse med 2-4-dinitrophenol7,14 samt rolle spænding-gated calcium kanaler for galdesyre stimuleret GLP-1, NT og PYY sekretion3. Stærkt giftige natrium-kanal blokker tetrodotoxin kan faktisk blive anvendt med succes i perfusion undersøgelser. Endelig, i perfusion model det kan direkte vurderes hvor i tarmen en visse sammensatte stimulerer sekretion af et bestemt hormon, som investigator kan blot vælge og forberede den ønskede region til perfuse, og samtidig kan det undersøges hvorvidt en stimulus forårsager udskillelsen ved aktivering af molekylære sensorer fra den luminale eller vaskulær side af tarmen3,15,16.
De sekretoriske mekanismer underliggende gut hormon sekretion kan også studeres ved brug af gut væv stykker (herunder humant væv), primære intestinal kulturer (normalt fra mus), udødeliggjort hormon secernerende cellelinjer (af musen eller menneskelig oprindelse), af gut væv monteret i Ussing kamrene eller af organoids (både oftest fra mus)2,3,4,5,6,17,18. I forhold til tarm perfusions, undersøgelser på menneskelige gut stykker, primære cellekulturer og cellelinjer er teknisk nemmere at udføre og er en hurtigere og billigere måde at generere data, men selvfølgelig studiet af gut stykker kræver adgang til friske menneskelige gut prøver. Men i disse modeller normal celle polariseringen af tarmen er i sagens natur tabt, hvilket betyder, at disse modeller kan ikke bruges til at vurdere normal aktivering af molekylære sensorer, og absorption processer kan også undersøges. Derudover sådanne undersøgelser normalt anvender statisk inkubationer (for op til flere h) som er meget ikke-fysiologisk og har intet at gøre med de celler normale sekretoriske dynamik, fordi det udskilles produkt ikke er fjernet og dermed kan feedback påvirke den udskillelsen af hormoner. Derimod i perfused tarmen, er udskilles og optages molekyler effektivt fjernet af slimhinde mikrocirkulationen som de er in vivo, sikre at transmucosal forløb så absorption og sekretion kan forekomme ved en normal sats. Derudover kan cellekulturer have dedifferentiated fra deres indfødte enteroendocrine celle oprindelse, hvilket betyder at de ikke længere er repræsentant for de oprindelige celler peptid indhold og udtryk for Molekylær sensorer, selv om de kan stadig udskille hormonet pågældende. Dette er eksempelvis tilfældet for GLP-1 secernerende celle linjer19.
Det er derfor, vores opfattelse, at primære cellekulturer eller celle linje undersøgelser er mest egnet til screening og til at udføre typer eksperimenter, der ikke kan udføres i vivo eller i den isolerede perfused gut. For eksempel, en sande styrke af primære cellekulturer og cellekulturer linje er at intra cellulære sekundære budbringere (f.eks. Ca2 +, lejr, NAD(P)H) kan overvåges i realtid, og elektrisk signalering af hormonet hemmelig celler kan være undersøgt20,21,22. Derudover kan være gjort siRNA knockdown, hvilket er særligt nyttigt, hvis specifikke hæmmere ikke er tilgængelige20,21,22,23,24. Gut væv fra mus monteret i Ussing kamrene er for nylig blevet brugt til at studere de molekylære mekanismer bag galdesyre stimuleret GLP-1-sekretion, mens tarm organoids (fra mus) og menneskelige gut stykker er også blevet brugt til at studere den Molekylær detaljer gut hormon sekretion17,25. Mens de foerstnaevnte ydelser fra at være polariseret2 omfatter alle disse modeller statisk inkubationer. Undersøgelser på menneskelige gut stykker, dog drage fordel af ved hjælp af menneskelige, snarere end gnavere, væv, som er vigtigt siden arter forskel i væv udtryk af 7TM receptorer og molekylær transportvirksomheder kan resultere i forskellige molekylære sensing veje mellem arter. Faktisk de fleste dataene i dette felt er blevet genereret af undersøgelser på enten svin, mus eller rotter, og det er stadig undvigende om disse resultater kan overføres til mennesker. Det er imidlertid betryggende at de molekylære sensing mekanismer, der ligger til grund for glucose-stimuleret GLP-1 sekretion synes at være ens mellem mus, rotte, mand, og transkriptom og peptidomic profilering af mus og menneskelige L-celler afsløret stærke globale ligheder mellem to arter7,18,26,27.
