Name: measuring interactions of globular and filamentous proteins by nuclear magnetic resonance spectroscopy (nmr) and microscale thermophoresis (mst)
Uploaded: 2018-11-02T14:45:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy NMR and Microscale Thermophoresis MST at JoVE.com

Dieses Projekt wurde von NSERC RGPIN-2018-04994, Campus Alberta Innovationsprogramm (RCP-12-002 C) und Alberta Prion Research Institute unterstützt / Alberta innoviert Bio Solutions (201600018), verliehen an M.O und Genom-Kanada und Canada Foundation for Innovation-Finanzhilfen der Metabolomik Innovation Centre (TMIC) und NANUC.

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Die Autoren Interessenkonflikte keine.

2D 15N gelöst NMR-Experiment ist eines der am häufigsten verwendeten Methoden, um zu zeigen, wie zwei Molekülen interagieren. Es ist die am meisten informationsreichen-Methode, die beide Partner Signale, während eine Titration Experiment in Lösung Zustand kontinuierlich überwacht werden kann. Obwohl in der Regel bei großen komplexen qualitative, die Methode auch in günstigen Fällen einsetzbar, um verbindliche Affinitäten zu messen wo NMR-Signale in hochauflösende Spektren nachverfolgt werden können. Wo Aufgaben bequem erfolgen können wie bei vielen Proteinen unter 20 kDa groß, auch die Bindungsstellen zugeordnet werden können. Ergänzende Tests wie MST quantitative Informationen über Interaktionen in Lösung und erfordern weniger Protein in unbeschrifteten Staaten. Vergleich der mutierten binden von Daten ist nützlich für die Kontrollen, um sicherzustellen, dass Interaktionen durch NMR-Linie Erweiterung belegt echt sind und keine Artefakte, z. B. Aggregation oder Viskosität Änderungen.
Protein-Expression
Prozessoptimierung Ausdruck reduziert die Menge der Arbeit intensiv Proteinproduktion. Dieser Optimierungsprozess gehört die Identifizierung der eine entsprechende Belastung von E. Coli für die rekombinante Expression des Proteins. Sorte bevorzugt hängt von Faktoren einschließlich der Art des Vektors im Einsatz, und genauer gesagt, die ultimative Stabilität des rekombinanten Proteins Seins ausgedrückt7. Das Risiko der Verschlechterung des heterologen Proteins durch endogene E. Coli Proteasen reduziert werden, durch Verwendung von Protease mangelhaft E. Coli wie der Stamm BL21. Für Gene, die seltene Codons enthält kann eine Belastung wie BL21-CodonPlus (DE3) RIPL vorzuziehen. Diese Sorte kombiniert die Protease mangelhaft Natur der BL21 Belastung mit zusätzliche endogenen Exemplare des seltenen Codons tRNAs für Arginin, Prolin, Isoleucin und Leucin. Alternativ können seltene Codons die Überexpression gefährden können vermieden werden, durch die Bestellung ein Codon-optimierte Konstrukt aus kommerziellen Quellen. Viele Stämme von E. Coli sind für rekombinante Genexpression, jeweils für die Umgehung eines bestimmten Problems während Ausdruck7optimiert. Bei dieser Studie erstellt der standard Protease mangelhaft Stamm BL21(DE3) ausreichende Mengen an löslichen Proteinen für die anschliessende Reinigung und Analyse.
