Name: mechanisms underlying gut hormone secretion using the isolated perfused rat small intestine
Uploaded: 2019-02-26T13:30:00
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Este trabajo fue financiado por una subvención sin restricciones de Prof. Jens Juul Holst Novo Nordisk del centro de la investigación metabólica básica (Novo Nordisk Foundation, Dinamarca), una subvención independiente de la Fundación de Novo Nordisk para hacer estudios de roedores de la perfusión (no de la concesión. NNF15OC0016574), una subvención a Prof. Holst desde el Consejo Europeo de investigación (Grant no.695069) y la Unión de la europea del séptimo programa marco de investigación, TechnologicalDevelopment y demostración (Grant no. 266408) así como postdoc conceder a Rune E. Kuhre de la Fundación Lundbeck (R264-2017-3492). Agradecemos a Jenna E. Hunt y Carolyn F. Deacon para la revisión cuidadosa.

Todos los estudios se llevaron a cabo con la autorización de la inspección de experimentos animales danés (2013-15-2934-00833) y el Comité de ética local, siguiendo las directrices de la legislación danesa sobre experimentación animal (1987) y el nacional Institutos de salud (número de publicación 85-23).
1. animales
<ol><li>Obtener las ratas macho Wistar (250 g) y casa 2 por jaula, con acceso ad libitum a chow estándar y agua y mantener en un 12:12 h ciclo de luz-oscuridad. Nuest...

<ol>
	<li>Rindi, G., Leiter, A. B., Kopin, A. S., Bordi, C., Solcia, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+&amp;#34;normal&amp;#34;+endocrine+cell+of+the+gut:+changing+concepts+and+new+evidences.">The &amp;#34;normal&amp;#34; endocrine cell of the gut: changing concepts and new evidences.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1014, 1-12 (2004).</li><li>Brighton, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bile+Acids+Trigger+GLP-1+Release+Predominantly+by+Accessing+Basolaterally+Located+G+Protein-Coupled+Bile+Acid+Receptors.">Bile Acids Trigger GLP-1 Release Predominantly by Accessing Basolaterally Located G Protein-Coupled Bile Acid Receptors.</a> Endocrinology. 156, 3961-3970 (2015).</li><li>Kuhre, R. 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Studies using isolated perfused intestines.</a> Peptides. 77, 47-53 (2016).</li><li>Ratner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Peripheral+Neurotensin+on+Appetite+Regulation+and+Its+Role+in+Gastric+Bypass+Surgery.">Effects of Peripheral Neurotensin on Appetite Regulation and Its Role in Gastric Bypass Surgery.</a> Endocrinology. 157, 3482-3492 (2016).</li><li>Wewer Albrechtsen, N. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+stimulates+neurotensin+secretion+from+the+rat+small+intestine+by+mechanisms+involving+SGLT1+and+GLUT2,+leading+to+cell+depolarization+and+calcium+influx.">Glucose stimulates neurotensin secretion from the rat small intestine by mechanisms involving SGLT1 and GLUT2, leading to cell depolarization and calcium influx.</a> American Journal of Physiology Endocrinology and Metabolism. 308, E1123-E1130 (2015).</li><li>Kuhre, R. E., Christiansen, C. B., Saltiel, M. Y., Wewer Albrechtsen, N. J., Holst, J. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+insights+into+the+detection+of+free+fatty+and+bile+acids+by+ileal+glucagon-like+peptide-1+secreting+cells.">Mechanistic insights into the detection of free fatty and bile acids by ileal glucagon-like peptide-1 secreting cells.</a> Molecular Metabolism. 7, 90-101 (2018).</li><li>Sun, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+Controlling+Glucose-Induced+Glp-1+Secretion+in+Human+Small+Intestine.">Mechanisms Controlling Glucose-Induced Glp-1 Secretion in Human Small Intestine.</a> Diabetes. , (2017).</li><li>Kuhre, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+production+and+secretion+in+GLUTag,+NCI-H716+and+STC-1+cells:+a+comparison+to+native+L-cells.">Peptide production and secretion in GLUTag, NCI-H716 and STC-1 cells: a comparison to native L-cells.</a> Journal of Molecular Endocrinology. 56, 11 (2016).</li><li>Reimann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+sensing+in+L+cells:+a+primary+cell+study.">Glucose sensing in L cells: a primary cell study.