Name: mechanisms underlying gut hormone secretion using the isolated perfused rat small intestine
Uploaded: 2019-02-26T13:30:00
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Dieses wurde unterstützt durch einen uneingeschränkten Grant, Prof. Jens Juul Holst von Novo Nordisk Center für metabolische Grundlagenforschung (Novo Nordisk Stiftung, Dänemark), eine separate Zuschuss von Novo Nordisk Stiftung dafür Nagetier Perfusion Studien (keine zu gewähren. NNF15OC0016574), ist ein Stipendium für Prof. Holst vom European Research Council (Grant no.695069) und Europäische Union siebten Rahmenprogramms für Forschung, TechnologicalDevelopment und Demonstration (Grant Nr. 266408) sowie ein Post-Doc Rune E. Kuhre der Lundbeck-Stiftung (R264-2017-3492) gewähren. Wir danken Jenna E. Hunt und Carolyn F. Deacon für sorgfältige Korrekturlesen.

Alle Studien wurden mit freundlicher Genehmigung von der dänischen Tier Experimente Inspectorate (2013-15-2934-00833) und der lokalen Ethikkommission gemäß den Richtlinien des dänischen Rechtsvorschriften über Tierversuche (1987) und den nationalen Institute der Gesundheit (Publikation Nr. 85-23).
(1) Versuchstiere
<ol><li>Erhalten männliche Wistar-Ratten (250 g) und Haus 2 pro Käfig, mit ad libitum Zugang zu standard Chow und Wasser, und halten Sie in einem 12:12 h hell-dunkel-Zyklus...

<ol>
	<li>Rindi, G., Leiter, A. B., Kopin, A. S., Bordi, C., Solcia, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+&amp;#34;normal&amp;#34;+endocrine+cell+of+the+gut:+changing+concepts+and+new+evidences.">The &amp;#34;normal&amp;#34; endocrine cell of the gut: changing concepts and new evidences.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1014, 1-12 (2004).</li><li>Brighton, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bile+Acids+Trigger+GLP-1+Release+Predominantly+by+Accessing+Basolaterally+Located+G+Protein-Coupled+Bile+Acid+Receptors.">Bile Acids Trigger GLP-1 Release Predominantly by Accessing Basolaterally Located G Protein-Coupled Bile Acid Receptors.</a> Endocrinology. 156, 3961-3970 (2015).</li><li>Kuhre, R. 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Der Dünndarm isoliert perfundierten Ratte ist eine leistungsfähige Recherche-Tool, mit dem die Dynamik und die molekularen Mechanismen, die Darm Hormonausschüttung im Detail untersucht werden kann. Der wichtigste Schritt für die erfolgreiche Produktion von Daten mit diesem Modell ist die chirurgische Operation. Handhabung des Darms wird unweigerlich dazu führen, dass einige Schäden an den Darm und sollte daher gehalten werden auf ein absolutes minimum. Noch wichtiger ist, ist die Geschwindigkeit der Betrieb Schlüs...