Proteinreinigung
Die Reinigung Protokoll für ein gegebenes Protein ist oft einzigartig in dem Sinne, dass jedes Protein stabil und unter verschiedenen Bedingungen wie Temperatur, Salzgehalt oder pH-Wert löslich bleibt. Die allgemeine Wirksamkeit der Reinigung durch Affinitätschromatographie ist auch empfindlich auf die Konzentration von Medikamentenfreisetzende Arten wie Imidazol in verschiedenen Schritten während des Reinigungsprozesses. In dieser Arbeit wurden kritische Pufferbedingungen für IMAC pH-Wert für die E-PRD und Imidazol-Konzentration für die VimRod. Ein pH-Wert von 7,5 bedurfte, um die Ausfällung von E-PRD nach anfänglichen Elution aus der Spalte "IMAC" zu vermeiden. Für die IMAC-Reinigung von VimRod Erhöhung der Konzentration von Imidazol von 30 bis 50 mM in der Spalte Waschschritt zeigte sich eine deutliche Verbesserung in der Reinheit der endgültigen Elution Fraktionen. Für die Elution Schritt Erhöhung der Konzentration von Imidazol von 250 bis 350 mM auch erwies sich um die Ausbeute an die endgültige Elution zu verbessern. Erste Versuche, mit 250 mM Imidazol Protein eluieren führte zu unvollständigen Elution von VimRod wie durch einen abschließenden 1 M Imidazol-Streifen der Spalte (Daten nicht gezeigt) offenbart. Erhöhung der Imidazol-Konzentration bis 350 mM für die Elution reichte aus, um all das Protein gebunden in die Spalte wiederherzustellen. S kann einen doppelten Zweck dienen, weil es als ein Polierstufe für Proteinreinigung während gleichzeitig ausführen Buffer Tausch wirkt. Buffer Tausch ist ein entscheidender Schritt für die anschließende Bindung Analyse, da sie die Imidazol verwendet, um His6-markierte Protein eluieren entfernt. Es dient auch als eine Gelegenheit zu ändern Bedingungen wie Salzkonzentration oder pH, die die Wirksamkeit bestimmter nachgeschaltete Techniken oder Assays auswirken können. Protein, das thermische Verschiebung (PTS) verwendet werden, kann um optimale Puffer für nachgeschaltete Assays, vor allem für diejenigen, die stabile Protein für identifizieren längere Zeit bei Zimmertemperatur8,9.
Analyse der Bindung
Protein, das frisch zubereitet wird ist entscheidend für genaue verbindliche Assays, obwohl gefrorenen Protein kann auch verwendet werden, solange die Ergebnisse verglichen werden. Filamentöse Proteine wie Vimentin Multimerize Salz und pH-Wert abhängige Weise, und somit die Lösung bedingen müssen optimiert werden und die Oligomere Zustand durch eine Methode wie SEC10,11, dynamisches Licht Streuung geschätzt 12 oder Analytische Ultrazentrifugation13,14,15. NMR-Spektroskopie ist gut geeignet zur Messung der Ligand Interaktionen der kleinen Proteine in atomarer Auflösung. Jedoch wenn ein Protein mit größeren Molekül interagiert, langsamer Tumbling folgt, und dies zu Verlust von Signalen, die verbindlich bestätigen kann führt, obwohl dies nicht unbedingt der Fall erlauben Zuordnung Bindungsstellen, die auch die Zuweisung von mindestens erfordern würde Rückgrat Resonanzen. In diesem Szenario lassen NMR-Experimente nicht Identifikation des Standortes Interaktion. Daher directed Website Mutagenesis angewendet wird, um die kritischen Rückstände für die Bindung benötigt zu identifizieren. Solche Mutanten aufweisen Signalverlust daher nicht. In diesem Protokoll eine mutierte Form mit einer Substitution an Position 1914 behält die Peak-Intensitäten in Anwesenheit von VimRod und Störung der Interaktion von E-PRD und VimRod bestätigt. Zuordnung der Rückgrat und Sidechain Resonanzen würde dieser Ansatz Wert hinzufügen, zumal die Struktur für das kostenlose E-PRD durch Röntgen-Kristallographie4gelöst worden ist. Zukünftige Anwendungen der NMR Charakterisierung der komplexen Wechselwirkungen zwischen größeren Molekülen gehören und profitieren von extrem hohen Bereich Magnete und die Verwendung von anderen beobachtbaren Gruppen wie z. B. 13C beschriftet und trifluor Methylgruppen als Reporter.
MST hat eine Reihe von Vorteilen für das Studium bindende Wechselwirkungen16. Die Bindungspartner sind frei in Lösung und nicht immobilisiert. Analyse der Qualität der Proben ist die Software mit Qualitätskontrolle der Aggregation, die Adsorption an den Kapillaren oder unzureichende fluoreszierende Kennzeichnung des Zielmoleküls eingebaut. Kleine Mengen des Ziels dienen in der Regel, die Konzentration der das markierte Ziel ist in der Regel zwischen 20-50 nM in einer 10-20 μl Volumen/Reaktion. Dieses Protokoll verwendet sehr kleine Reaktion Volumen (10 μl), die Konzentration des Liganden zu maximieren, die in der Titrationen ermöglichen schwach bindender Wechselwirkungen gekennzeichnet werden erreicht werden kann. Dies erfordert genaues pipettieren und Sorgfalt zu vermeiden, Einführung von Luftblasen beim noch gründlich mischen. Ausreichende Vermischung ist entscheidend für präzise, konsistente Fluoreszenz-Messungen entlang der Satz von Verdünnungsreihen. Die Tween-20 in der MST-Experimenten wurde reduziert von einer Norm 0,05 bis 0,015 %, senken die Tendenz zu Bläschen zu schaffen und zu verbessern, mischen.