Tyndtarmen isolerede perfunderet rotte har dog også nogle begrænsninger, der bør overvejes. Vigtigst af alt, er det umuligt at afgøre, om en given sekretoriske reaktion skyldes direkte aktivering af test-kemikaliet i de målrettede hormon-producerende celler eller rettere er forårsaget af en indirekte mekanisme. For eksempel, KCl øger straks GLP-1 sekretion fra perfused tarmen7, men det er stadig ukendt, om dette er en konsekvens af direkte depolarisering af L-celle eller resultater fra depolarisering af neuroner tæt på L-celler eller effekter af Samtidig udgav paracrine Stimulatorer/hæmmere. Data, der opstår fra undersøgelser ved hjælp af perfused tarmen, som har til formål at belyse de molekylære mekanismer bag sekretion bør derfor altid sættes i forbindelse med data fra andre mere specifikke modeller at øge evnen til at etablere kausalitet. For eksempel, glucose-stimuleret GLP-1 sekretion fra GLP-1 secernerende cellelinie GLUTag28,29 og primære mus L-celler afhænger af aktiviteten af glucose transportører (SGLT1 og GLUT2). Blokere disse transportører i tyndtarmen perfunderet rotte også dæmper sekretion20, hvilket betyder, at det er sandsynligt, at glucose-stimuleret GLP-1 sekretion i vid udstrækning er medieret af direkte aktioner af glucose på L-celle. En anden vigtig begrænsning af isolerede perfused tarmen er, at nogle af lipider er vanskelige at studere på grund af deres hydrophobicity. Selv om det er muligt at undersøge de endelige produkter af lipid fordøjelsen (fedtsyrer, diacyl glycerols, lysophosphatidylglycerols, etc.) og selvom præparatet kan muligvis re esterify af lipider intra-cellularly og måske pakke dem ind i Chylomichroner, transport af Chylomichroner ud af cellerne og deres efterfølgende udbredelse af lacteals af af villi er afbrudt, da den lymfe flow i den isolerede gut ikke kan sikres. Mest sandsynlige, derfor lipid absorption er standset når de absorberede produkter begynder at ophobe sig i cellerne. In vitro celle-systemer er endnu mindre egnet til lipid undersøgelser på grund af deres manglende polarisering. Naturligvis, denne begrænsning er kun relevant for lipider, som er absorberet og transporteret via lacteals, mens dem, der absorberes via de intestinale blodkar er tilbøjelige til at blive behandlet normalt.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals for perfusion buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.12018.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate (CaCl2 x 2 H2O)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>102382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran 70</td>
			<td>Pharmacosmos</td>
			<td>40014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fumaric acid disodium salt (C4H2Na2O4)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F9642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose (C6H12O6)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate hepatahydrate (MgSO4)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>105886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potasium chloride (KCl)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>104936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>104873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvic acid sodium salt (C3H3NaO4)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106619</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Merck</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium L-glutamate monohydrate (C5H8NNaO4 x H2O)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion equitment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universial perfusion system</td>
			<td>Harvard Bioscience, Inc.</td>
			<td>732316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BASIC UNIT UNIPER UP-100, TYPE 834</td>
			<td>Harvard Bioscience, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roller Pump, with four channels</td>
			<td>Harvard Bioscience, Inc.</td>
			<td>730100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Windkessel</td>
			<td>Harvard Bioscience, Inc.</td>
			<td>732068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostatic Circulator,Bath Volume 3L, 230V/50Hz</td>
			<td>Harvard Bioscience, Inc.</td>
			<td>730125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating table, heated on tripod stand, type 873</td>
			<td>Harvard Bioscience, Inc.</td>
			<td>733776</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cannula with basked, OD= 2.0mm, ID= 1.0mm</td>
			<td>Harvard Bioscience, Inc.</td>
			<td>733313</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mechanisms underlying gut hormone secretion using the isolated perfused rat small intestine