Der Darm ist das größte endokrine Organ des Körpers, Herstellung von mehr als 15 verschiedene Peptidhormone, die Nährstoffaufnahme und Nährstoff Disposition, intestinale Wachstum zu regulieren und zu modulieren, Appetit1. Darm Hormone daher in vielen grundlegenden physiologischen Prozessen beteiligt sind, und diese Muster von Sekret und die molekularen Details, die Sekretion der jeweiligen Hormone steuern zu verstehen ist es wichtig für unsere grundlegende physiologische Verständnis und für Translationale Aspekte der Darm Hormon Aktionen; aber wie kann man die molekulare Mechanismen, Fernerkundungen Darm Hormonsekretion studieren? In der Regel Hormonsekretion kann in intakter Organismen (Mensch oder Versuchstiere) studiert werden, aus isolierten Darm Vorbereitungen oder Darm Hormon-sezernierenden primären Zellkulturen oder verewigt Zelle Kulturen2,3, 4 , 5 , 6. unser bevorzugte Modell ist der isoliert perfundierten Ratte Dünndarm, die ein physiologisch relevanten Modell, dass ermöglicht die Sekretion von Hormonen Darm, im Detail mit optimalen zeitlichen Auflösung (Sekretion Preise, mit jeder Zeit ermittelt werden untersucht werden Base auf die Sekunde), und die Ergebnisse sind wahrscheinlich auf eine in-vivo Situation7übertragbar. Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll darüber, wie dieses Verfahren durchführen, aber zuerst besprechen wir andere Methoden zur Untersuchung der Darm Hormonsekretion, einschließlich die vor- und Nachteile dieser Modelle im Vergleich zu den Dünndarm isoliert perfundierten Ratte.
Will man feststellen, ob eine bestimmte Verbindung die Sekretion bestimmter Darm Hormone reguliert, sind Studien an Menschen das ultimative Ziel. Somit ist eine Verbindung zeigt große Wirkung auf die Sekretion von einem oder mehreren Darm Hormone bei Nagetieren (in Vivo oder Verbandwechsel) oder vom Hormon sezernierenden Zellen (Zell-Linien oder Primärzellen), dieser Effekt nur relevant für Medizin und Physiologie des Menschen wenn es bestätigt werden kann beim Menschen. Allerdings gibt es klare Grenzen für die Art der Studien, die beim Menschen durchgeführt werden kann, und in vivo Studien an Versuchstieren sind daher oft die zweitbeste Lösung für solche Studien. Mäuse und Ratten sind die am häufigsten verwendeten Versuchstiere vermutlich aufgrund ihrer praktischen Größe, low-cost und die Möglichkeit, die Gene, die Verdächtigen in die spezifischen Studienfragen genetisch zu verändern (z. B. aus einem bestimmten Transporter klopfen oder Rezeptor). In der Regel in-vivo Modelle davon profitieren, physiologisch intakt, sondern haben auch mehrere Einschränkungen. Vor allem die geringe Größe der Nagetiere, insbesondere Mäuse, ist ein limitierender Faktor, da die meisten Tests für Darm Hormon Quantifizierung mindestens 20 µL erfordern der Plasma (und oft noch viel mehr), was bedeutet, dass mindestens 100 µL Blut hat, ein Duplikat zurückgenommen Quantifizierung. Daher ist es nur zu wenigen Grundlinie Proben entspricht und ein oder zwei Post-Stimulation Proben (die gesamten Blutvolumen in einer Maus 20 g ist ~1.4 mL) möglich. Infolgedessen potenzielle sekretorischen Reaktionen (z.B., schnell oder spät auftretenden Reaktionen) kann daher verpasst.
In der Perfusion Modell, dieses Problem zu umgehen, als große Stichprobe Bände stammen (Durchflussmenge: 7,5 mL/min) und die Sammlung Intervalle eingestellt werden, um sicherzustellen, dass die schnellen und kurze anhaltende Reaktionen nicht übersehen werden (wir Proben sammeln alle min)7 . Ein weiteres Problem mit in Vivo Studien an Nagern ist, dass die meisten Darm Hormone noch mehr schnell beseitigt oder verstoffwechselt als Menschen8,9,10, die die spätere biochemische Analyse erschweren kann. Zum Beispiel zeigten wir, dass die GLP-1 verstoffwechselt wird, bei Mäusen sogar schneller als beim Menschen (wo ist T1/2 1 – 2 min.11) und, noch wichtiger, die die Spaltung von GLP-1 bei Mäusen beinhaltet neben der N-terminalen Spaltung durch Dipeptidyl-Peptidase-4 (DPP4) (das ist das große GLP-1 erniedrigender Enzym beim Menschen), weitere Spaltung durch das Enzym neutrale Endopeptidase 24,11-12. Infolgedessen aktuellen kommerziellen Assays für die Quantifizierung von GLP-1 basieren entweder auf der intakten Isoform von GLP-1 (7-36amide) oder der DPP-4 gespalten Isoform (9-39amide) gewaltig unterschätzen GLP-1-Sekretion bei Mäusen und irreführenden Ergebnissen führen 12. im Dünndarm isoliert perfundierten Ratte ist die meisten des Stoffwechsels der freigesetzten Hormone beseitigt oder deutlich reduziert, da Plasma-vermittelten Abbau wird vermieden, und Leber/Niere/Lunge Extraktion/Abbau verhindert wird weil ( Perfusat wird gesammelt, als es den Darm verlässt).