Der Farbstoff rot-Tris-NTA ermöglicht schnell, einfach und bequem Eindringmittel kennzeichnen jedes Protein, das eine seiner Tag. Die Kennzeichnung ist in nur 30 Minuten wirksam abgeschlossen und ist sehr eng, so dass kein Farbstoff Deinstallation erforderlich ist. An Aminosäurereste des Proteins, die die Liganden Bindungseigenschaften beeinflussen könnten, werden keine Änderungen vorgenommen. Ein Nachteil ist, dass nur das Protein zu etikettierenden einen His6 Tag haben sollte. Dies erforderte die Spaltung des Tags aus der Liganden-Protein, E-PRD und Entfernen von Tags und uncleaved E-PRD mit einem zweiten Schritt der IMAC-Spalte. Wenn möglich, die Liganden Protein sollten bereit sein, ohne den Einsatz eines seiner Tag. Alternativ können Proteine kovalent mit einem Fluorophor durch Amin Ankopplung an Lysin Rückstände oder Thiol Ankopplung an Cystein Rückstände beschriftet werden. Allerdings muss darauf geachtet werden, wenn mit solchen Systemen seit der kovalenten Befestigung ein Fluorophor elektrostatische oder polare Bindung Interaktionen unter Berufung auf Lysin oder Cystein Rückstände beeinträchtigen kann. Die Quantifizierung von verbindlichen Affinität zwischen dem VimRod und E-PRD von MST war ungewöhnlich Konzentration salzempfindlich. Dieses Problem wurde durch die dialyzing zunächst das Ziel und die Liganden in der gleichen Charge von Testpuffer gemindert. Sättigung der MST verbindliche Kurve konnte jedoch nicht erreicht werden, bei der Durchführung der MST-Assay im Beisein von 150 mM NaCl aufgrund des komplexen Verhaltens von VimRod. Zuverlässige und vollständige Daten wurden ermittelt, sobald die Konzentration von NaCl, 10 mM, so dass genaue Berechnung des K-Dgesenkt wurde. Daher sind sorgfältige Optimierung der Lösungsbedingungen und Vergleich mit ergänzenden Tests empfohlen, robuste Ergebnisse zu erzielen. Darüber hinaus kann MST verwendet werden, um das Salz Abhängigkeit für einen bestimmten Umgang zu quantifizieren, stöchiometrische Eigenschaften von Protein-Interaktionen, Monitor Proteinfaltung und Sonde in Enzym Kinetik17zu quantifizieren.

Wechselwirkungen zwischen Proteinen ermöglichen die Bildung von molekularen Maschinen, die Ordnung in den Zellen zu schaffen. Die einzelnen Interaktionen sind oft schwach sondern in der Regel zur multivalente komplexe, die kooperative und dynamisch reguliert werden können. Sensible Assays, die atomarer Auflösung und quantitative Informationen über solche komplexen Interaktionen bieten genügen, um Mechanismen ableiten und Interventionen wie Drogen wie Moleküle zu entwerfen. NMR-Spektroskopie ist eine effiziente Methode zur Erlangung dieser Informationen über Protein-Interaktionen und auch für schnelle Screening für Liganden, einschließlich derer, die schwach1binden verwendet wird. Die NMR Methoden können kategorisiert werden, in denen, die sind Protein beobachten oder Liganden zu beobachten. Dieses Manuskript verwendet das erste Verfahren, in dem ein Spektrum an ein Protein, das vergleichsweise gering (in der Regel unter 20 kDa) ist mit der Bezeichnung Stall-Isotop wird erworben und die unbeschriftete Liganden titriert. Die beschrifteten Rückstände wird dadurch die Interaktion zugeordnet werden, in günstigen Fällen beteiligt. Einmal die komplexen Formen, gibt es Änderungen in der chemischen Umgebungen von interagierenden Rückstände, die sich als Änderungen in der chemischen Verschiebung manifestieren und Form ihrer NMR-Signale. Das Ausmaß dieser Veränderungen korreliert mit dem Grad der Einbeziehung dieser Gruppen in der Interaktion. Chemische Verschiebung Störungen (CSPs) können gemessen werden, durch den Vergleich einer Reihe von NMR-Spektren des Proteins in Abwesenheit und Anwesenheit von unterschiedlichen Mengen des Liganden gesammelt. Für größere Liganden oder komplexe Interaktionen kann die Änderung der Peak-Form oder Intensität gemessen werden Interaktionen ableiten.