</a> Cell Metabolism. 8, 532-539 (2008).</li><li>Reimann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+functional+role+of+voltage+gated+cation+conductances+in+the+glucagon-like+peptide-1+secreting+GLUTag+cell+line.">Characterization and functional role of voltage gated cation conductances in the glucagon-like peptide-1 secreting GLUTag cell line.</a> The Journal of Physiology. 563, 161-175 (2005).</li><li>Kuhre, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fructose+stimulates+GLP-1+but+not+GIP+secretion+in+mice,+rats+and+humans.">Fructose stimulates GLP-1 but not GIP secretion in mice, rats and humans.</a> American journal of physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 306, G622-G630 (2014).</li><li>Reimann, F., Tolhurst, G., Gribble, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G-Protein-Coupled+Receptors+in+Intestinal+Chemosensation.">G-Protein-Coupled Receptors in Intestinal Chemosensation.</a> Cell Metabolism. 15, 421-431 (2012).</li><li>Parker, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+underlying+bile+acid-stimulated+glucagon-like+peptide-1+secretion.">Molecular mechanisms underlying bile acid-stimulated glucagon-like peptide-1 secretion.</a> British Journal of Pharmacology. 165, 414-423 (2012).</li><li>Petersen, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+L+cells+in+mouse+and+human+small+intestine+organoids.">Generation of L cells in mouse and human small intestine organoids.</a> Diabetes. 63, 410-420 (2014).</li><li>Parker, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predominant+role+of+active+versus+facilitative+glucose+transport+for+glucagon-like+peptide-1+secretion.">Predominant role of active versus facilitative glucose transport for glucagon-like peptide-1 secretion.</a> Diabetologia. 55, 2445-2455 (2012).</li><li>Roberts, G. 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El intestino aislado de rata perfundidos es una herramienta potente que permite la dinámica y mecanismos moleculares subyacentes la secreción de la hormona del intestino que se estudiarán en detalle. El paso más crítico para el éxito de la producción de datos con este modelo es la intervención quirúrgica. Manejo del intestino inevitablemente causará algún daño en el intestino y debe por tanto mantenerse en un absoluto mínimo. Más importante aún, la velocidad de operación es clave, especialmente en el mome...

El intestino es el órgano endocrino más grande del cuerpo, produciendo más de 15 diferentes las hormonas peptídicas que regulan la absorción de nutrientes y eliminación de nutrientes, crecimiento intestinal y modulan apetito1. Las hormonas del intestino, por lo tanto, participan en muchos procesos fisiológicos fundamentales, y entender estos patrones de secreción y los detalles moleculares que controlan la secreción de las hormonas respectivas así es importante para nuestra básica fisiológica comprensión y para abordar aspectos traslacionales de la acciones de la hormona del intestino; pero, ¿cómo puede uno estudiar los mecanismos de detección moleculares subyacentes la secreción de la hormona intestinal? En general, la secreción de la hormona puede estudiarse en organismos intactos (los seres humanos o animales de experimentación), preparaciones de intestino aislado o de culturas de célula primaria secretor de hormona del intestino o inmortalizado células culturas2,3, 4 , 5 , 6. nuestro modelo preferido es el intestino aislado de rata perfundidos, que es un modelo fisiológico relevante que permite la secreción de hormonas del intestino que se estudiarán en detalle con una resolución de tiempo óptimo (secreción de tasas se pueden determinar con cualquier tiempo en la base hasta el segundo), y los resultados son probablemente transferibles a una situación en vivo7. Aquí proporcionamos un protocolo detallado sobre cómo realizar este procedimiento, pero primero vamos a comentar otros métodos para estudiar la secreción de la hormona intestinal, incluyendo los beneficios y limitaciones de estos modelos en comparación con el intestino aislado de rata perfundidos.