Natürlich wichtige Erkenntnis erzeugt werden kann, durch den Einsatz von genetisch veränderten Tieren, z. B., Natrium-Glucose-Transporter-1 Knockout Mäuse13, aber erfordert eine detaillierte Bewertung der molekularen Sensoren Sekretion oft beteiligt Berücksichtigung mehrerer molekulare Standorte reichen von molekularen Transporter auf Ionenkanäle und von verschiedenen G-Protein-gekoppelten Rezeptoren an intrazelluläre Proteine. Zum Beispiel gezielte wir die Aktivität von neun verschiedenen molekularen Webseiten, wenn die molekulare Sensoren verantwortlich für Glukose stimuliert GLP-1-Sekretion7entwirren. Eine ähnliche Untersuchung wäre nicht möglich, die in-vivo wie einige der Verbindungen verwendet unspezifische oder schädlichen/letale Wirkungen. Zum Beispiel konnte bei der Verwendung von perfundierten Darms es die Rolle der intrazelluläre Glukosestoffwechsel für die Sekretion von GLP-1 und Neurotensin bewertet Vaskulogenese ATP mit 2-4-Dinitrophenol7,14 , sowie die Rolle der Voltage-gated Kalziumkanäle für Gallensäure stimuliert GLP-1, NT und PYY Sekretion3. In der Tat kann die hochgiftigen Natrium-Kanal Blocker Tetrodotoxin erfolgreich in der Perfusion Studien angewendet werden. Schließlich kann in der Perfusion Modell es direkt beurteilt werden wo im Darm eine bestimmte Verbindung Sekretion eines bestimmten Hormons stimuliert wie der Prüfer einfach wählen und die gewünschte Region zu durchspülen vorbereiten kann, und gleichzeitig untersucht werden können ob ein Reiz verursacht Sekretion durch Aktivierung der molekularen Sensoren luminalen oder vaskulären seitens des Darms3,15,16.
Die sekretorischen Mechanismen, die zugrunde liegende Darm Hormonausschüttung auch untersucht werden kann verwenden Stück Darm Gewebe (einschließlich menschliches Gewebe), intestinale Primärkulturen (in der Regel von Mäusen), verewigt Hormon sezernierenden Zelllinien (von Maus oder menschlichen Ursprungs), durch Darm Gewebe in h-Kammern oder von Organellen (beide in den meisten Fällen von Mäusen)2,3,4,5,6,17,18montiert. Im Vergleich zu Darm Perfusionen, Studien zur menschlichen Darm Stücke, primären Zellkulturen und Zelllinien sind technisch leichter durchzuführen und sind ein schneller und kostengünstiger Weg, Daten zu generieren, aber natürlich erfordert das Studium der Darm Stücke Zugang zu frischem menschlichen Darm Proben. In diesen Modellen ist jedoch die normale Zelle Polarisation des Darms von Natur aus verloren, was bedeutet, dass diese Modelle können nicht verwendet werden, um normale Aktivierung des molekularen Sensoren zu bewerten, und Absorption Prozesse auch können nicht untersucht werden. Darüber hinaus solche Studien beschäftigen in der Regel statische Inkubationen (für bis zu mehreren h) die ist höchst physiologisch und hat nichts mit den Zellen normale sekretorischen Dynamik, zu tun, weil die sekretierte Produkt nicht entfernt wird und somit auch Feedback beeinflussen kann die Ausschüttung von Hormonen. Im Gegensatz dazu werden in perfundierten Darm abgesondert und absorbierte Moleküle effizient durch die Schleimhaut Mikrozirkulation entfernt sind in-vivo, um sicherzustellen, dass transmukosale Gradienten gepflegt werden, so dass in einem normalen Tempo Resorption und Sekretion auftreten können. Darüber hinaus können Zellkulturen entdifferenzierten haben aus ihren nativen Enteroendocrine Zellen-Ursprung, was bedeutet, dass sie nicht mehr Vertreter der einheimischen Zellen inhaltlich Peptid und Ausdruck der molekularen Sensoren sind, obwohl sie möglicherweise noch sondern Sie ab, das Hormon in Frage. Dies ist beispielsweise der Fall für GLP-1 insulinproduzierenden Zellen Linien19.
Es ist daher der Meinung, dass die primären Zellkulturen oder Zelle Linie Studien sind am besten geeignet zu screening-Zwecken und für die Durchführung von Arten Experimente, die nicht durchgeführten in-Vivo oder in der isoliert perfundierten Darm. Zum Beispiel ist eine wahre Stärke des primären Zellkulturen und Linie Zellkulturen, dass intrazelluläres sekundäre Botenstoffe (z.B. Ca2 +, cAMP, NAD(P)H) kann in Echtzeit beobachtet werden, und elektrische Signalisierung des Hormons sezernierenden Zellen kann 20,21,22untersucht. Darüber hinaus kann SiRNA Zuschlag erfolgen, das ist besonders nützlich, wenn spezifische Inhibitoren nicht verfügbar,20,21,22,23,24 sind. Darm-Gewebe von Mäusen in h-Kammern montiert hat zuletzt für das Studium der molekularen Mechanismen, die Gallensäure stimulierten GLP-1-Sekretion, während der Darm Organellen (von Mäusen) und menschlichen Darm Stücke werden auch für das Studium der molekularen Details der Darm Hormon Sekretion17,25. Während die bisherigen Leistungen davon2 polarisiert beinhalten alle diese Modelle statische Inkubationen. Studien zur menschlichen Darm Stücke, profitieren jedoch von mit menschlichen, sondern als Nagetier, Gewebe, was seit Artunterschied in Gewebe Ausdruck 7TM Rezeptoren wichtig ist und molekulare Transporter können verschiedene molekulare Erkennung Wege zwischen Spezies. In der Tat, die meisten Daten in diesem Bereich durch Studien über Schweine, Mäuse oder Ratten erzeugt worden ist, und es bleibt schwer, ob diese Ergebnisse auf den Menschen übertragen werden können. Es ist doch beruhigend, dass die molekularen Fernerkundungen Mechanismen, die Glukose-stimulierten GLP-1-Sekretion zugrunde liegen scheinen ähnlich zwischen Maus, Ratte, Mann, und transkriptomischen und Peptidomic profiling von Maus und Mensch L-Zellen zeigten starke globale Ähnlichkeiten zwischen den beiden Arten7,18,26,27.