Das am weitesten verbreitete 2D Experiment zur Erfassung Ligand Interaktionen ist die 15N-Heteronuclear einzelnen Quanten Korrelation (HSQC) Experiment2. Dies erfordert, dass ein Protein gleichmäßig mit 15N, bezeichnet werden, die in der Regel erzielt wird, indem zum Ausdruck zu bringen als Affinität-Tags Versionen in E. Coli Bakterienkulturen in 15N angereicherte Medien gewachsen. Bindung ist offensichtlich, wenn die HSQC-Spektren, gesammelt während der Titration überlagert werden, enthüllt Peak Änderungen für einen Teil der Rückstände in der Komplexbildung einbezogen. Die Interaktion kann im schnellen Austausch Regime auftreten, wo die freie und Liganden gesättigt Zustandssignalen in einer Bevölkerung im Durchschnitt Spitze zusammenbrechen. Alternativ sind bei langsamen Austausch zwischen den Staaten, beide Signale mit integrale beobachtet, die ihre relativen Mengen darstellen. Während NMR linienförmiges Analyse verwendet werden kann, um die verbindliche Affinitäten in einigen Fällen zu schätzen Methoden wie MST haben auch praktisch bewährt und bieten Kreuzvalidierung echte Interaktionen.
Das Beispiel ist von zwei Proteinen innerhalb Desmosomes gefunden. Sie vermitteln Kreuzungen zwischen Zelloberflächen und dem Zytoskelett und vermitteln multivalente Interaktionen zwischen Zelle Adhäsion Maschinen und fortgeschrittene Filamente, die Integrität der Haut und Herz Gewebe und widerstehen der Scherkräfte. Krankheiten können entstehen, wenn Desmosomal Proteine wie z. B. Desmoplakin oder Vimentin durch Mutationen oder Autoantikörper gefährdet sind, führt zu der Zell-Zell-Verbindungen, Destabilisierung und deren Wechselwirkungen daher von entscheidender Bedeutung3 sind. Die strukturelle Basis der Ligand-Bindung durch Desmosomal Proteine kann durch NMR-Spektroskopie charakterisiert werden, während die Wechselwirkungen von MST quantifiziert werden können. Hierin wurden Methoden charakterisieren die Wechselwirkungen zwischen Plakin repeat Domänen (PRDs) die oft als Tandem-Sets vorhanden sind, die grundlegenden Rillen anbieten und Vimentin, eine intermediate Filament, das durch eine saure Oberfläche angeboten durch die spiralförmige interagiert Bundle4. Diese komplexe bilden sich an der Zellmembran wo sie Anker für fortgeschrittene Filamente der Zelle Cytoskelett, Desmosomes, die eine Verbindung zu benachbarten Zellen bilden so ein Netzwerk von Klebeverbindungen, die durch ein Gewebe ausstrahlt.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Monolith NT.115, includes control and analysis software</td>
			<td>NanoTemper Technologies</td>
			<td>MO-G008</td>
			<td>Instrument for microscal thermophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His-Tag Labeling Kit RED-Tris-NTA</td>
			<td>NanoTemper Technologies</td>
			<td>MO-L008</td>
			<td>RED-tris-NTA dye for MST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard capillaries</td>
			<td>NanoTemper Technologies</td>
			<td>MO-K022</td>
			<td>capillaries for MST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HisTrap HP, 5 mL</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17524801</td>
			<td>IMAC column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HisPur Ni-NTA resin, 100 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88222</td>
			<td>IMAC resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiLoad 16/600 Superdex 75 pg</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28989333</td>
			<td>SEC column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEV protease</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T4455</td>
			<td>cleavage of his tag from E-PRD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21(DE3) Competent E. coli</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>C2527H</td>
			<td>cells for protein expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete Protease Inhibitor Cocktail Tablets EDTA-Free</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>11873580001</td>
			<td>protease inhibitors for protein purification by IMAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP, Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4706</td>
			<td>reducing agent for protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents (HEPES, NaCl, etc)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>various</td>
			<td>Preparation of media and buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride (15N, 99%)</td>
			<td>Cambridge Isotope Laboratories</td>
			<td>NLM-467</td>
