Name: mechanisms underlying gut hormone secretion using the isolated perfused rat small intestine
Uploaded: 2019-02-26T13:30:00
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この作業によって支えられた無制限で与える教授 Jens におけるホルストにノボ ノルディスク センターから基本的な代謝研究 (ノボ ノルディスク財団、デンマーク) (許可なし齧歯動物の血流の研究を行ってのノボ ノルディスク財団から別の助成金。NNF15OC0016574) 教授ホルストに欧州研究評議会 (グラント no.695069) と欧州連合からの助成金のポスドクと同様、研究、技術開発、実証活動 (許可番号 266408) に第 7 フレームワーク プログラムルンドベック財団 (R264-2017-3492) からルーン E. Kuhre に付与します。注意して校正、ジェナ e. ハントとキャロリン ・ f ・執事に感謝します。

デンマークの動物実験局 (2013-15-2934-00833) とデンマーク規制が動物実験 (1987 年)、国のガイドラインに従い、ローカル倫理委員会の許可を得てすべての研究を行った衛生研究所 (文書番号 85-23)。
1. 実験動物
<ol><li>Wistar ラット (250 g) を入手、ケージ、標準的な食事と水へのアドリブあたり 2 をハウスし、維持、12:12 時間の明暗サイクル。私たちの動物施設は、非処理水と A...