Dünndarm isoliert perfundierten Ratte hat allerdings auch einige Einschränkungen, die berücksichtigt werden sollten. Am wichtigsten ist, ist es unmöglich, festzustellen, ob eine gegebene sekretorische Antwort ergibt sich aus direkten Aktivierung durch die Prüfsubstanz der gezielten hormonproduzierenden Zellen oder vielmehr durch einen indirekten Mechanismus verursacht wird. Zum Beispiel KCl sofort GLP-1-Sekretion aus der perfundierten Darm7steigt, aber es ist unbekannt, ob dies eine Folge des direkten Depolarisation der L-Cell ist oder ergibt sich aus Depolarisation von Neuronen in der Nähe der L-Zellen oder Auswirkungen von gleichzeitig veröffentlicht parakrine Stimulatoren/Inhibitoren. Daten aus Studien mit perfundierten Darm, die darauf abzielen, die molekularen Mechanismen, die Sekretion aufzuklären, daher, immer in Zusammenhang mit Daten aus anderen speziellere Modelle erhöhen die Möglichkeit zur Einrichtung legen Kausalität. Zum Beispiel Glukose stimuliert GLP-1-Sekretion von GLP-1 absondert Zelllinie GLUTag28,29 und primäre Maustaste L-Zellen richten sich nach der Aktivität der Glucose-Transporter (SGLT1 und GLUT2). Blockieren diese Transporter im Dünndarm perfundierten Ratte dämpft auch Sekretion20, was bedeutet, dass es wahrscheinlich ist, dass Glukose stimuliert GLP-1-Sekretion weitgehend durch direkten Aktionen der Glucose auf die L-Zelle vermittelt wird. Eine weitere wichtige Einschränkung der isoliert perfundierten Darm ist, dass einige der Lipide schwierig sind, wegen ihrer Hydrophobie zu studieren. Packen Sie obwohl es möglich ist, die Endprodukte der Lipidverdauung (Fettsäuren, Diacyl Glycerols, Lysophosphatidylglycerols, etc.) zu untersuchen und die Vorbereitung der Lipide Intra Einnahme und vielleicht wieder esterify werden kann, diese in Chylomikronen, den Transport von den Chylomikronen aus den Zellen und ihre anschließende Aufnahme durch die Lacteals der Zotten gestört ist, da der Lymphfluss in den isolierten Darm nicht gesichert werden kann. Am ehesten ist daher Lipid Aufnahme gestoppt, sobald die aufgenommene Produkte beginnen, in den Zellen ansammeln. Die in-vitro-Zellsysteme sind wegen ihrer mangelnden Polarisation für Lipid-Studien noch weniger geeignet. Natürlich, diese Einschränkung ist nur relevant für Lipide, die aufgenommen und über die Lacteals transportiert, während diejenigen über den Darm Blutgefäßen absorbiert dürften normalerweise verarbeitet werden.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals for perfusion buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.12018.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate (CaCl2 x 2 H2O)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>102382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran 70</td>
			<td>Pharmacosmos</td>
			<td>40014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fumaric acid disodium salt (C4H2Na2O4)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F9642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose (C6H12O6)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate hepatahydrate (MgSO4)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>105886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potasium chloride (KCl)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>104936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>104873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvic acid sodium salt (C3H3NaO4)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106619</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Merck</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium L-glutamate monohydrate (C5H8NNaO4 x H2O)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion equitment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universial perfusion system</td>
			<td>Harvard Bioscience, Inc.</td>
			<td>732316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BASIC UNIT UNIPER UP-100, TYPE 834</td>
			<td>Harvard Bioscience, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roller Pump, with four channels</td>
			<td>Harvard Bioscience, Inc.</td>
			<td>730100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Windkessel</td>
			<td>Harvard Bioscience, Inc.</td>
			<td>732068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostatic Circulator,Bath Volume 3L, 230V/50Hz</td>
			<td>Harvard Bioscience, Inc.</td>
			<td>730125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating table, heated on tripod stand, type 873</td>
			<td>Harvard Bioscience, Inc.</td>
			<td>733776</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cannula with basked, OD= 2.0mm, ID= 1.0mm</td>
			<td>Harvard Bioscience, Inc.</td>
			<td>733313</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mechanisms underlying gut hormone secretion using the isolated perfused rat small intestine