			<td>isotope labelling for NMR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D2O, Deuterium Oxide (D, 99.8%)</td>
			<td>Cambridge Isotope Laboratories</td>
			<td>DLM-2259</td>
			<td>NMR sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSS, Sodium 2,2-dimethyl-2-silapentane-5-sulfonate-D6 (D,98%)</td>
			<td>Cambridge Isotope Laboratories</td>
			<td>DLM-8206</td>
			<td>reference for NMR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision 5 mm NMR Tubes, 7&#8221; long</td>
			<td>SJM/Deuterotubes</td>
			<td>BOROECO-5-7</td>
			<td>NMR tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMR spectrometer (14.1 Tesla)</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>acquisition of NMR data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCI 5mm z-PFG cryogenic probe</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>acquisition of NMR data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bruker TopSpin 4.0.1</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>processing of NMR data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MO.Control</td>
			<td>NanoTemper Technologies</td>
			<td></td>
			<td>included with Monlith NT.115</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MO.Affinity Analysis</td>
			<td>NanoTemper Technologies</td>
			<td></td>
			<td>included with Monlith NT.115</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring interactions of globular and filamentous proteins by nuclear magnetic resonance spectroscopy (nmr) and microscale thermophoresis (mst)

Filamentöse Proteine wie Vimentin bieten Organisation innerhalb der Zellen durch die Bereitstellung einer strukturellen Gerüst mit Websites, die mit Plakin Proteine binden wiederholt. Hier ist ein Protokoll zur Erfassung und Messung solcher Wechselwirkungen beschrieben mit kugelförmigen Plakin Wiederholung Bereich der Envoplakin und die spiralförmige Spule Vimentin. Dies bietet eine Grundlage zur Feststellung, ob ein Protein Vimentin (oder ähnliche filamentöse Proteine) bindet und für die Messung der Affinität der Interaktion. Die kugelförmige Protein des Interesses ist beschriftet mit 15N und titriert mit Vimentin Protein in Lösung. Eine zweidimensionale NMR-Spektrum wird erworben, Interaktionen zu erkennen, durch die Beobachtung von Veränderungen der Peakform oder chemische Veränderungen und Auswirkungen der Lösungsbedingungen einschließlich Salzgehalte, die Vimentin quartäre Struktur beeinflussen zu erhellen. Wenn das Protein des Interesses den filamentösen Liganden bindet, wird die Bindung Interaktion durch MST mit der gereinigten Proteine quantifiziert. Der Ansatz ist eine einfache Möglichkeit zur Feststellung, ob ein Protein des Interesses ein Filament bindet und für die Beurteilung, wie Änderungen, wie Mutationen oder Lösungsbedingungen, beeinflussen die Interaktion.

Die E-PRD-Domäne (Rückstände 1822-2014 in pProEX-HTC kloniert) des menschlichen Envoplakin Gens und der VimRod-Domäne (Rückstände in pET21a kloniert 99-249) des menschlichen Vimentin4 ausgedrückt mit His6 Tags und gereinigt wurden. Abbildung 6 und Abbildung 7 zeigen die Reinheit des VimRod (18.8 kDa) und E-PRD (21,8 kDa) erhalten von dieser Methode der Proteinreinigung. Die Entfernung von der His6 Tag aus dem E-PRD-Konstrukt wesentlich für die MST-Experimente ist, da das VimRod-Protein wird mit einer His6 Tag verbindlich Färbung gekennzeichnet und jede E-PRD Beibehaltung seiner His6 Tag kann an den Qualifikationsturnieren für die Bindung des Farbstoffes. Die zweite Spalte der IMAC nach Spaltung des Tags mit TEV Protease entfernt der TEV-Protease, die gespalten Tag und uncleaved His6-E-PRD, die blieb. Die letzte Polierstufe der Reinigung ist Größe Ausgrenzung Chromatographie. Obwohl beide Proteine von ähnlicher Größe, elutes die VimRod aus der Spalte bei einem 51 mL, während E-PRD Elution Peak bei 72 mL zentriert ist, wo ein Protein-Monomer dieser Größe erwarten würde. Die scheinbare Zunahme der Größe der VimRod ist wahrscheinlich wegen der seine Eigenschaften als eine filamentöse lange Rute geformte Protein wie analytisch Ultrazentrifugen Experimente zeigten, dass VimRod Monomere4war. Geringere Erträge des Proteins ergeben sich aus den Kulturen angebaut in M9 als jene aus reichen Brühe aufgrund einer geringeren Menge an Zellen in den minimalen Medien produziert wird. Das erste Wachstum der größeren Starterkulturen für M9 Vorbereitungen in TB ermöglicht Verbesserung der Zelle Renditen und gleichzeitig das Ausmaß der 15N Kennzeichnung notwendig für die NMR-Experimente.