Tarmen er de største endokrine organ i kroppen, producerer mere end 15 forskellige peptid hormoner, der regulerer appetit og mad indtagelse, fordøjelse, næringsstof absorption og distribution og post prandial glukose udflugter. Forstå de molekylære mekanismer, der regulerer gut hormon sekretion er grundlæggende for at forstå og oversætte gut hormon fysiologi. Traditionelt, de underliggende gut hormon sekretion mekanismer er enten undersøgt in vivo (på forsøgsdyr eller mennesker) eller ved hjælp af gut hormon-secernerende primære slimhinde celle kulturer eller cellelinjer. Her introducerer vi en isoleret perfunderet rotte tyndtarmen som en alternativ metode til at studere gut hormon sekretion. Dyder af denne model er, at det bygger på intakt tarmen, hvilket betyder, at det indeholder de fleste af de fysiologisk vigtige parametre ansvarlig for udskillelsen i in vivo-undersøgelser, herunder slimhinde polarisering, paracrine forhold og ruter i perfusion/stimulus eksponering. Desuden, og i modsætning til in vivo-undersøgelser, tyndtarmen isolerede perfunderet rat giver mulighed for næsten fuldstændig eksperimentelle kontrol og direkte vurdering af sekretion. I modsætning til in vitro-undersøgelser er det muligt at studere både omfanget og dynamikken af sekretion og at behandle vigtige spørgsmål, såsom hvad stimuli forårsager udskillelsen af forskellige tarmhormoner, fra hvilken side af tarmen (luminale eller vaskulære) er sekretion stimuleres, og at analysere i detaljer molekylære sensorer bag den sekretoriske svar. Derudover er forberedelse en kraftfuld model for studiet af intestinale absorption og detaljer om dynamikken i intestinal absorption, herunder de ansvarlige transportvirksomheder.