<ol>
	<li>Rindi, G., Leiter, A. B., Kopin, A. S., Bordi, C., Solcia, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+&amp;#34;normal&amp;#34;+endocrine+cell+of+the+gut:+changing+concepts+and+new+evidences.">The &amp;#34;normal&amp;#34; endocrine cell of the gut: changing concepts and new evidences.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1014, 1-12 (2004).</li><li>Brighton, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bile+Acids+Trigger+GLP-1+Release+Predominantly+by+Accessing+Basolaterally+Located+G+Protein-Coupled+Bile+Acid+Receptors.">Bile Acids Trigger GLP-1 Release Predominantly by Accessing Basolaterally Located G Protein-Coupled Bile Acid Receptors.</a> Endocrinology. 156, 3961-3970 (2015).</li><li>Kuhre, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bile+acids+are+important+direct+and+indirect+regulators+of+the+secretion+of+appetite-+and+metabolism-regulating+hormones+from+the+gut+and+pancreas.">Bile acids are important direct and indirect regulators of the secretion of appetite- and metabolism-regulating hormones from the gut and pancreas.</a> Molecular Metabolism. , (2018).</li><li>Roberge, J. N., Brubacker, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretion+of+Proglucagon-Derived+Peptides+in+Response+to+Intestinal+Luminal+Nutrients.">Secretion of Proglucagon-Derived Peptides in Response to Intestinal Luminal Nutrients.</a> Endocrinology. 128, 3169-3174 (1991).</li><li>Brubaker, P. L., Schloos, J., Drucker, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+glucagon-like+peptide-1+synthesis+and+secretion+in+the+GLUTag+enteroendocrine+cell+line.">Regulation of glucagon-like peptide-1 synthesis and secretion in the GLUTag enteroendocrine cell line.</a> Endocrinology. 139, 4108-4114 (1998).</li><li>Jacobsen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+Gastrointestinal+Hormone+Responses,+Insulin+Sensitivity,+and+Beta-Cell+Function+Within+2+Weeks+After+Gastric+Bypass+in+Non-diabetic+Subjects.">Changes in Gastrointestinal Hormone Responses, Insulin Sensitivity, and Beta-Cell Function Within 2 Weeks After Gastric Bypass in Non-diabetic Subjects.</a> Obesity Surgery. 22, 1084-1096 (2012).</li><li>Kuhre, R. E., Frost, C. R., Svendsen, B., Holst, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+glucose-stimulated+GLP-1+secretion+from+perfused+rat+small+intestine.">Molecular mechanisms of glucose-stimulated GLP-1 secretion from perfused rat small intestine.</a> Diabetes. 64, 370 (2014).</li><li>Svendsen, B., Holst, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+gut+hormone+secretion.+Studies+using+isolated+perfused+intestines.">Regulation of gut hormone secretion. Studies using isolated perfused intestines.</a> Peptides. 77, 47-53 (2016).</li><li>Ratner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Peripheral+Neurotensin+on+Appetite+Regulation+and+Its+Role+in+Gastric+Bypass+Surgery.">Effects of Peripheral Neurotensin on Appetite Regulation and Its Role in Gastric Bypass Surgery.</a> Endocrinology. 157, 3482-3492 (2016).</li><li>Wewer Albrechtsen, N. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+stimulates+neurotensin+secretion+from+the+rat+small+intestine+by+mechanisms+involving+SGLT1+and+GLUT2,+leading+to+cell+depolarization+and+calcium+influx.">Glucose stimulates neurotensin secretion from the rat small intestine by mechanisms involving SGLT1 and GLUT2, leading to cell depolarization and calcium influx.</a> American Journal of Physiology Endocrinology and Metabolism. 308, E1123-E1130 (2015).</li><li>Kuhre, R. E., Christiansen, C. B., Saltiel, M. Y., Wewer Albrechtsen, N. J., Holst, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+relationship+between+glucose+absorption+and+glucose-stimulated+secretion+of+GLP-1,+neurotensin,+and+PYY+from+different+intestinal+segments+in+the+rat.">On the relationship between glucose absorption and glucose-stimulated secretion of GLP-1, neurotensin, and PYY from different intestinal segments in the rat.</a> Physiological Reports. 5, (2017).</li><li>Svendsen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+cosecretion+and+coexpression+of+gut+hormones+from+male+rat+proximal+and+distal+small+intestine.">An analysis of cosecretion and coexpression of gut hormones from male rat proximal and distal small intestine.</a> Endocrinology. 156, 847-857 (2015).</li><li>Goldspink, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+insights+into+the+detection+of+free+fatty+and+bile+acids+by+ileal+glucagon-like+peptide-1+secreting+cells.">Mechanistic insights into the detection of free fatty and bile acids by ileal glucagon-like peptide-1 secreting cells.