Name: mechanisms underlying gut hormone secretion using the isolated perfused rat small intestine
Uploaded: 2019-02-26T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mechanisms Underlying Gut Hormone Secretion Using the Isolated Perfused Rat Small Intestine at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av en ubegrenset tilskudd til Prof Jens Juul Holst fra Novo Nordisk Center for grunnleggende metabolske forskning (Novo Nordisk Foundation, Danmark), en separat bevilgning fra Novo Nordisk Foundation for å gjøre gnager perfusjon studier (gi nei. NNF15OC0016574), et stipend til Prof Holst fra europeiske Research Council (Grant no.695069) og theEuropean Union er syvende rammeprogram for forskning, TechnologicalDevelopment og demonstrasjon aktiviteter (Grant nr. 266408) samt postdoc gi til Rune E. Kuhre fra Lundbeck Foundation (R264-2017-3492). Vi takker Jenna E. Hunt og Carolyn F. Deacon for forsiktig korrekturlesing.

Alle studier ble gjennomført med tillatelse fra dansk dyr eksperimenter Inspectorate (2013-15-2934-00833) og den lokale etiske komiteen, i henhold til veiledning av danske lovgivning om dyr eksperimentering (1987) og National Institutter for helse (publikasjonsnummer 85-23).
1. forsøksdyr
<ol><li>Få Wistar hannrotter (250 g) og huset 2 per bur, ad lib tilgang til standard chow og vann, og opprettholde i en 12:12 h lys og mørke syklus. Hotellet dyr bruker ikke-behandlet vann og Alrtromin...