Evnen til at bestemme, om en given stimulus forårsager udskillelsen af gut hormon af interesse bygger på en stabil basislinje sekretion. Desuden, hvis ingen svar på stimulus er observeret, en robust sekretoriske svar på den positive kontrol skal være indlysende at udelukke, at manglen reaktion på test stimulus ikke afspejler en generel mangel på lydhørhed. Figur 2A og 2B viser et eksempel på god kvalitetsdata; GLP-1 sekretion fra iso...

Watch this Scientific Journal Video about Mechanisms Underlying Gut Hormone Secretion Using the Isolated Perfused Rat Small Intestine at JoVE.com

Mechanisms Underlying Gut Hormone Secretion Using the Isolated Perfused Rat Small Intestine

Underliggende Gut hormon sekretion ved hjælp af den isolerede mekanismer perfunderet rotte tyndtarmen

Vi præsenterer her, en kraftfuld og fysiologiske model for at studere de molekylære mekanismer bag gut hormon sekretion og intestinale absorption — isoleret perfunderet rotte tyndtarmen.

The gut is the largest endocrine organ of the body, producing more than 15 different peptide hormones that regulate appetite and food intake, digestion, ...

Den metode, vi har udviklet her har vist sig at være yderst nyttig i vores arbejde, forsøger at finde ud af de molekylære mekanismer sekretion af hormoner fra tarmen, men også absorption af næringsstoffer, og koblingen mellem de to. Den største fordel ved denne meget fysiologiske teknik er, at tarmen er tilbage in situ, samtidig med at detaljerede undersøgelser, der normalt kun udføres inden for In Vitro modeller. Første sted rotten på en opvarmet operationsbordet, bekræfte en manglende reaktion på tå knivspids, og gøre en hud og bughinde excision at udsætte bughulen.Flyt tyndtarmen til siden for at eksponere den terminale region af tyktarmen. Og ligte den leverende vaskulatur til tyktarmen. Gradvist udtrække tyktarmen, der starter fra terminalen regionen, og bevæger sig mod tyndtarmen, fugtgivende vævet med isotonisk saltvand, og ved hjælp af vatpinde til at fjerne bindevæv efter behov.Når alle tyktarmen er blevet fjernet, indsætte en 15 centimeter stykke plastrør i den proksimale ende af de små tarmlumer, og fastgør slangen med suturer. Brug derefter en 10-milliliter sprøjte og en sprøjte pumpe til omhyggeligt at skylle tyndtarmen med stuetemperatur isotonisk saltvand på en 25-milliliter per minut strømningshastighed. Når vævet er blevet tømt for chyme, justere væv, således at den øvre mesenteric arterie er tilgængelig og fjerne bindevæv og fedtvæv at udsætte arterien.Brug fine punkt kraftbefængte til at placere to suturer under mesenteric arterie og to suturer under portalen vene. Fyld en plastik 22-gauge kateter fastgjort til en rullende pumpe med perfusion buffer og bruge en saks til at skære et lille hul i mesenteriet arterie, straks indsætte kateteret i snittet. Indsæt kateteret inden for to minutter efter at have skåret et hul i arterien, ellers tarmen vil sandsynligvis lide af iskæmisk skade.Så snart kateteret er sikret med sutur, skal du starte den rullende pumpe for at starte perfusion ved en 7,5 milliliter pr. minutstrømningshastighed. Når blodkarrene i tarmen og portalvenen bliver blege, skær et hul i portalvenen. Sæt et metalkateter ind, og fastgør metalkateteret med en anden sutur.Vær forsigtig, når du indsætter kateteret i portalvenen, da venen er tyndvægget. Men da vagten nu bliver perfunderet, er hurtig indsættelse ikke afgørende. Efter indsamling af perfusion output i et minut, måle volumen og klik udføre eksperiment i trykoptagelse program til at indlede perfusion tryk erhvervelse optagelser.Derefter dække tarmen med en fugtet lab væv for at holde det fra udtørring, og bekræfte, at den distale ende af tarmen ikke er blokeret, og en luminal haploid kan afslutte. For at måle det delvise tryk af ilt og kuldioxid, indsamle perfusion buffer gennem en tre-vejs stop-cock ventil umiddelbart før det kommer ind i organet, efter ca tre minutters perfusion, og fra kateteret indsat i portalen vene. Placer prøverne på is, og brug en automatiseret blodgasanalysator til at måle prøverne kort efter indsamlingen.Brug en brøkopsamler til at anskaffe de første grundprøver. Efter 10 til 15 minutters baseline indsamling, bruge en sprøjte pumpe til at administrere den første intraarterial test stimulerende gennem en tre-vejs stop-cock på en 35 milliliter per minut strømningshastighed. Luminal stimulationer udføres ved en indledende stimuleringssymning, der leveres med en strømningshastighed på 2,5 milliliter pr. minut i løbet af de første fem minutter af stimuleringen, efterfulgt af administration af testopløsningen med 5 milliliter pr. minutstrømningshastighed.Så snart en luminal stimulation periode er overstået, skylle lumen med isotonisk saltvand på en 2,5 milliliter per minut strømningshastighed i fem minutter. Baselineprøverne udtages derefter ved 5 milliliter pr. minut i 15 til 30 minutter, før det næste teststof indgives. Ved forsøgets afslutning skal der gives en passende, positiv kontrol for at teste præparatets reaktionsevne i fem til 10 minutter, indsamle og yderligere 10 til 15 minutter af baseline prøver ved afslutningen af den positive kontrolstimuleringsperiode.Her er vist et eksempel på god kvalitet data, der viser Glucagon-lignende peptid-1 eller GLP-1, sekretion fra en isoleret perfunderet rotte tyndtarmen indsamlet med et minuts mellemrum. Under basale forhold var sekretionen stabil, mens både før og efter administration af testmulemuletten og den positive kontrol var en robust sekretorisk reaktion tydelig. Disse GLP-1 sekretionsdata fra en isoleret perfunderet rottearm er af dårlig kvalitet med en usikker sekretion målt ved basale forhold, der drev opad under hele testen på en måde, der syntes at være uden forbindelse med teststofadministrationerne eller til den positive kontrol.Det er derfor umuligt at konkludere, om den øgede GLP-1 sekretion observeret i slutningen af den vaskulære fruktose stimulation var en fruktose medieret respons. Mens du forsøger denne procedure til at sikre katetre ordentligt og til grundigt at rense perfusion udstyr som perfusion buffer giver et fremragende medium for bakterievækst. Efter denne procedure, andre metoder som In Vitro undersøgelser på hormon-udskiller cellelinjer af primære tarmcellekulturer, kan udføres til direkte at undersøge den intracellulære produktion af cyklisk AMP eller intracellulær calcium.Så vi har allerede brugt metoden nu til belysning af en række processer bag absorption af næringsstoffer og mekanismen for sekretion af hormoner, og det har vist sig at være yderst nyttigt. Glem ikke, at arbejde med blokkere eller aktivatorer af molekylære steder kan være yderst farligt og forholdsregler såsom brug af en laboratoriekittel, handsker og sikkerhedsbriller, en røghætte bør altid tages, mens du udfører denne procedure.