Der Darm ist das größte endokrine Organ des Körpers, Herstellung von mehr als 15 verschiedene Peptidhormone, die Appetit und Nahrungsaufnahme, Verdauung, Nährstoffaufnahme und Verteilung und Ausflüge postprandialen Blutzucker zu regulieren. Verständnis der molekularen Mechanismen, die Hormonausschüttung Darm zu regulieren ist von grundlegender Bedeutung für das Verständnis und Darm Hormon Physiologie zu übersetzen. Traditionell, die Mechanismen Darm Hormonausschüttung werden entweder in vivo (im experimentellen Tieren oder Menschen) studiert oder Zellkulturen oder Zellinien mit Darm Hormon-sezernierenden primäre Schleimhaut. Hier stellen wir eine isoliert perfundierten Ratte Dünndarm als alternative Methode zur Untersuchung der Darm Hormonausschüttung. Die Vorzüge dieses Modells sind, dass sie stützt sich auf den intakten Darm, was bedeutet, dass es die meisten physiologisch wichtigen Parameter für die Sekretion in in-vivo Studien, einschließlich Schleimhaut Polarisation, parakrine Beziehungen und Transportwege rekapituliert Perfusion/Reiz ausgesetzt. Darüber hinaus und im Gegensatz zu in vivo Studien ermöglicht der isoliert perfundierten Ratte Dünndarm fast vollständige experimentelle Kontrolle und unmittelbare Bewertung der Sekretion. Im Gegensatz zur in-vitro-Studien ist es möglich, das Ausmaß und die Dynamik der Sekretion und wichtige Fragen, wie welche Reize Sekretion von verschiedenen Darm Hormone verursachen von welcher Seite des Darms (luminalen oder vaskuläre) Sekretion ist zu studieren angeregt, und im Detail molekulare Sensoren zugrunde liegt die sekretorische Antwort zu analysieren. Darüber hinaus ist die Vorbereitung ein leistungsfähiges Modell für die Untersuchung der intestinale Resorption und Details hinsichtlich der Dynamik der intestinale Resorption einschließlich der Verantwortlichen Transporter.