</a> Molecular Metabolism. 7, 90-101 (2018).</li><li>Sun, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+Controlling+Glucose-Induced+Glp-1+Secretion+in+Human+Small+Intestine.">Mechanisms Controlling Glucose-Induced Glp-1 Secretion in Human Small Intestine.</a> Diabetes. , (2017).</li><li>Kuhre, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+production+and+secretion+in+GLUTag,+NCI-H716+and+STC-1+cells:+a+comparison+to+native+L-cells.">Peptide production and secretion in GLUTag, NCI-H716 and STC-1 cells: a comparison to native L-cells.</a> Journal of Molecular Endocrinology. 56, 11 (2016).</li><li>Reimann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+sensing+in+L+cells:+a+primary+cell+study.">Glucose sensing in L cells: a primary cell study.</a> Cell Metabolism. 8, 532-539 (2008).</li><li>Reimann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+functional+role+of+voltage+gated+cation+conductances+in+the+glucagon-like+peptide-1+secreting+GLUTag+cell+line.">Characterization and functional role of voltage gated cation conductances in the glucagon-like peptide-1 secreting GLUTag cell line.</a> The Journal of Physiology. 563, 161-175 (2005).</li><li>Kuhre, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fructose+stimulates+GLP-1+but+not+GIP+secretion+in+mice,+rats+and+humans.">Fructose stimulates GLP-1 but not GIP secretion in mice, rats and humans.</a> American journal of physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 306, G622-G630 (2014).</li><li>Reimann, F., Tolhurst, G., Gribble, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G-Protein-Coupled+Receptors+in+Intestinal+Chemosensation.">G-Protein-Coupled Receptors in Intestinal Chemosensation.</a> Cell Metabolism. 15, 421-431 (2012).</li><li>Parker, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+underlying+bile+acid-stimulated+glucagon-like+peptide-1+secretion.">Molecular mechanisms underlying bile acid-stimulated glucagon-like peptide-1 secretion.</a> British Journal of Pharmacology. 165, 414-423 (2012).</li><li>Petersen, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+L+cells+in+mouse+and+human+small+intestine+organoids.">Generation of L cells in mouse and human small intestine organoids.</a> Diabetes. 63, 410-420 (2014).</li><li>Parker, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predominant+role+of+active+versus+facilitative+glucose+transport+for+glucagon-like+peptide-1+secretion.">Predominant role of active versus facilitative glucose transport for glucagon-like peptide-1 secretion.</a> Diabetologia. 55, 2445-2455 (2012).</li><li>Roberts, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Human+and+Murine+Enteroendocrine+Cells+by+Transcriptomic+and+Peptidomic+Profiling.">Comparison of Human and Murine Enteroendocrine Cells by Transcriptomic and Peptidomic Profiling.</a> Diabetes. , (2019).</li><li>Reimann, F., Gribble, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose-Sensing+in+Glucagon-Like+Peptide-1-Secreting+Cells.">Glucose-Sensing in Glucagon-Like Peptide-1-Secreting Cells.</a> Diabetes. 51, 2757-2763 (2002).</li><li>Drucker, D. J., Jin, T., Asa, S. L., Young, T. A., Brubaker, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+proglucagon+gene+transcription+by+protein+kinase-A+in+a+novel+mouse+enteroendocrine+cell+line.">Activation of proglucagon gene transcription by protein kinase-A in a novel mouse enteroendocrine cell line.</a> Molecular Endocrinology. 8, 1646-1655 (1994).</li><li>Svendsen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GLP1-+and+GIP-producing+cells+rarely+overlap+and+differ+by+bombesin+receptor-2+expression+and+responsiveness.">GLP1- and GIP-producing cells rarely overlap and differ by bombesin receptor-2 expression and responsiveness.</a> The Journal of Endocrinology. 228, 39-48 (2016).</li><li>Bak, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity+and+sensitivity+of+commercially+available+assays+for+glucagon-like+peptide-1+(GLP-1):+implications+for+GLP-1+measurements+in+clinical+studies.">Specificity and sensitivity of commercially available assays for glucagon-like peptide-1 (GLP-1): implications for GLP-1 measurements in clinical studies.</a> Diabetes, Obesity &amp; Metabolism. 16, 1155-1164 (2014).</li><li>Jacobsen, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+gastric+bypass+surgery+on+glucose+absorption+and+metabolism+during+a+mixed+meal+in+glucose-tolerant+individuals.">Effects of gastric bypass surgery on glucose absorption and metabolism during a mixed meal in glucose-tolerant individuals.</a> Diabetologia. 56, 2250-2254 (2013).</li></ol>