Research

JoVE Journal

Medicine

Isolating and Using Sections of Bovine Mesenteric Artery and Vein as a Bioassay to Test for Vasoactivity in the Small Intestine

Isolering og bruger sektioner af Bovin mesenterialarterie og Vein som et bioassay til at teste for Vasoactivity i tyndtarmen

Mammalian gastrointestinal systems are constantly exposed to compounds (desirable and undesirable) that can have an effect on blood flow to and from that ...

Glutamate and Hypoxia as a Stress Model for the Isolated Perfused Vertebrate Retina

Glutamat og hypoxi som Stress Model for Isoleret perfuseret Vertebrate Retina

Neuroprotection has been a strong field of investigation in ophthalmological research in the past decades and affects diseases such as glaucoma, retinal ...

Method of Isolated Ex Vivo Lung Perfusion in a Rat Model: Lessons Learned from Developing a Rat EVLP Program

Method of Isolated Ex Vivo Lung Perfusion in a Rat Model: Lessons Learned from Developing a Rat EVLP Program

Metode til isoleret<em&gt; Ex vivo</em&gt; Lung Perfusion i en rotte Model: Erfaringer fra at udvikle en rotte EVLP Program

The number of acceptable donor lungs available for lung transplantation is severely limited due to poor quality. Ex-Vivo Lung Perfusion (EVLP) has allowed ...

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

En<em&gt; Ex vivo</em&gt; Model til Uddannelse hormonvirkning i Human Breast

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

Induction and Assessment of Ischemia-reperfusion Injury in Langendorff-perfused Rat Hearts

Induktion og vurdering af iskæmi-reperfusion skade i Langendorff-perfusionerede rottehjerter

The biochemical events surrounding ischemia reperfusion injury in the acute setting are of great importance to furthering novel treatment options for ...

The Inverted Heart Model for Interstitial Transudate Collection from the Isolated Rat Heart

Den omvendte hjertemodel for interstitiell transudatsamling fra det isolerede rottehjerte

The present protocol describes a unique approach that enables the collection of cardiac transudate (CT) from the isolated, saline-perfused rat heart. ...

Evaluation of Vascular Control Mechanisms Utilizing Video Microscopy of Isolated Resistance Arteries of Rats

Evaluering af vaskulære kontrolmekanismer udnytte Video mikroskopi af isolerede modstand arterierne af rotter

This protocol describes the use of in vitro television microscopy to evaluate vascular function in isolated cerebral resistance arteries (and other ...

An Efficient Sieving Method to Isolate Intact Glomeruli from Adult Rat Kidney

En effektiv Sieving metode til at isolere intakt Glomeruli fra voksen rotte nyre

Preservation of glomerular structure and function is pivotal in the prevention of glomerulonephritis, a category of kidney disease characterized by ...

Robot-assisted Total Mesorectal Excision and Lateral Pelvic Lymph Node Dissection for Locally Advanced Middle-low Rectal Cancer

Robot-assisteret Total Mesorectal Excision og Lateral Bækken lymfeknude Dissektion for lokalt avanceret mellemlav endetarmskræft

Since their approval for clinical use, da Vinci surgical robots have shown great advantages in gastrointestinal surgical operations, especially in complex ...

A Model of Long-Term Ventricular Fibrillation in Isolated Rat Hearts

En model af langvarig ventrikelflimmer i isolerede rottehjerter

Ventricular fibrillation (VF) is a fatal arrhythmia with a high incidence in cardiac patients, but VF arrest under perfusion is a neglected method of ...