Die Fähigkeit, festzustellen, ob eine gegebene Anregung Sekretion des Hormons Darm von Interesse verursacht stützt sich auf eine stabile Basislinie Sekretion. Außerdem, wenn keine Antwort auf den Reiz zu beobachten ist, eine robuste sekretorische Antwort auf die Positivkontrolle ersichtlich zu ausschließen, dass das Ausbleiben einer Reaktion auf den Test-Reiz keinen allgemeinen Mangel an Reaktionsfähigkeit widerspiegelt. Abbildung 2A und 2 b</str...

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Mechanisms Underlying Gut Hormone Secretion Using the Isolated Perfused Rat Small Intestine

Mechanismen, die Hormonausschüttung der Darm mit der isolierten durchblutet Ratte Dünndarm

Hier präsentieren wir eine leistungsstarke und physiologische Modell zur Untersuchung der molekularen Mechanismen Darm Hormonsekretion und intestinale Resorption – isoliert perfundierten Ratte Dünndarm.

The gut is the largest endocrine organ of the body, producing more than 15 different peptide hormones that regulate appetite and food intake, digestion, ...

Die Methode, die wir hier entwickelt haben, hat sich als äußerst nützlich in unserer Arbeit erwiesen, versucht, die molekularen Mechanismen der Sekretion von Hormonen aus dem Darm, aber auch Absorption von Nährstoffen, und die Kopplung zwischen den beiden herauszufinden. Der Hauptvorteil dieser hochphysiologischen Technik ist, dass der Darm in situ gelassen wird, während detaillierte Studien erlaubt werden, die in der Regel nur innerhalb von In-Vitro-Modellen durchgeführt werden. Zuerst die Ratte auf einen beheizten Operationstisch legen, einen Mangel an Reaktion auf Zehenkneifen bestätigen und eine Haut und peritoneale Exzision machen, um die Bauchhöhle freizulegen.Bewegen Sie den Dünndarm zur Seite, um den Endbereich des Dickdarms freizulegen. Und ligate die versorgung des Dickdarms. Nach und nach extrahieren Sie den Dickdarm, beginnend aus der Endregion, und bewegen Sich in Richtung des Dünndarms, Hydratisieren des Gewebes mit isotonischer Saline, und mit Wattestäbchen, um das Bindegewebe bei Bedarf zu entfernen.Wenn der gesamte Dickdarm entfernt wurde, legen Sie ein 15 Zentimeter großes Stück Kunststoffschläuche in das proximale Ende des kleinen Darmlumens ein und sichern Sie die Schläuche mit Nähten. Verwenden Sie dann eine 10-Milliliter-Spritze und eine Spritzenpumpe, um den Dünndarm mit raumtemperaturisotonischer Saline bei einem Durchfluss von 25 Milliliter pro Minute vorsichtig zu spülen. Wenn das Gewebe von Chyme geleert wurde, passen Sie das Gewebe so an, dass die obere mesenterische Arterie zugänglich ist, und entfernen Sie das Bindegewebe und das Fettgewebe, um die Arterie freizulegen.Verwenden Sie feine Point Forceps, um zwei Nähte unter die mesenterische Arterie und zwei Nähte unter der Portalvene zu platzieren. Füllen Sie einen 22-Spur-Kunststoffkatheter, der an einer Walzpumpe mit Perfusionspuffer befestigt ist, und schneiden Sie mit einer chirurgischen Schere ein kleines Loch in die mesenterische Arterie, wobei der Katheter sofort in den Schnitt einfügt wird. Legen Sie den Katheter innerhalb von zwei Minuten nach dem Schneiden eines Lochs in die Arterie, sonst wird der Darm wahrscheinlich von ischämischen Schäden leiden.Sobald der Katheter mit einer Naht gesichert ist, starten Sie die Walzpumpe, um die Perfusion mit einem Durchfluss von 7,5 Milliliter pro Minute zu initiieren. Wenn die Blutgefäße in der Darm- und Portalvene blass werden, schneiden Sie ein Loch in die Portalvene. Legen Sie einen Metallkatheter ein und sichern Sie den Metallkatheter mit einer weiteren Naht.Achten Sie beim Einsetzen des Katheters in die Portalvene, da die Vene dünn wandbein ist. Da die Wache nun jedoch durchsetzt ist, ist ein schnelles Einsetzen nicht entscheidend. Nach dem Sammeln der Perfusionsausgabe für eine Minute, messen Sie die Lautstärke und klicken Sie auf Experiment im Druckaufzeichnungsprogramm ausführen, um die Perfusionsdruckerfassungsaufzeichnungen zu initiieren.Dann bedecken Sie den Darm mit einem befeuchteten Laborgewebe, um es vor dem Austrocknen zu bewahren, und bestätigen Sie, dass das distale Ende des Darms nicht blockiert ist, und ein luminal haploid kann verlassen. Um den Teildruck von Sauerstoff und Kohlendioxid zu