<ol>
	<li>Rindi, G., Leiter, A. B., Kopin, A. S., Bordi, C., Solcia, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+&amp;#34;normal&amp;#34;+endocrine+cell+of+the+gut:+changing+concepts+and+new+evidences.">The &amp;#34;normal&amp;#34; endocrine cell of the gut: changing concepts and new evidences.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1014, 1-12 (2004).</li><li>Brighton, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bile+Acids+Trigger+GLP-1+Release+Predominantly+by+Accessing+Basolaterally+Located+G+Protein-Coupled+Bile+Acid+Receptors.">Bile Acids Trigger GLP-1 Release Predominantly by Accessing Basolaterally Located G Protein-Coupled Bile Acid Receptors.</a> Endocrinology. 156, 3961-3970 (2015).</li><li>Kuhre, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bile+acids+are+important+direct+and+indirect+regulators+of+the+secretion+of+appetite-+and+metabolism-regulating+hormones+from+the+gut+and+pancreas.">Bile acids are important direct and indirect regulators of the secretion of appetite- and metabolism-regulating hormones from the gut and pancreas.</a> Molecular Metabolism. , (2018).</li><li>Roberge, J. N., Brubacker, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretion+of+Proglucagon-Derived+Peptides+in+Response+to+Intestinal+Luminal+Nutrients.">Secretion of Proglucagon-Derived Peptides in Response to Intestinal Luminal Nutrients.</a> Endocrinology. 128, 3169-3174 (1991).</li><li>Brubaker, P. L., Schloos, J., Drucker, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+glucagon-like+peptide-1+synthesis+and+secretion+in+the+GLUTag+enteroendocrine+cell+line.">Regulation of glucagon-like peptide-1 synthesis and secretion in the GLUTag enteroendocrine cell line.</a> Endocrinology. 139, 4108-4114 (1998).</li><li>Jacobsen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+Gastrointestinal+Hormone+Responses,+Insulin+Sensitivity,+and+Beta-Cell+Function+Within+2+Weeks+After+Gastric+Bypass+in+Non-diabetic+Subjects.">Changes in Gastrointestinal Hormone Responses, Insulin Sensitivity, and Beta-Cell Function Within 2 Weeks After Gastric Bypass in Non-diabetic Subjects.</a> Obesity Surgery. 22, 1084-1096 (2012).</li><li>Kuhre, R. E., Frost, C. R., Svendsen, B., Holst, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+glucose-stimulated+GLP-1+secretion+from+perfused+rat+small+intestine.">Molecular mechanisms of glucose-stimulated GLP-1 secretion from perfused rat small intestine.</a> Diabetes. 64, 370 (2014).</li><li>Svendsen, B., Holst, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+gut+hormone+secretion.+Studies+using+isolated+perfused+intestines.">Regulation of gut hormone secretion. Studies using isolated perfused intestines.</a> Peptides. 77, 47-53 (2016).</li><li>Ratner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Peripheral+Neurotensin+on+Appetite+Regulation+and+Its+Role+in+Gastric+Bypass+Surgery.">Effects of Peripheral Neurotensin on Appetite Regulation and Its Role in Gastric Bypass Surgery.</a> Endocrinology. 157, 3482-3492 (2016).</li><li>Wewer Albrechtsen, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+glucagon+secretion+in+mice+and+rats+revealed+using+a+validated+sandwich+ELISA+for+small+sample+volumes.">Dynamics of glucagon secretion in mice and rats revealed using a validated sandwich ELISA for small sample volumes.</a> American Journal of Physiology Endocrinology and Metabolism. 311, E302-E309 (2016).</li><li>Vilsboll, T., Agerso, H., Krarup, T., Holst, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Similar+elimination+rates+of+glucagon-like+peptide-1+in+obese+type+2+diabetic+patients+and+healthy+subjects.">Similar elimination rates of glucagon-like peptide-1 in obese type 2 diabetic patients and healthy subjects.</a> The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 88, 220-224 (2003).</li><li>Windelov, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+is+it+so+difficult+to+measure+glucagon-like+peptide-1+in+a+mouse?.">Why is it so difficult to measure glucagon-like peptide-1 in a mouse?.</a> Diabetologia. 60, 2066-2075 (2017).</li><li>Gorboulev, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Na+-d-glucose+Cotransporter+SGLT1+is+Pivotal+for+Intestinal+Glucose+Absorption+and+Glucose-Dependent+Incretin+Secretion.">Na+-d-glucose Cotransporter SGLT1 is Pivotal for Intestinal Glucose Absorption and Glucose-Dependent Incretin Secretion.</a> Diabetes. 61, 187-196 (2012).</li><li>Kuhre, R. E., Bechmann, L. E., Wewer Albrechtsen, N. J., Hartmann, B., Holst, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+stimulates+neurotensin+secretion+from+the+rat+small+intestine+by+mechanisms+involving+SGLT1+and+GLUT2,+leading+to+cell+depolarization+and+calcium+influx.">Glucose stimulates neurotensin secretion from the rat small intestine by mechanisms involving SGLT1 and GLUT2, leading to cell depolarization and calcium influx.</a> American Journal of Physiology Endocrinology and Metabolism. 308, E1123-E1130 (2015).</li><li>Kuhre, R. E., Christiansen, C. B., Saltiel, M. Y., Wewer Albrechtsen, N. J., Holst, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+relationship+between+glucose+absorption+and+glucose-stimulated+secretion+of+GLP-1,+neurotensin,+and+PYY+from+different+intestinal+segments+in+the+rat.">On the relationship between glucose absorption and glucose-stimulated secretion of GLP-1, neurotensin, and PYY from different intestinal segments in the rat.