Si se desea establecer si un compuesto específico regula la secreción de ciertas hormonas del intestino, estudios en seres humanos son el objetivo final. Así, si un compuesto muestra grandes efectos sobre la secreción de una o varias hormonas del intestino en roedores (en vivo o perfusiones) o de hormonas secretoras células (líneas celulares o células primarias), este efecto sólo es relevante a la medicina y la fisiología humana puede confirmarse en los seres humanos. Sin embargo, hay límites claros para el tipo de estudios que pueden realizarse en seres humanos, y estudios in vivo en animales experimentales suelen ser, por lo tanto, la segunda mejor opción para este tipo de estudios. Ratones y ratas son los animales experimentales más utilizados presumiblemente debido a su tamaño conveniente, bajo costo y la opción de modificar genéticamente los genes sospechados de participar en las preguntas de estudio específico (por ejemplo, golpear de un transportador de algunos o receptor). En general, modelos en vivo se benefician de ser fisiológicamente intacta, pero también tienen varias limitaciones. Lo más importante, el tamaño pequeño de los roedores, especialmente ratones, es un factor limitante, como la mayoría los análisis para la cuantificación de la hormona intestinal requieren por lo menos 20 μl de plasma (y a menudo mucho más), lo que significa que al menos 100 μl de sangre debe ser retirado para hacer un duplicado cuantificación. Por lo tanto, sólo es posible obtener muy pocas muestras correspondientes a las muestras de línea de base y uno o dos post estimulación (el volumen total de sangre en un ratón de 20 g es de ~1.4 mL). En consecuencia, posibles respuestas secretoras (e.g., rápidamente o tardía de las respuestas) por lo tanto puede ser faltada.
En el modelo de perfusión, es superar este problema, como muestra grandes volúmenes se obtienen (caudal: 7,5 mL/min) y los intervalos de colección pueden ajustarse según sea necesario para asegurar que no falten las respuestas rápidas y corta duración (recoge muestras cada minuto)7 . Otro tema con en vivo los estudios en roedores es que la mayoría de las hormonas intestinales es aún más rápidamente eliminado o metabolizada que en los seres humanos8,9,10, que puede complicar el posterior análisis bioquímico. Por ejemplo, hemos demostrado que el GLP-1 se metaboliza en ratones a un ritmo incluso más rápido que en los seres humanos (donde T1/2 es 1-2 min11) y, más importante, que consiste en la separación de GLP-1 en ratones, además de escote N-terminal por dipeptidil-peptidasa-4 (DPP4) (que es la principal enzima degradante de la GLP-1 en los seres humanos), más escote por la enzima endopeptidasa neutral 24.1112. En consecuencia, actuales ensayos comerciales para la cuantificación de GLP-1, que se basan ya sea en la isoforma intacta de la GLP-1 (7-36amide) o el isoform de la DPP-4 troceados (9-39amide), enormemente subestiman la secreción de GLP-1 en ratones y resultan engañosa resultados 12. en el intestino aislado de rata perfundidos, la mayor parte del metabolismo de las hormonas secretadas es eliminado o reducido marcado, ya que se evita la degradación mediada por el plasma, y se previene la extracción o degradación del hígado, riñón, pulmón porque ( solución es de recogida ya que deja el intestino).
Por supuesto, penetración importante puede ser generada por el uso de animales genéticamente modificados, por ejemplo,, sodio glucosa transportador-1 nocaut ratones13, pero requiere de una evaluación detallada de los sensores moleculares implicados en la secreción de a menudo consideración de múltiples sitios moleculares, que van desde transportadores moleculares en canales del ion y de diversos receptores g-proteína-juntados a las proteínas intracelulares. Por ejemplo, hemos dirigido la actividad de los nueve diferentes sitios moleculares cuando desentrañar los sensores moleculares responsables de la secreción de GLP-1 estimula la glucosa7. Una investigación similar no sería posible en vivo como algunos de los compuestos usados tienen inespecíficas o efectos nocivos/letales. Por ejemplo, cuando se utiliza la perfusión intestinal, fue posible evaluar la función del metabolismo intracelular de la glucosa para la secreción de GLP-1 y neurotensin bloqueando la formación de ATP con 2-4-dinitrofenol7,14 , así como el papel de los canales de calcio voltaje-bloqueado de ácidos biliares estimulan la secreción de GLP-1, NT y PYY3. De hecho, el tetrodotoxin de bloqueador de canal de sodio altamente tóxico puede ser aplicado con éxito en los estudios de perfusión. Por último, en el modelo de perfusión se puede ser directamente evaluada donde en el intestino un cierto compuesto estimula la secreción de ciertas hormonas, como el investigador puede simplemente elegir y preparar la región deseada para perfusión, y al mismo tiempo puede ser investigado Si un estímulo provoca secreción mediante la activación de sensores moleculares del lado luminal o vascular del intestino3,15,16.