15N -1H HSQCs wurden für den Wildtyp und R1914E-Mutante von E-PRD in Anwesenheit oder Abwesenheit von VimRod (Abb. 8A-8D) erworben. Das Spektrum der E-PRD in Abbildung 8A zeigt die erwartete Anzahl von gut gelöst Gipfeln, bezeichnend für ein richtig gefaltetes Protein. In Anwesenheit von VimRod (Abb. 8 b) zeigt das Spektrum umfassenden Produktpalette erweitern und Gipfel verschwinden, Bindung zwischen E-PRD und VimRod entspricht. Diese Bindung ist durch Mutation des R1914E als belegt durch Vergleich von Abbildung 8 und 8 Dverloren. Kleine Änderung wird im Spektrum bei Zusatz von VimRod, die R1914E mutierten zeigt einen Mangel an Bindung zwischen diesem mutierten E-PRD und VimRod beobachtet. E-PRD Peak Intensitäten in die Anwesenheit/Abwesenheit der VimRod wurden verglichen und als die relative Peak Intensitäten in Abbildung 8E, was darauf das Spektrum hindeutet der Peak Verbreiterung in der E-PRD-Komplex dargestellt. R1914E-Mutante von E-PRD (nicht dargestellt) erhalten ca. 97 % der Peaks bei 20 % oder höherer Peak Intensität in Anwesenheit des VimRod im Vergleich zu etwa 20 % für den Wildtyp (Abbildung 8E). Diese steht für einen Verlust der Funktion Punkt Mutant mit zusätzlichen Mutanten mit mittleren Wirkungen auch mit Studium4gewesen.
Zu validieren und die Bindung von VimRod und E-PRD MST-Analyse mit His6-VimRod beschriftet mit rot-Tris-NTA Leuchtstofffärbung als Ziel quantitate gemischt mit abnehmender Konzentration des Liganden E-PRD von 1,28 mM um 39,1 nM durchgeführt wurden. Drei verbindliche Titrationen wurden durchgeführt und die Ergebnisse werden gemittelt und in Abbildung 9gezeigt. Die Daten wurden mit einem standard-Modell ein-Standort-Ligand-Bindung passen und gab eine K-D von 25,7 ± 2,1 μm. Bewertung der Bindung zwischen VimRod und E-PRD durch Oberflächenplasmonenresonanz gab einen ähnlichen KD -Wert von 19,1 ± 1,3 μm4.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58537/58537fig1.jpg"> Abbildung 1: Screenshot des Setups des NMR-Experimentes. Abgebildete Fenster dient ein standard Experiment so einrichten, dass ein HSQC--Dataset zu sammeln. Testparameter eingelesen sind neben dem Experiment. Das ZGPR-Experiment gezeigt wird als ein erstes Experiment gewählt, die Standard- und Lösungsmittel abhängigen Proton-Parameter zu laden. Der Titel Fenster dient zur Eingabe experimentelle Daten für Zwecke der Aufzeichnungen. Um das HSQC-Spektrum zu sammeln ist das ZGPR-Experiment mit SFHMQC3GPPH ersetzt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58537/58537fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58537/58537fig2.jpg"> Abbildung 2: Einstellen der NMR Versuchsparameter. Abgebildete Fenster dient zur Eingabe der Grundparameter für die NMR-Pulsfolge um das Signal zu optimieren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58537/58537fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58537/58537fig3.jpg"> Abbildung 3: NMR Datenverarbeitung. Parameter für die Bearbeitung jeder der zwei Dimensionen des NMR-Spektrums verwendet werden angezeigt, mit Pfeilen, die diejenigen, die in der Regel angepasst sind. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58537/58537fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58537/58537fig4.jpg"> Abbildung 4: Parameter für NMR-Peak Picking. Die Parameter für die Kommissionierung NMR Gipfeln in der verarbeiteten NMR-Spektrum werden mit typischen Werten angezeigt. Passen Sie die ppm-Bereich, die Intensität und die Anzahl der Spitzen, die Spektren zu optimieren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58537/58537fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58537/58537fig5.jpg"> Abbildung 5: Vertreter Peaklist mit Intensitäten. Jede Spitze, die in der NMR-Spektrum aufgenommen wird erhält eine Nummer und seinem 1H und 15N chemische Verschiebungen und Signalstärke angezeigt. Dieser Peaklist kann dann verwendet werden, Spektren erwarb die Anwesenheit/Abwesenheit von einem interagierenden Partner zu vergleichen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58537/58537fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58537/58537fig6.jpg"> Abbildung 6: Reinigung von His6 getaggt VimRod von IMAC und S. A. Das Chromatogramm für die Elution aus der Spalte "IMAC" zeigt einen großen Höhepunkt des VimRod. B. das Chromatogramm für die Elution aus der Spalte "S" zeigt einen großen Höhepunkt. C. SDS-PAGE der Fraktionen im Laufe der Reinigung gesammelt: MW-Standards mit der MW im kDa auf der linken Seite des Gel (M), Zelle lysate (1), IMAC Durchfluss (2), waschen (3), gepoolte Elution (E1), gebündelt S Elution (E2) angegeben. Bands bei höheren Molmassen in Bahnen E1 und E2 sind Oligomere des reinen VimRod durch western-Blot (Daten nicht gezeigt) bestätigt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58537/58537fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58537/58537fig7.jpg"> Abbildung 7: Reinigung des E-PRD von IMAC und S. A. SDS-PAGE der IMAC Reinigung zeigt das Molekulargewicht Standards mit den MW in kDa angegeben, auf der linken Seite das Gel (M) und das Eluat aus der ersten IMAC-Spalte (E1), der TEV Spaltung Produkte (+ TEV), und der Durchfluss aus der zweiten Spalte der IMAC (FT). (B) der Chromatograph aus der Spalte "S" zeigt einen großen Höhepunkt. C. SDS-PAGE Molekulargewicht Normen (M) und die Fraktionen von S-Spitze. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58537/58537fig7large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58537/58537fig8.jpg"> Abbildung 8: HSQC-Spektren von Wildtyp und R1914E-Mutante von E-PRD in Anwesenheit und Abwesenheit von VimRod. Die HSQC-Spektren zeigen Wildtyp E-PRD (100 µM) in 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM DTT, pH-Wert 7 in Abwesenheit (A) oder die Anwesenheit von 50 µM VimRod (B). Panels, C und D sind die HSQC-Spektren der R1914E Mutant (100µM) in das Fehlen oder Vorhandensein von 50 µM VimRod, beziehungsweise. Im E relative 1H -15N Gipfel sind Intensitäten der E-PRD mit oder ohne VimRod Bindung in Abhängigkeit von der Höchstzahl angezeigt, die willkürlich zugeordnet und nicht anhand der Reihenfolge Position. Diese Werte können verwendet werden, um eine Bedeutung Cutoff für Peak Intensität Reduktion bei Zusatz eines Liganden zu definieren. Wenn Zuordnungen zur Verfügung stehen, können signifikante Werte oft gesehen werden, ein Bindungsbereich zuordnen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58537/58537fig8large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58537/58537fig9.jpg"> Abbildung 9: Bindung von E-PRD, VimRod. E-PRD wurde in einer Reihe von zwei-Fach-Verdünnungen von 1,28 mM um 39,1 verdünnt nM und vor der Ausführung MST-Analyse mit beschrifteten VimRod inkubiert. Daten aus drei unabhängigen Tests wurden kombiniert. Die Daten wurden zu einem K-D -Modell geben eine K-D von 25,7 μM mit einem KD Vertrauen von ± 2,1 μm passen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58537/58537fig9large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Reagenz</td>
			<td>Menge</td>
		</tr>
<tr>
<td>Natriumphosphat, Diabas-(wasserfrei)</td>
			<td>6,2 %</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kalium-Phosphat, monobasic (wasserfrei)</td>
			<td>3,2 %</td>
		</tr>
<tr>
<td>Natrium-Chlorid</td>
			<td>0,5 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>H2O</td>
			<td>Bis zu 950 mL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1. M9 Medien zur isotopischen Kennzeichnung.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Reagenz</td>
			<td>Menge</td>
		</tr>
<tr>
<td>
15 NH4Cl</td>
			<td>1,0 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glukose (oder 13C-Glukose)</td>
			<td>2,0 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M MgSO4
</td>
			<td>2 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>50 mM CaCl2
</td>
			<td>4 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>20 mg/mL Thiamin</td>
			<td>1,0 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>3 mM FeCl3
</td>
			<td>400 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Metall-Mix (Tabelle 3)</td>
			<td>500 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>H2O</td>
			<td>Bis zu 50 mL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 2. Nährstoff-Mix für die Ergänzung der M9 Medien.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Reagenz</td>
			<td>Menge</td>
		</tr>
<tr>
<td>4 mM ZnSO4
</td>
			<td>323 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 mM MnSO4
</td>
			<td>75,5 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>4,7 mM H3BO3
</td>
			<td>145 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>0,7 mM CuSO4
</td>
			<td>55,9 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>H2O</td>
			<td>Bis zu 500 mL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 3. Metall-Mix Ergänzung zur Anreicherung des MT-Nährstoffen-Mix.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Probe</td>
			<td>1 mM E-PRD in Puffer A1 (µL)</td>
			<td>1mM VimRod in Puffer A (µL)</td>
			<td>Puffer (µL)</td>
			<td>200 µM DSS in D2O (µL)</td>
			<td>Puffer B2 (µL)</td>
			<td>Gesamtvolumen (µL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>E-PRD allein</td>
			<td>50</td>
			<td>0</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
			<td>350</td>
			<td>500</td>
		</tr>
<tr>
<td>E-PRD + VimRod</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
			<td>0</td>
			<td>50</td>
			<td>350</td>
			<td>500</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">
1 Puffer A: 20 mM Tris-HCl, 1 mM DTT, pH 7</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">
2 Puffer B: 23 mM Tris-HCl, 1,14 mM DTT, pH 7</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 4. NMR-Probenvorbereitung.