</a> Physiological Reports. 5, (2017).</li><li>Svendsen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+cosecretion+and+coexpression+of+gut+hormones+from+male+rat+proximal+and+distal+small+intestine.">An analysis of cosecretion and coexpression of gut hormones from male rat proximal and distal small intestine.</a> Endocrinology. 156, 847-857 (2015).</li><li>Goldspink, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+insights+into+the+detection+of+free+fatty+and+bile+acids+by+ileal+glucagon-like+peptide-1+secreting+cells.">Mechanistic insights into the detection of free fatty and bile acids by ileal glucagon-like peptide-1 secreting cells.</a> Molecular Metabolism. 7, 90-101 (2018).</li><li>Sun, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+Controlling+Glucose-Induced+Glp-1+Secretion+in+Human+Small+Intestine.">Mechanisms Controlling Glucose-Induced Glp-1 Secretion in Human Small Intestine.</a> Diabetes. , (2017).</li><li>Kuhre, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+production+and+secretion+in+GLUTag,+NCI-H716+and+STC-1+cells:+a+comparison+to+native+L-cells.">Peptide production and secretion in GLUTag, NCI-H716 and STC-1 cells: a comparison to native L-cells.</a> Journal of Molecular Endocrinology. 56, 11 (2016).</li><li>Reimann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+sensing+in+L+cells:+a+primary+cell+study.">Glucose sensing in L cells: a primary cell study.</a> Cell Metabolism. 8, 532-539 (2008).</li><li>Reimann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+functional+role+of+voltage+gated+cation+conductances+in+the+glucagon-like+peptide-1+secreting+GLUTag+cell+line.">Characterization and functional role of voltage gated cation conductances in the glucagon-like peptide-1 secreting GLUTag cell line.</a> The Journal of Physiology. 563, 161-175 (2005).</li><li>Kuhre, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fructose+stimulates+GLP-1+but+not+GIP+secretion+in+mice,+rats+and+humans.">Fructose stimulates GLP-1 but not GIP secretion in mice, rats and humans.</a> American journal of physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 306, G622-G630 (2014).</li><li>Reimann, F., Tolhurst, G., Gribble, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G-Protein-Coupled+Receptors+in+Intestinal+Chemosensation.">G-Protein-Coupled Receptors in Intestinal Chemosensation.</a> Cell Metabolism. 15, 421-431 (2012).</li><li>Parker, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+underlying+bile+acid-stimulated+glucagon-like+peptide-1+secretion.">Molecular mechanisms underlying bile acid-stimulated glucagon-like peptide-1 secretion.</a> British Journal of Pharmacology. 165, 414-423 (2012).</li><li>Petersen, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+L+cells+in+mouse+and+human+small+intestine+organoids.">Generation of L cells in mouse and human small intestine organoids.</a> Diabetes. 63, 410-420 (2014).</li><li>Parker, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predominant+role+of+active+versus+facilitative+glucose+transport+for+glucagon-like+peptide-1+secretion.">Predominant role of active versus facilitative glucose transport for glucagon-like peptide-1 secretion.</a> Diabetologia. 55, 2445-2455 (2012).</li><li>Roberts, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Human+and+Murine+Enteroendocrine+Cells+by+Transcriptomic+and+Peptidomic+Profiling.">Comparison of Human and Murine Enteroendocrine Cells by Transcriptomic and Peptidomic Profiling.</a> Diabetes. , (2019).</li><li>Reimann, F., Gribble, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose-Sensing+in+Glucagon-Like+Peptide-1-Secreting+Cells.">Glucose-Sensing in Glucagon-Like Peptide-1-Secreting Cells.</a> Diabetes. 51, 2757-2763 (2002).</li><li>Drucker, D. J., Jin, T., Asa, S. L., Young, T. A., Brubaker, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+proglucagon+gene+transcription+by+protein+kinase-A+in+a+novel+mouse+enteroendocrine+cell+line.">Activation of proglucagon gene transcription by protein kinase-A in a novel mouse enteroendocrine cell line.</a> Molecular Endocrinology. 8, 1646-1655 (1994).</li><li>Svendsen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GLP1-+and+GIP-producing+cells+rarely+overlap+and+differ+by+bombesin+receptor-2+expression+and+responsiveness.">GLP1- and GIP-producing cells rarely overlap and differ by bombesin receptor-2 expression and responsiveness.</a> The Journal of Endocrinology. 228, 39-48 (2016).</li><li>Bak, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity+and+sensitivity+of+commercially+available+assays+for+glucagon-like+peptide-1+(GLP-1):+implications+for+GLP-1+measurements+in+clinical+studies.">Specificity and sensitivity of commercially available assays for glucagon-like peptide-1 (GLP-1): implications for GLP-1 measurements in clinical studies.</a> Diabetes, Obesity &amp; Metabolism. 16, 1155-1164 (2014).</li><li>Jacobsen, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+gastric+bypass+surgery+on+glucose+absorption+and+metabolism+during+a+mixed+meal+in+glucose-tolerant+individuals.">Effects of gastric bypass surgery on glucose absorption and metabolism during a mixed meal in glucose-tolerant individuals.</a> Diabetologia. 56, 2250-2254 (2013).</li></ol>