Los mecanismos secretores de hormona intestinal subyacente también puede ser estudiado por el uso de piezas de tejido del intestino (incluyendo tejidos humanos), hormona de cultivos intestinales primarios (generalmente de ratones), inmortalizadas secretoras de líneas celulares (de ratón o de origen humano), por tripa tejido montada en usar cámaras u organoides (tanto más a menudo de ratones)2,3,4,5,6,17,18. En comparación con perfusiones intestinales, estudios en cultivos celulares primarios, líneas celulares y pedazos de intestino humano son técnicamente fáciles de realizar y son una forma más rápida y más barata de generación de datos, pero por supuesto el estudio de pedazos de intestino requiere acceso al intestino humano fresco muestras. Sin embargo, en estos modelos la polarización normal de las células de la tripa es inherentemente perdida, lo que significa que estos modelos no se puede utilizar para evaluar la activación normal de los sensores moleculares, y también no pueden estudiarse los procesos de la absorción. Por otra parte, estos estudios generalmente emplean incubaciones estática (de hasta varios h) que es altamente no-fisiológico y nada tiene que ver con dinámicas de secreción normal de las células, ya que no se quita el producto secretado y así puede influir en la regeneración la secreción de hormonas. En cambio, en el perfusión del intestino, secretadas y absorbentes moléculas son eficientemente eliminadas mediante la microcirculación mucosa como son en vivo, asegurando que los gradientes de la vía transmucosa se mantienen para que la absorción y la secreción pueden ocurrir a un ritmo normal. Además, pueden haber dedifferentiated cultivos celulares desde su origen células enteroendocrinas nativo, lo que significa que ya no son representante de las células nativas en cuanto a contenido del péptido y la expresión de sensores moleculares, aunque pueden todavía secretan la hormona en cuestión. Esto es, por ejemplo, el caso de GLP-1 células secretoras líneas19.
Por lo tanto, es nuestra opinión que las culturas de célula primaria o célula línea de estudios son más adecuados para fines de investigación y para realizar experimentos de tipos que no pueden ser realizados en vivo o en el intestino aislado perfundido. Por ejemplo, una verdadera fuerza de las culturas de célula primaria y cultivos de la línea de celulares es eso secundario intracelular mensajeros (por ejemplo Ca2 +, campamento, NAD(P)H) puede ser monitoreado en tiempo real, y eléctrico de señalización de la hormona que secreta las células puede ser investiga20,21,22. Además, caída de siRNA puede hacer, que es especialmente útil si inhibidores específicos no están disponibles20,21,22,23,24. Tejido intestinal de los ratones montados en cámaras de usar recientemente se ha utilizado para estudiar los mecanismos moleculares subyacentes estimulada secreción de GLP-1 ácido de bilis, mientras organitas intestinal (de ratones) y pedazos de intestino humano también han sido utilizados para el estudio de la detalles moleculares de tripa hormona secreción17,25. Mientras que los anteriores beneficios de ser polarizaron2 todos estos modelos implican incubaciones estática. Estudios en piezas del intestino humano, sin embargo, beneficiarán del uso de tejido humano, en lugar de roedores, lo que es importante puesto que la diferencia de especies en la expresión de tejido de receptores 7TM y transportadores moleculares podrán resultar en diferentes vías moleculares de detección entre especies. De hecho, más datos en este campo ha sido generados por estudios en cerdos, ratones o ratas, y sigue siendo difícil de alcanzar si estos resultados pueden ser transferidos a los seres humanos. Sin embargo, es reconfortante que los mecanismos de detección moleculares que subyacen la glucosa estimula la secreción de GLP-1 parecen ser similar entre ratón, rata, hombre, y transcriptómicos y perfiles de peptidomic de ratón y células humanas de L revelaron fuerte global semejanzas entre las dos especies7,18,26,27.