messen, sammeln Sie den Perfusionspuffer durch ein Drei-Wege-Hahnenventil unmittelbar vor dem Eindringen in das Organ, nach etwa drei Minuten Perfusion, und aus dem katheter in die Portalvene eingeführten Katheter. Legen Sie die Proben auf Eis und verwenden Sie einen automatisierten Blutgasanalysator, um die Proben kurz nach der Entnahme zu messen.Verwenden Sie einen Fraktionskollektor, um die ersten Basisstichproben zu erhalten. Nach 10 bis 15 Minuten Baseline-Sammlung verwenden Sie eine Spritzenpumpe, um das erste intraarterielle Stimulans durch einen Drei-Wege-Stop-Hahn bei einem Durchfluss von 35 Millilitern pro Minute zu verabreichen. Führen Sie luminale Stimulationen durch eine erste Stimulation boas Injektion mit einem 2,5 Milliliter pro Minute Durchflussrate über die ersten fünf Minuten der Stimulation, gefolgt von der Verabreichung der Testlösung bei 5 Milliliter pro Minute Durchflussrate.Sobald eine luminale Stimulationsperiode vorbei ist, spülen Sie das Lumen mit isotonischer Saline mit einem Durchfluss von 2,5 Milliliter pro Minute für fünf Minuten. Dann sammeln Sie Basisproben mit 5 Milliliterpro Minute für 15 bis 30 Minuten, bevor die nächste Testsubstanz verabreicht wird. Am Ende des Experiments eine geeignete, positive Kontrolle, um die Reaktionsfähigkeit der Zubereitung für fünf bis zehn Minuten zu testen, sammeln und zusätzliche 10 bis 15 Minuten Baseline-Proben am Ende der Positivkontrolle Stimulationsperiode.Hier wird ein Beispiel für qualitativ hochwertige Daten gezeigt, die Glucagon-ähnliche Peptid-1 oder GLP-1 zeigen, Sekretion aus einem isolierten perfundierten Ratten-Dünndarm, der in einem Minutentakt gesammelt wird. Unter basalen Bedingungen war die Sekretion stabil, während sowohl vor als auch nach der Verabreichung des Testreizes und der positiven Kontrolle eine robuste sekretorische Reaktion offensichtlich war. Diese GLP-1-Sekretionsdaten, die aus einem isolierten perfundierten Ratten-Dünndarm gewonnen wurden, sind von schlechter Qualität mit einer unbeständigen Sekretion, die bei basalen Bedingungen gemessen wird, die während der Tests in einer Weise nach oben drifteten, die nichts mit den Verabreichungen der Prüfsubstanz oder der Positivkontrolle zu tun zu haben schien.Es ist daher unmöglich festzustellen, ob die erhöhte GLP-1-Sekretion, die am Ende der vaskulären Fructosestimulation beobachtet wurde, eine fructose vermittelte Reaktion war. Bei diesem Versuch, die Katheter richtig zu sichern und die Perfusionsgeräte gründlich zu reinigen, da der Perfusionspuffer ein ausgezeichnetes Medium für das Bakterienwachstum bietet. Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie In-Vitro-Studien an hormonsekretierenden Zelllinien primärer Darmzellkulturen durchgeführt werden, um die intrazelluläre Produktion von zyklischem AMP oder intrazellulärem Kalzium direkt zu untersuchen.Also haben wir bereits die Methode jetzt für die Aufklärung einer Reihe von Prozessen hinter der Absorption von Nährstoffen und den Mechanismus der Sekretion der Hormone verwendet und es hat sich als äußerst nützlich erwiesen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Blockern oder Aktivatoren molekularer Standorte extrem gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie die Verwendung eines Labormantels, Handschuhen und einer Schutzbrille, eine Dunstabzugshaube sollte immer während der Durchführung dieses Verfahrens eingenommen werden.

Research

JoVE Journal

Medicine

Isolating and Using Sections of Bovine Mesenteric Artery and Vein as a Bioassay to Test for Vasoactivity in the Small Intestine

Isolierung und Verwendung von Rinder Abschnitte A. und V. mesenterica als Bioassay für Vasoaktivität im Dünndarm Testen

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Method of Isolated Ex Vivo Lung Perfusion in a Rat Model: Lessons Learned from Developing a Rat EVLP Program

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Methode Isolated<em&gt; Ex vivo</em&gt; Lung Perfusion in einem Rattenmodell: Lehren aus Entwicklung einer Ratte EVLP Programm gelernt

The number of acceptable donor lungs available for lung transplantation is severely limited due to poor quality. Ex-Vivo Lung Perfusion (EVLP) has allowed ...

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