Tynntarmen isolert perfused rotten er et kraftig søkeverktøy som lar dynamikk og molekylære mekanismer underliggende gut hormon sekresjonen å bli undersøkt i detalj. Det viktigste trinnet for vellykket produksjon av data med denne modellen er kirurgisk operasjon. Håndtering av tarmen vil uunngåelig føre til noen skade på tarmen og bør holdes til et absolutt minimum. Enda viktigere, er hastigheten på operasjonen nøkkelen, særlig med hensyn til tidspunktet for kateter plassering i hvem arterien. Vår erfaring ...

Tarmen er den største endokrine organet i kroppen, produsere mer enn 15 forskjellige peptidhormonene som regulerer nærings absorpsjon og næringsstoffer disposition, intestinal vekst og modulere appetitt1. Gut hormoner er derfor involvert i mange grunnleggende fysiologiske prosesser, og forstå disse mønstrene av sekresjon og molekylære detaljene som kontrollerer utskillelsen av respektive hormoner er derfor viktig for våre grunnleggende fysiologiske forståelse og adressering translasjonsforskning aspekter av tarmen hormon handlinger; men hvordan kan man studere molekylære sensing mekanismene bak gut hormon sekresjonen? Generelt, hormon sekresjonen kan studeres i intakt organismer (mennesker eller forsøksdyr), fra isolert gut forberedelser eller tarmen hormon-sekresjon primært cellekulturer eller udødeliggjort celle kulturer2,3, 4 , 5 , 6. vår modell er isolert perfused rotte tynntarm, som er en fysiologisk relevante modell som gjør at utskillelsen av tarmen hormoner bli studert i detalj med optimale tidspunktet oppløsning (sekresjon priser kan fastsettes med helst base til andre), og resultatene er trolig overføres til en i vivo situasjonen7. Her gir vi en detaljert protokoll om hvordan du utfører denne prosedyren, men først vil vi diskutere andre metoder for å studere gut hormon sekresjon, inkludert fordelene og ulempene av disse modellene sammenlignet tynntarmen isolert perfused rotte.
Hvis man ønsker å etablere om et bestemt stoff regulerer utskillelsen av bestemte gut hormoner, er studier i mennesker det endelige målet. Dermed, hvis en sammensatt viser store effekter på utskillelsen av én eller flere gut hormoner i Red (i vivo eller perfusions) eller fra hormon sekresjon celler (linjer eller primære celler), dette er bare relevant for medisin og menneskelige fysiologi hvis det kan bekreftes hos mennesker. Men det er klare grenser for typen studier som kan utføres i mennesker, og i vivo studier på forsøksdyr er derfor ofte det nest beste alternativet for slike studier. Mus og rotter er de mest brukte forsøksdyr antagelig på grunn av praktisk størrelse, lave kostnader og muligheten til å endre genetisk genene mistenkelige i konkret studiespørsmål (f.eks slå av en bestemt transporter eller reseptor). Generelt, i vivo modellene nytte blir fysiologisk intakt, men har også flere begrensninger. Viktigst, den lille størrelsen på gnagere, spesielt mus, er en begrensende faktor, som de fleste analyser for gut hormon kvantifisering krever minst 20 µL av plasma (og ofte mye mer), noe som betyr at minst 100 µL av blod må trekkes for å lage en kopi kvantifisering. Derfor er det bare mulig å få svært få prøver tilsvarende planlagte prøver og en eller to etter stimulering prøver (total blod volumet i en mus 20 g er ~1.4 mL). Følgelig potensielle sekretoriske svar (f.eks, raskt eller sent forekommende svar) kan derfor bli savnet.
I perfusjonsmåler modell, problemet er overvunnet, som stort utvalg volumer er oppnådd (flyt: 7,5 mL/min) og innsamlingsintervallene kan justeres for å sikre at rask og kortvarig svarene ikke er savnet (vi samle prøver hvert minutt)7 . Et annet problem med i vivo studier i gnagere er at de fleste gut hormoner er enda mer raskt eliminert eller metaboliseres enn i mennesker8,9,10, som kan komplisere påfølgende biokjemiske analysen. For eksempel vi viste at GLP-1 metaboliseres i mus på enda raskere enn hos mennesker (der T1/2 er 1-2 min11) og, enda viktigere, som spalting av GLP-1 i mus innebærer, i tillegg til N-terminal spalting av dipeptidyl-peptidase-4 (DPP4) (som er den store GLP-1 nedverdigende enzymet hos mennesker), videre spalting av enzymet nøytrale endopeptidase 24.1112. Følgelig gjeldende kommersielle analyser for kvantifisering av GLP-1, som enten basert på den intakte isoformen GLP-1 (7-36amide) eller DPP-4 kløyvde isoformen (9-39amide), vesentlig undervurderer GLP-1 sekresjon i mus og føre villedende resultater 12. i isolerte perfused rotte tynntarm, de fleste av metabolismen av utskilles hormoner eliminert eller markert redusert, siden plasma-mediert fornedrelse unngåes, og lever/nyre/lungekreft utvinning/degradering deaktiveres fordi ( perfusate er samlet som det går tarmen).
Selvfølgelig viktig innsikt kan genereres ved bruk av genmodifiserte dyr, f.eks, natrium-glukose transporter-1 knockout mus13, men en detaljert vurdering av molekylære sensorene involvert i sekresjon ofte krever vurdering av flere molekylær områder, fra molekylær transportører ion kanaler og fra ulike G-protein-kombinert reseptorer intracellulær proteiner. For eksempel målrettet vi aktiviteten av ni ulike molekylær nettsteder når unraveling molekylær sensorene ansvarlig for glukose-stimulert GLP-1 sekresjon7. En lignende undersøkelse ville ikke være mulig i vivo som noen av forbindelsene som brukes har uspesifikke eller skadelig/dødelig effekt. For eksempel når du bruker perfused tarmen, var det mulig å vurdere rollen intra mobilnettet glukose metabolisme for utskillelsen av GLP-1 og neurotensin ved å blokkere ATP formasjon med 2-4-dinitrophenol7,14 , samt rollen spenning-gated kalsium kanaler for Gallesyre stimulert GLP-1, NT og PYY sekresjon3. Faktisk kan svært giftige natrium kanal blokkering tetrodotoxin med hell brukes i perfusjon studiene. Til slutt, i perfusjonsmåler modell det kan direkte vurderes der i tarmen en viss sammensatt stimulerer utskillelsen av en viss hormon, som etterforskeren kan bare velge og forberede ønsket område til perfuse, og det kan undersøkes samtidig om en stimulans forårsaker sekresjon av aktivering av molekylære sensorer fra luminal eller vaskulær side av tarmen3,15,16.
Sekretoriske mekanismer underliggende gut hormon sekresjonen kan også bli studert ved bruk av tarmen tissue (inkludert menneskelig vev), primære intestinal kulturer (vanligvis fra mus), udødeliggjort hormon sekresjon cellelinjer (av mus eller menneskelige opprinnelse), av tarmen vev montert i Ussing rom eller organoids (begge oftest fra mus)2,3,,4,,5,,6,,17,,18. Sammenlignet med intestinal perfusions, studier av menneskelige tarmen stykker, primært cellekulturer og linjer er teknisk enklere å utføre og er en raskere og billigere måte å generere data, men selvfølgelig studiet av tarmen stykker krever tilgang til friske menneskelige tarmen prøver. Men i disse modellene er normal celle polarisering av tarmen iboende tapt, betyr at disse modellene kan ikke brukes til å vurdere normal aktivering av molekylære sensorer, og absorpsjon prosesser også ikke kan studeres. Videre slike studier bruker vanligvis statisk incubations (for opptil flere h) som er svært ikke-fysiologiske og har ingenting å gjøre med cellene normale sekretoriske dynamikk, fordi secreted produktet ikke er fjernet og dermed kan tilbakemeldinger påvirke den utskillelse av hormoner. I kontrast i perfused tarmen fjernet skilles ut og absorbert molekyler effektivt av slimhinnene mikrosirkulasjonen som de er i vivo, sikre at transmucosal graderingene vedlikeholdes slik at absorpsjon og sekresjon kan oppstå med en normal hastighet. Videre kan cellekulturer ha dedifferentiated fra deres native enteroendocrine celle opprinnelse, og betyr at de er ikke lenger representant for de opprinnelige cellene i peptid innhold og uttrykk for molekylær sensorer, men de kan fortsatt skille ut hormonet i spørsmålet. Dette er for eksempel tilfellet for GLP-1 sekresjon cellen linjer19.