単離灌流ラット小腸は、ダイナミクスと分子機構の詳細に検討する消化管ホルモンの分泌を可能にする強力な研究ツールです。このモデルを使用してデータの巧妙な生産の最も重要なステップは、手術操作です。腸の処理は、必然的に腸にいくつかの損傷を引き起こすし、そのために維持されるべき絶対最小。さらに重要なは、操作の速度は上腸間膜動脈内カテーテル留置のための時間に関?...

腸は、体の養分吸収と栄養素の処分、腸の成長を調節し、食欲1を調節する 15 以上の異なるペプチド ホルモンの生産最大の内分泌臓器です。消化管ホルモンは多くの基本的な生理学的なプロセスに関与している、したがってと我々 の基本的な生理学的に重要な分泌の分子の詳細はそれぞれのホルモンの分泌を制御するこれらのパターンを理解すること、理解と腸ホルモン操作の並進の側面に対処するためしかし、どのように 1 つは消化管ホルモンの分泌分子センシング機構を学ぶことができますか。一般に、ホルモン分泌の分離腸準備や消化管ホルモン分泌一次電池文化からそのまま生物 (人間または動物実験) で学ぶことができますまたは不死化細胞文化2,3,4,5,6私たちの推奨モデルが最適な時間分解能 (任意の時間で料金を決定ことができます分泌物を詳細に検討する消化管ホルモンの分泌ができる関連する生理学的モデルは、単離灌流ラット小腸。基本秒単位まで) な結果になると体内の状況7に譲渡。ここでは、この手順を実行する方法の詳細なプロトコルを提供して我々 が、利点および単離灌流ラット小腸と比較してこれらのモデルの制限を含む消化管ホルモンの分泌を勉強するための他の方法に説明します。
1 つは、特定の化合物が特定の消化管ホルモンの分泌を調節するかどうかを確立したい、人間の調査が究極の目標です。したがって、化合物 (生体または perfusions) で齧歯類の 1 つまたはいくつかの消化管ホルモンの分泌に大きな効果を示して 場合、ホルモンから分泌細胞 (細胞または細胞) この効果のみ医学と人体生理学に関連する場合が確認できます。人間。ヒトでは、実行することができます研究のタイプの明確な限界があるし、実験動物の生体内での研究は、したがって、多くの場合このような研究の 2 番目の最高のオプションです。マウスやラットは、便利なサイズ、低コスト、特定の調査の質問に関与している疑いがある遺伝子を遺伝的に変更するためのオプションのためにおそらく最も頻繁に使用される実験動物 (など特定の運送者のノックアウトまたは受容体)。一般に、体内のモデルは、生理学的にそのままであることから恩恵を受けるもいくつかの制限があります。齧歯動物、特にマウスの小型は制限要因である腸ホルモン定量化のためほとんどの試金は少なくとも 20 μ L を必要と最も重要なは、少なくとも意味プラズマ (、はるかに多く) 複製を作り撤退するが血の 100 μ L定量化。したがって、基準サンプルに対応する非常に少数のサンプルと (20 g のマウスの総血液量は ~1.4 mL) 1 つまたは 2 つの後刺激サンプルを入手することが可能です。その結果、潜在的な分泌応答 (例えば、急速にまたは遅く起こる応答) 乗り遅れたことがあります。
灌流モデルでこの問題を克服するため、大規模なサンプルとしてボリュームが得られる (流量: 7.5 mL/分)、短期間の急速な応答が逃されないということを確認するため必要に応じて、収集間隔を調整ことができます (我々 の収集分毎サンプル)7.別の問題齧歯動物の生体内研究ではほとんどの消化管ホルモンがさらに多く急速に削除または人間8,9,10、その後の生化学的分析を複雑にするかもしれないより代謝します。例えば、我々 は示した GLP 1 は人間のよりもさらに高速の速度でマウスで代謝されること (T1/2 1-2 分11) より重要なは、N 末端で胸の谷間だけでなく、GLP 1 のマウスの胸の谷間を含むジペプチジルペプチダーゼ-ペプチダーゼ-4 (DPP4) (ある主要な人間の GLP-1 分解酵素)、酵素の中性エンドペプチダーゼ 24.1112で胸の谷間をさらに。その結果、GLP-1 (7 36amide) のままのアイソ フォームまたは DPP 4 切断アイソ フォーム (9-39amide) に基づいているか、GLP-1 の定量化のため現在商業の試金は大幅にマウスにおける GLP 1 分泌を過小評価および結果の12. 単離灌流ラット小腸で分泌されたホルモンの代謝のほとんどは削除またはプラズマによる劣化は避け、肝臓、腎臓、肺抽出/劣化防止 (ので、著しく減少しています。出納を回収して腸から離れるにつれて)。
もちろん、遺伝子組み換え動物、例えば、ナトリウム-グルコース輸送体 1 ノックアウト マウス13の使用によって生成される重要な洞察が、しばしば分泌に関与する分子センサーの詳細な評価が必要です。細胞内タンパク質を異なる G タンパク質共役受容体からイオン チャネル分子の輸送に至るまで、複数の分子サイトの考察。たとえば、9 つの異なる分子サイトの活動は、分子センサー グルコース刺激 GLP 1 分泌7担当を解くとき対象と。同様の調査は、できるだけ体内の化合物のいくつかが非特異的または有害/致死効果ないでしょう。例えば、灌流の腸を使用している場合は、役割と同様に、2-4-ジニトロフェノール7,14 ATP 形成をブロックすることにより GLP 1, ニューロテンシンの分泌の細胞内グルコース代謝の役割を評価することが可能だった胆汁酸の電位依存性カルシウム チャネルは、GLP 1、NT および PYY の分泌3を刺激しました。確かに、灌流研究の非常に有毒なナトリウム チャネルのブロッカー テトロドトキシンを正常に適用できます。最後に、灌流モデルで直接評価できます。 どこ腸内で特定の化合物分泌を刺激するある特定のホルモンの調査官が単に選択し、灌流して目的の地域を準備し、同時に調べることができます。かどうか刺激は腸3,15,16の内腔または血管側から分子センサーの活性化によって分泌を引き起こします。
基になる消化管ホルモンの分泌は、によって学ぶことができる分泌のメカニズムは (人間の組織を含む)、腸組織部分の腸によって (、マウス、または人間の起源)、細胞を分泌不死化 (マウス) から通常のプライマリ腸の文化ホルモンを使用します。組織では、Ussing 室、(最も頻繁にマウスからの両方) organoids2,3,4,5,6,17,18をマウントされています。もちろん腸の部分の研究新鮮な人間の腸内へのアクセスが必要ですが、ひと腸内作品, 一次電池文化および細胞株に関する技術的に簡単に実行する、データを生成するより速くより安い方法腸 perfusions と比較して、標本。しかし、これらのモデルで、腸内の正常な細胞の分極は本質的に失われ、分子センサーの通常の活性化を評価するためにこれらのモデルを使用ことはできません吸収過程も調査することができないことを意味します。さらに、このような研究は通常静的な孵化を採用 (のいくつかの時間まで) は生理学的高度と分泌製品は削除されず、このようにフィードバックに影響を与える可能性がありますので、細胞の通常の分泌動態とは何もして、ホルモンの分泌。対照的に、灌流腸内分泌および吸収分子効率的に削除され、粘膜の微小循環体内、吸収と分泌の正常な率で発生することがので、経勾配が維持されていることを確認彼らは。つまりネイティブ細胞ペプチド コンテンツ面での代表的な分子センサーの表現であるもはや彼らはまだ可能性がありますが、ネイティブの enteroendocrine 細胞の起源から培養細胞がさらに、脱分化型問題のホルモンを分泌します。これは、例えば、GLP 1 分泌細胞ライン19のためのケースです。