El intestino aislado de rata perfundidos, sin embargo, también tiene algunas limitaciones que deben ser considerados. Lo más importante, es imposible determinar si una determinada respuesta secretora resulta de activación directa por la sustancia de las células productoras de hormonas específicas o, más bien es causada por un mecanismo indirecto. Por ejemplo, KCl al instante aumenta la secreción de GLP-1 de la perfusión del intestino7, pero se desconoce si esto es consecuencia de la despolarización directa de la célula de L o resulta de la despolarización de las neuronas cerca de las células de L o los efectos de simultáneamente lanzó estimuladores/inhibidores de paracrina. Datos derivados de estudios con el perfusión del intestino que pretenden dilucidar los mecanismos moleculares subyacentes a la secreción, por lo tanto, siempre se pongan en contexto con datos obtenidos de otros modelos más específicos para aumentar la capacidad de establecer causalidad. Por ejemplo, estimulada por la glucosa la secreción de GLP-1 de la línea celular secreción de GLP-1 GLUTag28,29 y de primario de ratón células de L depende de la actividad de los transportadores de glucosa (SGLT1 y GLUT2). Bloqueo de estos transportadores en el intestino de rata perfundidos también atenúa la secreción20, lo que significa que es probable que glucosa estimula la secreción de GLP-1 es mediada en gran parte por acciones directas de la glucosa en la célula de L. Otra limitación importante del intestino aislado perfundido es que algunos de los lípidos son difíciles de estudiar debido a su hidrofobicidad. Aunque es posible investigar los productos finales de la digestión de lípidos (ácidos grasos, diacil gliceroles, lysophosphatidylglycerols, etc.) y a pesar de la preparación puede ser capaces de volver a esterificar los lípidos intra cellularly y tal vez el paquete en quilomicrones, el transporte de los quilomicrones en las células y su posterior absorción por el quilífero de las vellosidades se interrumpe, ya que el flujo de linfa en el intestino aislado no puede fijarse. Por lo tanto, muy probablemente, absorción de los lípidos se detiene una vez que los productos absorbidos comienzan a acumularse en las células. Los sistemas celulares in vitro son aún menos adecuados para estudios de lípidos debido a su carencia de la polarización. Obviamente, esta limitación sólo es relevante para los lípidos que son absorbidos y transportados vía el quilífero, que los absorben a través de los vasos sanguíneos intestinales suelen ser manejado normalmente.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals for perfusion buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.12018.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate (CaCl2 x 2 H2O)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>102382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran 70</td>
			<td>Pharmacosmos</td>
			<td>40014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fumaric acid disodium salt (C4H2Na2O4)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F9642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose (C6H12O6)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate hepatahydrate (MgSO4)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>105886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potasium chloride (KCl)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>104936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>104873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvic acid sodium salt (C3H3NaO4)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106619</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Merck</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium L-glutamate monohydrate (C5H8NNaO4 x H2O)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion equitment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universial perfusion system</td>
			<td>Harvard Bioscience, Inc.</td>
			<td>732316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BASIC UNIT UNIPER UP-100, TYPE 834</td>
			<td>Harvard Bioscience, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roller Pump, with four channels</td>
			<td>Harvard Bioscience, Inc.</td>
			<td>730100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Windkessel</td>
			<td>Harvard Bioscience, Inc.</td>
			<td>732068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostatic Circulator,Bath Volume 3L, 230V/50Hz</td>
			<td>Harvard Bioscience, Inc.</td>
			<td>730125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating table, heated on tripod stand, type 873</td>
			<td>Harvard Bioscience, Inc.</td>
			<td>733776</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cannula with basked, OD= 2.0mm, ID= 1.0mm</td>
			<td>Harvard Bioscience, Inc.</td>