Det er derfor vår mening at primært cellekulturer eller celle linje studier er mest egnet for screening formål og utføre typer eksperimenter som ikke kan utføres i vivo eller i isolerte perfused tarmen. For eksempel, en ekte styrke primært cellekulturer og linje cellekulturer er at intra mobilnettet videregående messengers (f.eks Ca2 +, leiren, NAD(P)H) kan overvåkes i sanntid og elektriske signalene med hormonet sekresjon celler kan undersøkt20,21,22. I tillegg kan siRNA knockdown gjøres, som er spesielt nyttig hvis bestemt hemmere ikke tilgjengelig20,21,22,23,24. Gut vev fra mus montert i Ussing rom har nylig blitt brukt for å studere molekylære mekanismer underliggende Gallesyre stimulert GLP-1 sekresjon, mens intestinal organoids (fra mus) og menneskelige tarmen stykker har også blitt brukt for å studere den molekylær detaljer gut hormon sekresjonen17,25. Mens tidligere fordelene blir polarisert2 omfatter alle disse modellene statiske incubations. Studier på menneskelige tarmen stykker, imidlertid dra fordel av menneskelige, i stedet for gnagere, vev som er viktig siden arter aldersforskjell vev uttrykk for 7TM reseptorer og molekylære transportører kan resultere i ulike molekylær sensing veier mellom arter. Faktisk de fleste dataene i dette feltet har blitt generert av studier på griser, mus eller rotter, og det er fortsatt flyktig om disse funnene kan overføres til mennesker. Det er betryggende at molekylære sensing mekanismer underlie glukose-stimulert GLP-1 sekresjon synes å ligne mellom mus, rotte, mann, og transcriptomic og peptidomic profilering av mus og L-menneskeceller avslørte sterk global likheter mellom de to arter7,18,26,27.
I isolerte perfused rotte tynntarm, men har også noen begrensninger som bør vurderes. Viktigst, er det umulig å avgjøre om en gitt sekretoriske respons resultatene fra direkte aktivering av testen stoffet målrettet hormon-produserende cellene eller snarere er forårsaket av en indirekte mekanisme. For eksempel KCl øker kjapt GLP-1 sekret fra perfused tarmen7, men det er ukjent om dette er en konsekvens av direkte depolarization L-cellen eller resultatene fra depolarization av neurons nær L-cellene eller virkningen av ble paracrine stimulators/hemmere. Oppstår fra studier med perfused tarmen som mål å belyse molekylære mekanismer underliggende sekresjon bør derfor alltid settes i sammenheng med data fra andre mer spesifikke modeller å øke muligheten til å opprette kausalitet. For eksempel, glukose-stimulert GLP-1 sekret fra GLP-1 secreting celle linjen GLUTag28,29 og hovedknappen på musen L-celler, avhenger av aktiviteten til glukose transportører (SGLT1 og GLUT2). Blokkerer disse transportører i tynntarmen perfused rotte også demper sekresjon20, noe som betyr at det er sannsynlig at glukose-stimulert GLP-1 sekresjon er hovedsakelig formidlet av direkte handlinger av glukose L-cellen. En annen viktig begrensning av isolerte perfused tarmen er at noen av lipider er vanskelig å studere på grunn av deres hydrophobicity. Selv om det er mulig å undersøke siste produkter av lipid fordøyelse (fettsyrer, diacyl glycerols, lysophosphatidylglycerols, etc.) og selv om utarbeidelse kunne re forestre lipider intra-cellularly og kanskje pakke dem inn chylomicrons, transport av chylomicrons celler og deres påfølgende opptak av lacteals av villi blir forstyrret, siden lymfe strømmer i isolerte tarmen ikke kan sikres. Mest sannsynlig, derfor lipid absorpsjon er stoppet når absorbert produktene begynner å samle i cellene. I vitro celle systemene er enda mindre egnet for lipid studier fordi polarisering. Selvfølgelig denne begrensningen gjelder bare for lipider som er absorbert og transportert via lacteals, mens de absorberes via intestinal blodårer er sannsynlig å behandles normalt.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals for perfusion buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.12018.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate (CaCl2 x 2 H2O)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>102382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran 70</td>
			<td>Pharmacosmos</td>
			<td>40014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fumaric acid disodium salt (C4H2Na2O4)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F9642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose (C6H12O6)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate hepatahydrate (MgSO4)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>105886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potasium chloride (KCl)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>104936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>104873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvic acid sodium salt (C3H3NaO4)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106619</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Merck</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium L-glutamate monohydrate (C5H8NNaO4 x H2O)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion equitment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universial perfusion system</td>
			<td>Harvard Bioscience, Inc.</td>
			<td>732316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BASIC UNIT UNIPER UP-100, TYPE 834</td>
			<td>Harvard Bioscience, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roller Pump, with four channels</td>
			<td>Harvard Bioscience, Inc.</td>
			<td>730100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Windkessel</td>
			<td>Harvard Bioscience, Inc.</td>
			<td>732068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostatic Circulator,Bath Volume 3L, 230V/50Hz</td>
			<td>Harvard Bioscience, Inc.</td>
			<td>730125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating table, heated on tripod stand, type 873</td>
			<td>Harvard Bioscience, Inc.</td>
			<td>733776</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cannula with basked, OD= 2.0mm, ID= 1.0mm</td>
			<td>Harvard Bioscience, Inc.</td>
			<td>733313</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mechanisms underlying gut hormone secretion using the isolated perfused rat small intestine