それは、したがって、我々 の意見を一次電池文化またはセル行研究、スクリーニング目的のため生体内で実行することはできませんの種類の実験を実行するためや分離の灌流腸内で最も適しています。例えば、一次電池文化および培養細胞ラインの真の強さはその細胞内二次メッセンジャー (例えば Ca2 +キャンプ、NAD(P)H) をリアルタイムで監視できるし、ホルモン分泌細胞の電気信号は、20,21,22を調べた。さらに、その特異的阻害剤が利用可能な20,21,22,23,24ではない場合に特に便利である、siRNA の打撃が実行できます。Ussing 室でマウントされているマウスから腸のティッシュは、(マウス) から腸 organoids 中、胆汁酸刺激 GLP 1 分泌の分子機構を研究するため最近使用されており、人間の腸内の作品は、勉強のため使用されている、消化管ホルモン分泌17,25の分子の詳細。2円偏波であることから元の利点に対しすべてのこれらのモデルは静的な孵化を含みます。ただし、組織 7TM 受容体発現における種差以来重要である齧歯動物というよりも、人間のティッシュを使用して恩恵を人間の腸内の作品に関する研究、分子トランスポーター可能性があります異なる分子センシング経路種。実際には、このフィールドのほとんどのデータは、ブタ、マウス、ラットのいずれかに関する研究によって生成されている、これらの知見は、人間に転送できるかどうか、それはとらえどころのないまま。です、ただし、グルコース刺激 GLP 1 分泌の根底にある分子の検出機構は、マウス、ラット、男、間に似ている、安心とトランスクリプトームと peptidomic のプロファイリング マウス L 細胞の明らかに強いグローバル2 種7,18,26,27間の類似点。
単離灌流ラット小腸しかし、考慮すべきいくつかの制限があります。最も重要なは、標的ホルモン産生細胞の被験物質で直接活性化は、間接メカニズムによってというか原因が与えられた分泌反応に起因するかどうかを確認するは不可能です。例えば、KCl は即座に7の灌流腸から GLP 1 分泌を増加させるが、この L 細胞の直接脱分極の結果や L 細胞に近いニューロンの脱分極またはの効果に起因かどうか不明のままパラクリン刺激/阻害剤を同時発売。灌流の腸を使用して分泌の分子機構の解明を目指す研究から生じるデータする必要があります、したがって、常にコンテキストに配置するを確立する能力を高めるための他のより特定のモデルから取得したデータで因果関係。例えば、GLP 1 分泌細胞株 GLUTag28,29とプライマリ マウス L 細胞からのグルコース刺激 GLP 1 分泌はブドウ糖の運送者 (SGLT1、GLUT2) のアクティビティに依存します。分泌20L 細胞のグルコースの直接行動による主グルコース刺激 GLP 1 分泌する可能性があることを意味を減衰も灌流ラット小腸におけるこれらのトランスポーターをブロックします。灌流、腸のもう一つの重要な制限は、脂質の一部が、疎水性のための勉強は難しいことです。脂質消化 (脂肪酸、前記ジアシル リン、lysophosphatidylglycerols、等) の最終製品を調査することはできますが、準備が再エステル化することがありますが、脂質内 cellularly、おそらくそれらをパックにチロミクロン、細胞とその後続 lacteals 絨毛の吸収、チロミクロンの輸送が中断される分離腸のリンパの流れを確保できないので。ほとんどの場合、したがって、吸収製品が細胞内に蓄積する始めれば、脂質吸収が停止しました。体外電池システムは、偏波の欠如のためさらに少ない脂質研究に適しています。明らかに、この制限は、脂質吸収され、lacteals 経由にのみ関連、それらは腸の血管を介して吸収されるに対し、正常に処理される可能性があります。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals for perfusion buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.12018.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate (CaCl2 x 2 H2O)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>102382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran 70</td>
			<td>Pharmacosmos</td>
			<td>40014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fumaric acid disodium salt (C4H2Na2O4)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F9642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose (C6H12O6)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate hepatahydrate (MgSO4)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>105886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potasium chloride (KCl)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>104936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>104873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvic acid sodium salt (C3H3NaO4)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106619</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Merck</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium L-glutamate monohydrate (C5H8NNaO4 x H2O)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion equitment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universial perfusion system</td>
			<td>Harvard Bioscience, Inc.</td>
			<td>732316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BASIC UNIT UNIPER UP-100, TYPE 834</td>
			<td>Harvard Bioscience, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roller Pump, with four channels</td>
			<td>Harvard Bioscience, Inc.</td>
			<td>730100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Windkessel</td>
			<td>Harvard Bioscience, Inc.</td>
			<td>732068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostatic Circulator,Bath Volume 3L, 230V/50Hz</td>
			<td>Harvard Bioscience, Inc.</td>
			<td>730125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating table, heated on tripod stand, type 873</td>
			<td>Harvard Bioscience, Inc.</td>
			<td>733776</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cannula with basked, OD= 2.0mm, ID= 1.0mm</td>
			<td>Harvard Bioscience, Inc.</td>
			<td>733313</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mechanisms underlying gut hormone secretion using the isolated perfused rat small intestine