			<td>733313</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mechanisms underlying gut hormone secretion using the isolated perfused rat small intestine

El intestino es el órgano endocrino más grande del cuerpo, produciendo más de 15 diferentes las hormonas peptídicas que regulan el apetito e ingesta de alimentos, digestión, absorción de nutrientes y distribución y excursiones de glucosa post-prandial. Comprensión de los mecanismos moleculares que regulan la secreción de la hormona intestinal es fundamental para entender y traducir la fisiología de la hormona intestinal. Tradicionalmente, los mecanismos subyacentes a la secreción de hormona intestinal tampoco se estudiaron in vivo (en animales o seres humanos) utilizando o mucosa primaria secretor de hormona de tripa cultivos celulares de células. Aquí, presentamos un intestino aislado de rata perfundidos como un método alternativo para el estudio de secreción de la hormona intestinal. Las virtudes de este modelo son que se basa en el intestino intacto, lo que significa que recoge la mayoría de los parámetros fisiológicamente importantes responsables de la secreción en estudios in vivo, incluyendo mucosa polarización, paracrina relaciones y vías de exposición de perfusión/estímulo. Además y a diferencia de los estudios in vivo, el intestino aislado de rata perfundidos permite casi completo control experimental y evaluación directa de la secreción. En contraste con estudios in vitro, es posible estudiar la magnitud y la dinámica de la secreción y para responder preguntas importantes, como qué estímulos provocan secreción de hormonas intestinales diferentes, de qué lado de la tripa (luminal o vascular) es la secreción de estimulado y analizar en sensores moleculares detalle subyacente de la respuesta secretora. Además, la preparación es un poderoso modelo para el estudio de la absorción intestinal y detalles con respecto a la dinámica de la absorción intestinal, incluyendo los transportadores de la responsables.

La capacidad para determinar si un determinado estímulo provoca la secreción de la hormona intestinal de interés se basa en una secreción basal constante. Además, si no hay respuesta al estímulo se observa una respuesta secretora robusta para el control positivo debe ser evidente para excluir que la falta de respuesta al estímulo de prueba no refleja una falta general de capacidad de respuesta. Figura 2A y 2B se muestra un ejemplo de d...

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Mechanisms Underlying Gut Hormone Secretion Using the Isolated Perfused Rat Small Intestine

Mecanismos subyacentes de la secreción de la hormona del intestino utilizando los aislados perfusión intestino de rata

Aquí, presentamos un modelo potente y fisiológico para estudiar los mecanismos moleculares subyacentes la secreción de la hormona intestinal y la absorción intestinal: el intestino aislado de rata perfundidos.

The gut is the largest endocrine organ of the body, producing more than 15 different peptide hormones that regulate appetite and food intake, digestion, ...

El método que hemos desarrollado aquí ha resultado ser extremadamente útil en nuestro trabajo, tratando de averiguar los mecanismos moleculares de la secreción de hormonas del intestino, pero también la absorción de nutrientes, y el acoplamiento entre los dos. La principal ventaja de esta técnica altamente fisiológica es que el intestino se deja in situ, mientras que permite estudios detallados que generalmente sólo se realizan dentro de los modelos In Vitro. Primero coloque la rata en una mesa de operaciones calentada, confirme la falta de respuesta al pellizco del dedo del final, y haga una escisión de la piel y el peritoneal para exponer la cavidad abdominal.Mueva el intestino delgado hacia un lado para exponer la región terminal del colon. Y ligar la vasculatura de suministro al colon. Extraje gradualmente el colon, comenzando de la región terminal, y moviéndose hacia el intestino delgado, hidratando el tejido con solución salina isotónica, y usando hisopos de algodón para eliminar el tejido conectivo según sea necesario.Cuando se haya eliminado todo el colon, inserte una pieza de 15 centímetros de tubo de plástico en el extremo proximal del pequeño lumen intestinal, y asegure el tubo con suturas. A continuación, utilice una jeringa de 10 mililitros y una bomba de jeringa para lavar cuidadosamente el intestino delgado con solución salina isotónica a temperatura ambiente a un caudal de 25 mililitros por minuto. Cuando el tejido haya sido vaciado de quimo, ajuste los tejidos de modo que la arteria mesentérica superior sea accesible y retire el tejido conectivo y el tejido graso para exponer la arteria.Use fórceps de punto fino para colocar dos suturas debajo de la arteria mesentérica y dos suturas debajo de la vena porta. Llene un catéter de plástico de calibre 22 unido a una