Tarmen er den største endokrine organet i kroppen, produsere mer enn 15 forskjellige peptidhormonene som regulerer appetitten og mat inntak, fordøyelsen, Nærings absorpsjon og distribusjon og etter prandial glukose utflukter. Forstå molekylære mekanismer som regulerer gut hormon sekresjon er grunnleggende for å forstå og oversette gut hormon fysiologi. Tradisjonelt mekanismene bak gut hormon sekresjon er enten studerte i vivo (i forsøksdyr eller mennesker) eller bruke gut hormon-sekresjon primære mucosal celle kulturer eller cellelinjer. Her introduserer vi en isolert perfused rotte tynntarmen som en alternativ metode for å studere gut hormon sekresjonen. Dydene av denne modellen er at den er avhengig av intakt tarmen, noe som betyr at den viser de fleste fysiologisk viktige parametere som ansvarlig for utskillelsen i i vivo studier, inkludert mucosal polarisering, paracrine relasjoner og ruter perfusjon/stimulans eksponering. I tillegg, og i motsetning til i vivo studier, gir tynntarm isolert perfused rotte nesten fullstendig eksperimentelle kontroll og direkte vurdering av sekresjon. I motsetning til in vitro studier er det mulig å studere både omfang og dynamikken av sekresjon og adresse viktig spørsmål, for eksempel hva stimuli forårsake utskillelse av ulike gut hormoner, fra hvilken side av tarmen (luminal eller vaskulær) er utskillelsen stimuleres, og analysere i detalj molekylær sensorer underliggende sekretoriske svaret. I tillegg er utarbeidelse en effektiv modell for studiet av intestinal absorpsjon og detaljer om dynamikken i intestinal absorpsjon inkludert ansvarlig transportører.