腸は、食欲と食物摂取、消化、栄養の吸収と配布、および食後血糖値ツアーを規制する 15 以上の異なるペプチド ホルモンを作り出す体の最大の内分泌臓器です。消化管ホルモンの分泌を調節する分子機構の解明、理解し、消化管ホルモンの生理学の翻訳のための基礎。従来、消化管ホルモン分泌のメカニズム (実験動物または人間) の in vivo 研究されているいずれかまたは粘膜腸ホルモン分泌プライマリを使用して細胞培養細胞します。消化管ホルモン分泌の研究のための代替方法として単離灌流ラット小腸を紹介します。このモデルの美徳は、それはほとんどの重要な生理学的パラメーター粘膜偏波、パラクリン関係のルートなど生体内での研究での分泌を担当を繰り返す意味、そのまま腸に依存します。灌流/刺激の露出。さらに、生体内での研究とは異なり、単離灌流ラット小腸、ほぼ完全に実験的制御と分泌を直接評価します。In vitro 試験と対照をなしてそれは大きさと分泌の重要な質問、どのような刺激を引き起こす腸内腔 (血管) のどちらの側からの分泌は、異なる消化管ホルモンの分泌などに力学の両方を研究することが可能刺激、分泌反応の基になる詳細分子センサーで分析します。さらに、準備は、腸管吸収および責任のトランスポーターを含む腸管の吸収動態に関する詳細の調査のための強力なモデルです。