bomba rodante con tampón de perfusión y utilice un par de tijeras quirúrgicas para cortar un pequeño agujero en la arteria mesentérica, insertando inmediatamente el catéter en la incisión. Inserte el catéter dentro de los dos minutos de cortar un agujero en la arteria, de lo contrario el intestino probablemente sufrirá de daño isquémico.Tan pronto como el catéter se haya asegurado con una sutura, inicie la bomba de rodadura para iniciar la perfusión a un caudal de 7,5 mililitros por minuto. Cuando los vasos sanguíneos en el intestino y la vena porta se vuelvan pálidos, corta un agujero en la vena porta. Inserte un catéter metálico y asegure el catéter metálico con otra sutura.Tenga cuidado al insertar el catéter en la vena porta, ya que la vena está de paredes delgadas. Sin embargo, como la guardia se está perfundiendo, la inserción rápida no es crucial. Después de recoger la salida de perfusión durante un minuto, mida el volumen y haga clic en ejecutar experimento en el programa de grabación de presión para iniciar las grabaciones de adquisición de presión de perfusión.Luego cubra el intestino con un tejido de laboratorio humedecido para evitar que se seque, y confirme que el extremo distal del intestino no está bloqueado, y puede salir un haploid luminoso. Para medir la presión parcial de oxígeno y dióxido de carbono, recoja el tampón de perfusión a través de una válvula de tope de tres vías inmediatamente antes de que entre en el órgano, después de aproximadamente tres minutos de perfusión, y desde el catéter insertado en la vena porta. Coloque las muestras sobre hielo y utilice un analizador automatizado de gases sanguíneos para medir las muestras poco después de la recolección.Utilice un recopilador de fracciones para obtener las primeras muestras de línea base. Después de 10 a 15 minutos de la recolección basal, utilice una bomba de jeringa para administrar el primer estimulante de prueba intraarterial a través de un tope de tres vías a un caudal de 35 mililitros por minuto. Realizar estimulaciones luminales mediante una inyección inicial de boas de estimulación suministrada a un caudal de 2,5 mililitros por minuto durante los primeros cinco minutos de la estimulación, seguida de la administración de la solución de prueba a un caudal de 5 mililitros por minuto.Tan pronto como termine un período de estimulación luminal, enjuague el lumen con solución salina isotónica a un caudal de 2,5 mililitros por minuto durante cinco minutos. A continuación, recoja muestras de línea base a 5 mililitros por minuto durante 15 a 30 minutos antes de administrar la siguiente sustancia de ensayo. Al final del experimento, administre un control positivo adecuado para comprobar la capacidad de respuesta de la preparación durante cinco a 10 minutos, recogiendo y adicionalmente de 10 a 15 minutos de muestras de línea base al final del período de estimulación de control positivo.Aquí se muestra un ejemplo de datos de buena calidad, demostrando péptido-1 o GLP-1 similar a glucagón, secreción de un intestino delgado de rata perfundido aislado recogido en intervalos de un minuto. En condiciones basales, la secreción fue constante mientras que antes y después de la administración del estímulo de la prueba y el control positivo, una respuesta secretora robusta era evidente. Estos datos de secreción de GLP-1 obtenidos de un intestino delgado de rata perfundido aislado son de mala calidad con una secreción inestable medida en condiciones basales que se desvió hacia arriba a lo largo de las pruebas de una manera que parecía no estar relacionada con las administraciones de sustancias de ensayo o con el control positivo.Por lo tanto, es imposible concluir si el aumento de la secreción de GLP-1 observada al final de la estimulación de la fructosa vascular fue una respuesta mediada por fructosa. Al intentar este procedimiento para cuidar los catéteres correctamente y para limpiar a fondo el equipo de perfusión como el tampón de perfusión proporciona un excelente medio para el crecimiento bacteriano. Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como estudios in vitro sobre líneas celulares secretoras de hormonas de cultivos celulares intestinales primarios, para investigar directamente la producción intracelular de AMP cíclico o calcio intracelular.Así que ya hemos utilizado el método ahora para la elucidación de una serie de procesos detrás de la absorción de nutrientes y el mecanismo de secreción de las hormonas y ha resultado ser extremadamente útil. No olvide que trabajar con bloqueadores o activadores de sitios moleculares puede ser extremadamente peligroso y precauciones como el uso de una bata de laboratorio, guantes y gafas de seguridad, siempre se debe tomar una campana de humo mientras se realiza este procedimiento.

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