Muligheten til å bestemme om en bestemt stimulans forårsaker utskillelsen av tarmen hormonet av interesse er avhengig av en jevn planlagte sekret. Videre, hvis ingen svar på stimulans er observert, robust sekretoriske Svar å positiv kontrollen være tydelig å utelukke at mangelen på respons til test stimulans ikke gjenspeiler en generell mangel på respons. Figur 2A og 2B viser et eksempel på god kvalitetsdata. GLP-1 sekret fra tynntar...

Watch this Scientific Journal Video about Mechanisms Underlying Gut Hormone Secretion Using the Isolated Perfused Rat Small Intestine at JoVE.com

Mechanisms Underlying Gut Hormone Secretion Using the Isolated Perfused Rat Small Intestine

Mekanismene bak Gut hormon sekresjonen bruker den isolerte Perfused rotte tynntarmen

Her presenterer vi en kraftig og fysiologiske modell for å studere molekylære mekanismer underliggende gut hormon sekresjon og intestinal absorpsjon, tynntarm isolert perfused rotte.

The gut is the largest endocrine organ of the body, producing more than 15 different peptide hormones that regulate appetite and food intake, digestion, ...

Metoden vi har utviklet her har vist seg å være svært nyttig i vårt arbeid, prøver å finne ut de molekylære mekanismene for sekresjon av hormoner fra tarmen, men også absorpsjon av næringsstoffer, og koblingen mellom de to. Den største fordelen med denne svært fysiologiske teknikken er at tarmen er igjen in situ, samtidig som detaljerte studier som vanligvis bare utføres i In Vitro-modeller. Først plasserer rotten på et oppvarmet operasjonsbord, bekrefter mangel på respons på tåklemmen, og gjør en hud og bukhinneal eksisjon for å avsløre bukhulen.Flytt tynntarmen til siden for å eksponere kolonområdet. Og ligate levere vaskulatur til tykktarmen. Trekk gradvis ut tykktarmen, fra terminalområdet, og beveger seg mot tynntarmen, hydrerer vevet med isotonisk saltvann og bruker bomullspinner for å fjerne bindevevet etter behov.Når hele tykktarmen er fjernet, setter du inn et 15 centimeter stykke plastrør i den proksimale enden av den lille tarmlumen, og fest slangen med suturer. Bruk deretter en 10-milliliter sprøyte og en sprøytepumpe for å skylle tynntarmen forsiktig med romtemperatur isotonisk saltvann med en 25-milliliter per minutt strømningshastighet. Når vevet er tømt for chyme, juster vevet slik at den øvre mesenteriske arterien er tilgjengelig og fjerner bindevevet og fettvevet for å avsløre arterien.Bruk fine punkt tang for å plassere to suturer under mesenterisk arterie og to suturer under portalvenen. Fyll et plast22-gauge kateter festet til en rullende pumpe med perfusjonsbuffer og bruk et par kirurgisk saks til å kutte et lite hull i den mesenteriske arterien, og sett umiddelbart kateteret inn i snittet. Sett inn kateteret innen to minutter etter å ha kuttet et hull i arterien, ellers vil tarmen sannsynligvis lide av iskemisk skade.Så snart kateteret er sikret med en sutur, start rullepumpen for å starte perfusjon med en 7,5 milliliter per minutt strømningshastighet. Når blodårene i tarmen og portalvenen blir blek, kutt et hull i portalvenen. Sett inn et metallkateter, og fest metallkateteret med en annen sutur.Vær forsiktig når du setter kateteret inn i portalvenen, da venen er tynnvegget. Men siden vakten nå blir perfundert, er rask innsetting ikke avgjørende. Etter å ha samlet perfusjonsutgangen i ett minutt, måler du volumet og klikker på utfør eksperiment i trykkopptaksprogrammet for å starte videoopptakene for perfusjonstrykk.Dekk deretter tarmen med et fuktet laboratorievev for å holde det fra å tørke ut, og bekreft at den distale enden av tarmen ikke er blokkert, og en luminal haploid kan avslutte. For å måle det delvise trykket av oksygen og karbondioksid, samle perfusjonsbuffer gjennom en treveis stop-cock ventil umiddelbart før den kommer inn i orgelet, etter omtrent tre minutter med perfusjon, og fra kateteret satt inn i portalvenen. Plasser prøvene på is, og bruk en automatisert blodgassanalysator til å måle prøvene kort tid etter innsamling.Bruk en fraksjonsinnhenting til å få de første grunnlinjeeksemplene. Etter 10 til 15 minutter med baseline samling, bruk en sprøytepumpe til å administrere den første intraarteriale teststimulerende gjennom en treveis stop-cock med en 35 milliliter per minutt strømningshastighet. Utfør luminale stimuleringer ved en innledende stimuleringsboas injeksjon levert med en 2,5 milliliter per minutt strømningshastighet i løpet av de første fem minuttene av stimuleringen, etterfulgt av administrering av testløsningen ved 5 milliliter per minutt strømningshastighet.Så snart en luminal stimuleringsperiode er over, skyll lumen med isotonisk saltvann med en 2,5 milliliter per minutt strømningshastighet i fem minutter. Deretter samler du inn baselineprøver ved 5 milliliter per minutt i 15 til 30 minutter før neste teststoff administreres. På slutten av eksperimentet, administrer en passende, positiv kontroll for å teste for responsen til preparatet i fem til 10 minutter, samle og ytterligere 10 til 15 minutter med baseline prøver på slutten av den positive kontrollstimuleringsperioden.Her vises et eksempel på data av god kvalitet, som viser Glukagon-lignende peptid-1 eller GLP-1, sekresjon fra en isolert perfundert rotte tynntarm samlet med ett minutt intervaller. Under basale forhold var sekresjonen jevn, mens både før og etter administrering av teststimulansen og den positive kontrollen var en robust sekretorisk respons tydelig. Disse GLP-1 sekresjonsdataene hentet fra en isolert perfundert rottetyktarm er av dårlig kvalitet med en ustø sekresjon målt ved basale forhold som drev oppover gjennom testingen på en måte som syntes å være relatert til teststoffet administrasjoner eller til positiv kontroll.Det er derfor umulig å konkludere med om den økte GLP-1 sekresjonen observert på slutten av vaskulær fruktosestimulering var en fruktosemediert respons. Mens du prøver denne prosedyren for å sikre katetrene riktig og å rengjøre perfusjonsutstyret grundig, da perfusjonsbufferen gir et utmerket medium for bakteriell vekst. Etter denne prosedyren kan andre metoder som In Vitro-studier på hormonsekresjonscellelinjer av primære tarmcellekulturer, utføres for å undersøke den intracellulære produksjonen av syklisk AMP eller intracellulært kalsium.Så vi har allerede brukt metoden nå for belysning av en rekke prosesser bak absorpsjon av næringsstoffer og mekanismen for sekresjon av hormonene, og det har vist seg å være svært nyttig. Ikke glem at arbeid med blokkere eller aktivatorer av molekylære steder kan være ekstremt farlig og forholdsregler som å bruke en lab frakk, hansker og vernebriller, bør en røykhette alltid tas mens du utfører denne prosedyren.