与えられた刺激に関心の消化管ホルモンの分泌が原因かどうかを判断することは、安定したベースラインの分泌に依存します。さらに、刺激への応答は認められなかったが、肯定的な制御に堅牢な分泌応答が明らかにテスト刺激への応答の欠乏に応答性の一般的な不足が反映していないことを除外する必要があります。図 2Aおよび2B...

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Mechanisms Underlying Gut Hormone Secretion Using the Isolated Perfused Rat Small Intestine

免震を用いた消化管ホルモン分泌のメカニズム潅流ラット小腸

ここでは、消化管ホルモンの分泌と消化管吸収の分子機構を研究する強力な生理学的モデルを提案-単離灌流ラット小腸。

The gut is the largest endocrine organ of the body, producing more than 15 different peptide hormones that regulate appetite and food intake, digestion, ...

私たちがここで開発した方法は、腸からのホルモンの分泌の分子メカニズムだけでなく、栄養素の吸収、および両者の間の結合を調べようと、私たちの仕事に非常に有用であることが判明しました。この高度な生理学的技術の主な利点は、腸がその時に放置されている一方で、通常はIn Vitroモデル内でのみ行われる詳細な研究を可能にすることです。まず、加熱された手術台の上にラットを置き、つまみつまみつまみへの応答の欠如を確認し、腹腔を露出させるために皮膚および腹膜切除を行う。小腸を横に移動し、結腸の末端領域を露出させる。そして、結腸に供給血管系をリゲートします。徐々に結腸を抽出し、末端領域から始めて、小腸に向かって移動し、組織を等張生理食塩水で水分補給し、必要に応じて綿棒を使用して結合組織を除去する。結腸のすべてを取り除いたら、小腸管腔の近位端に15センチメートルのプラスチックチューブを挿入し、縫合糸でチューブを固定します。その後、10ミリリットルのシリンジと注射器ポンプを使用して、毎分25ミリリットルの流量で室温同位塩水で小腸を慎重に洗い流します。組織がチャイムを空にしたら、上部腸間膜動脈がアクセス可能になるように組織を調整し、結合組織と脂肪組織を取り除いて動脈を露出させる。細かい点鉗子を使用して、腸間膜動脈の下に2つの縫合線を配置し、門脈の下に2つの縫合線を配置します。ローリングポンプに取り付けられたプラスチック製の22ゲージカテーテルに灌流バッファーを充填し、外科用ハサミを使用して腸間膜動脈の小さな穴を切断し、すぐに切開部にカテーテルを挿入します。動脈に穴を開けてから2分以内にカテーテルを挿入し、そうでなければ腸が虚血性損傷を受ける可能性が高い。カテーテルが縫合糸で固定されるとすぐに、ローリングポンプを開始して毎分7.5ミリリットルの流量で灌流を開始します。腸管と門脈の血管が青白くなったら、門脈に穴を開ける。金属カテーテルを挿入し、別の縫合糸で金属カテーテルを固定します。静脈は薄い壁に付いてきたので、カテーテルを門脈に挿入する際には注意してください。しかし、ガードが浸透しているので、迅速な挿入は重要ではありません。1分間の灌流出力を収集した後、ボリュームを測定し、負荷記録プログラムで実験を実行をクリックして、灌流圧取得記録を開始します。その後、湿らせたラボ組織で腸を覆い、乾燥を防いで、腸の遠位端が塞がれていないことを確認し、明るいハプロイドが出ることができます。酸素と二酸化炭素の分圧を測定するには、臓器に入る直前、約3分間の灌流の後、そして門脈に挿入されたカテーテルから、3方向の停止コックバルブを介して灌流バッファーを収集します。サンプルを氷の上に置き、自動血液ガス分析装置を使用して、採取後すぐにサンプルを測定します。分数コレクターを使用して、最初のベースラインサンプルを取得します。ベースライン収集の10〜15分後、シリンジポンプを使用して、毎分35ミリリットルの流量で3ウェイストップコックを介して最初の動脈内試験覚醒剤を投与する。刺激の最初の5分間に毎分2.5ミリリットルの流量で送達された初期刺激ボア注射によって、光刺激を行い、続いてテスト溶液を毎分5ミリリットルの流量で投与する。発光刺激期間が過ぎるとすぐに、イソトニック生理食塩水で内腔を毎分2.5ミリリットルの流量で5分間洗い流します。次に、次の試験物質が投与される前に、15〜30分間毎分5ミリリットルのベースラインサンプルを収集します。実験終了時に、5~10分間の調製物の応答性を試験するための適切で陽性の制御を投与し、陽性対照刺激期間の終了時にベースラインサンプルを10〜15分収集し、さらに10~15分追加する。ここでは、良好な品質データの一例を示し、グルカゴン様ペプチド−1またはGLP-1を示し、1分間隔で採取した単離されたパーフューズドラット小腸からの分泌を示す。基礎条件下では、試験刺激と陽性制御の投与前後の両方で分泌が安定していたが、強固な分泌反応が明らかであった。これらのGLP-1分泌データは、単離されたパーフュードラット小腸から得られた、試験物質投与または陽性対照とは無関係であるように試験を通して上方に漂った基礎条件で測定された不安定な分泌物を有する質が悪い。したがって、血管フルクトース刺激の終了時に観察されたGLP-1分泌の増加がフルクトース媒介応答であったかどうかを結論付けることは不可能である。カテーテルを適切に固定し、灌流緩衝液として灌流装置を徹底的に洗浄するために、この手順を試みている間、細菌の増殖のための優れた媒体を提供する。この手順に従って、腸管細胞培養のホルモン分泌細胞株に関するIn Vitro研究のような他の方法は、環状AMPまたは細胞内カルシウムの細胞内産生を直接調査するために行うことができる。だから我々はすでに栄養素の吸収とホルモンの分泌のメカニズムの背後にあるプロセスの数の解明のために今この方法を使用しており、それは非常に有用であることが判明しました。分子部位のブロッカーやアクチベーターを使用することは非常に危険であり、ラボコート、手袋、安全メガネの使用などの予防措置は、この手順を実行している間は常にヒュームフードを取るべきであることを忘れないでください。