Research

JoVE Journal

Medicine

Isolating and Using Sections of Bovine Mesenteric Artery and Vein as a Bioassay to Test for Vasoactivity in the Small Intestine

Isolere og bruke Deler av Bovine mesenteriske arterie og vene som en biologisk metode for å teste for vasoactivity i tynntarmen

Mammalian gastrointestinal systems are constantly exposed to compounds (desirable and undesirable) that can have an effect on blood flow to and from that ...

Glutamate and Hypoxia as a Stress Model for the Isolated Perfused Vertebrate Retina

Glutamat og Hypoksi som en Stress Modell for den isolerte perfuserte Vertebrate Retina

Neuroprotection has been a strong field of investigation in ophthalmological research in the past decades and affects diseases such as glaucoma, retinal ...

Method of Isolated Ex Vivo Lung Perfusion in a Rat Model: Lessons Learned from Developing a Rat EVLP Program

Method of Isolated Ex Vivo Lung Perfusion in a Rat Model: Lessons Learned from Developing a Rat EVLP Program

Måte Isolert<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Lung Perfusjons i en Rat Modell: Erfaringer fra å utvikle en Rat EVLP Program

The number of acceptable donor lungs available for lung transplantation is severely limited due to poor quality. Ex-Vivo Lung Perfusion (EVLP) has allowed ...

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

En<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modell for å studere Hormone Handling i Human Breast

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

Induction and Assessment of Ischemia-reperfusion Injury in Langendorff-perfused Rat Hearts

Induksjon og vurdering av iskemi-reperfusjon Injury in Langendorff-perfuserte rottehjerter

The biochemical events surrounding ischemia reperfusion injury in the acute setting are of great importance to furthering novel treatment options for ...

The Inverted Heart Model for Interstitial Transudate Collection from the Isolated Rat Heart

Den inverterte hjertemodellen for interstitial transudatsamling fra det isolerte rottehjertet

The present protocol describes a unique approach that enables the collection of cardiac transudate (CT) from the isolated, saline-perfused rat heart. ...

Evaluation of Vascular Control Mechanisms Utilizing Video Microscopy of Isolated Resistance Arteries of Rats

Evaluering av vaskulær kontrollmekanismer utnytte Video mikroskopi av isolerte motstand arterier rotter

This protocol describes the use of in vitro television microscopy to evaluate vascular function in isolated cerebral resistance arteries (and other ...

An Efficient Sieving Method to Isolate Intact Glomeruli from Adult Rat Kidney

Effektiv Sieving metode å isolere intakt Glomeruli fra voksen rotte nyre

Preservation of glomerular structure and function is pivotal in the prevention of glomerulonephritis, a category of kidney disease characterized by ...

Robot-assisted Total Mesorectal Excision and Lateral Pelvic Lymph Node Dissection for Locally Advanced Middle-low Rectal Cancer

Robotassistert total mesorektal eksisjon og lateral bekkenlymfnute disseksjon for lokalt avansert mellom-lav rektalkreft

Since their approval for clinical use, da Vinci surgical robots have shown great advantages in gastrointestinal surgical operations, especially in complex ...

A Model of Long-Term Ventricular Fibrillation in Isolated Rat Hearts

En modell for langvarig ventrikkelflimmer i isolerte rottehjerter

Ventricular fibrillation (VF) is a fatal arrhythmia with a high incidence in cardiac patients, but VF arrest under perfusion is a neglected method of ...