Research

JoVE Journal

Medicine

Isolating and Using Sections of Bovine Mesenteric Artery and Vein as a Bioassay to Test for Vasoactivity in the Small Intestine

バイオアッセイとしてウシ腸間膜動脈と静脈の切片を分離して使用すると、小腸で血管作用をテストするために

Mammalian gastrointestinal systems are constantly exposed to compounds (desirable and undesirable) that can have an effect on blood flow to and from that ...

Glutamate and Hypoxia as a Stress Model for the Isolated Perfused Vertebrate Retina

単離された灌流脊椎動物の網膜のためのストレスモデルとしてグルタミン酸および低酸素症

Neuroprotection has been a strong field of investigation in ophthalmological research in the past decades and affects diseases such as glaucoma, retinal ...

Method of Isolated Ex Vivo Lung Perfusion in a Rat Model: Lessons Learned from Developing a Rat EVLP Program

Method of Isolated Ex Vivo Lung Perfusion in a Rat Model: Lessons Learned from Developing a Rat EVLP Program

孤立の方法<em&gt;エクスビボ</emラットモデルにおける&gt;肺灌流：ラットEVLPプログラムの開発の教訓

The number of acceptable donor lungs available for lung transplantation is severely limited due to poor quality. Ex-Vivo Lung Perfusion (EVLP) has allowed ...

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

アン<em&gt;エクスビボ</emヒト乳癌でホルモンの作用を研究するために&gt;モデル

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

Induction and Assessment of Ischemia-reperfusion Injury in Langendorff-perfused Rat Hearts

ランゲンドルフ灌流ラット心臓における虚血再灌流傷害の誘導と評価

The biochemical events surrounding ischemia reperfusion injury in the acute setting are of great importance to furthering novel treatment options for ...

The Inverted Heart Model for Interstitial Transudate Collection from the Isolated Rat Heart

単離されたラット心臓からのインタースティシャル透過性収集のための逆心モデル

The present protocol describes a unique approach that enables the collection of cardiac transudate (CT) from the isolated, saline-perfused rat heart. ...

Evaluation of Vascular Control Mechanisms Utilizing Video Microscopy of Isolated Resistance Arteries of Rats

分離抵抗性ラットの動脈のビデオ顕微鏡を用いた血管制御機構の評価

This protocol describes the use of in vitro television microscopy to evaluate vascular function in isolated cerebral resistance arteries (and other ...

An Efficient Sieving Method to Isolate Intact Glomeruli from Adult Rat Kidney

ラット腎臓からそのまま糸球体を分離する効率的なふるい分け法

Preservation of glomerular structure and function is pivotal in the prevention of glomerulonephritis, a category of kidney disease characterized by ...

Robot-assisted Total Mesorectal Excision and Lateral Pelvic Lymph Node Dissection for Locally Advanced Middle-low Rectal Cancer

局所進行中低直腸癌に対するロボット支援全中腸切除および横骨盤リンパ節切断

Since their approval for clinical use, da Vinci surgical robots have shown great advantages in gastrointestinal surgical operations, especially in complex ...

A Model of Long-Term Ventricular Fibrillation in Isolated Rat Hearts

単離ラット心臓における長期心室細動のモデル

Ventricular fibrillation (VF) is a fatal arrhythmia with a high incidence in cardiac patients, but VF arrest under perfusion is a neglected method of ...