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Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy NMR and Microscale Thermophoresis MST

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die Herstellung und Reinigung von Proteinen, die gekennzeichnet sind mit stabilen Isotopen und anschließende Charakterisierung von Protein-Protein-Wechselwirkungen mit Spektroskopie der Kernspinresonanz (NMR) und MicroScale Thermophorese (MST) Experimente.

Messung der Interaktionen von Kugelsternhaufen und filamentösen Proteinen Kernresonanzspektroskopie (NMR) und Microscale Thermophorese (MST)

Filamentous proteins such as vimentin provide organization within cells by providing a structural scaffold with sites that bind proteins containing plakin ...

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Protein-Interaktionsfeld zu beantworten, z. B. ob Protein direkt an ein kleines oder ein großes Molekül bindet. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass es einfach und schnell ist, direkte Wechselwirkungen auf atomarer Ebene zu erkennen. Schalten Sie den Luftstrom mit dem Auswurfbefehl ej ein.Dadurch wird die Probe vom Magneten nach oben gebracht. Platzieren Sie nun die Probe in einem Spinner auf dem Magneten in der Öffnung. Einfügen mit dem Befehl ij.Warten Sie, bis sich die Probe im Inneren des Magneten absetzt, bevor Sie fortfahren. Erstellen Sie ein neues Dataset mit dem Befehl edc und laden Sie Standardproton NMR-Parameter, indem Sie das Experiment ZGPR auswählen. Geben Sie die Felder NAME, Experimentnummer und verarbeitete Datenordnernummern ein.Wählen Sie das Lösungsmittel im Feld Set-Lösungsmittel aus und klicken Sie auf Getprosol ausführen, um Standard-Sondenkopf- und lösungsmittelabhängige Parameter zu lesen. Sperren Sie die Probe mit dem Befehl Lock an das deuterated Lösungsmittel und warten Sie, bis sie mit dem Sweep abgeschlossen ist und die Sperre erreicht wird. Korrigieren Sie die Resonanzfrequenz des Magneten, indem Sie die Probe mit dem automatischen Tuning-Befehl atma abstimmen.Überwachen Sie die Wackelkurve, bis die automatische Abstimmung abgeschlossen ist. Shim das Magnetfeld mit Topshim. Shimming nimmt die Anpassung an das Magnetfeld vor.Erzielen Sie Dieuniformität um die Probe herum. Es ist empfehlenswert, dies in Werten mit dem Befehl wsh zu speichern und sie mit rsh vor topshim zu lesen, wenn die gleichen oder ähnliche Beispiele verwendet werden. Passen Sie nun die Empfängerverstärkung mit dem befehl rga an, um das maximale Signal-Rausch-Verhältnis zu erreichen.Platzieren Sie die Mitte des Spektrums auf dem Wasserresonanzversatz, und stellen Sie den 90-Grad-Protonenimpuls mit calibo1p1 auf hohe Leistung ein. Sammeln Sie das Protonenspektrum mit dem Befehl zero go zg und verarbeiten Sie es mit efp. Dazu gehören exponentielle Multiplikation, der freie Induktionszerfall mit Linienverbreiterung, Fourier-Transformation von FID und pk zur Anwendung der Phasenkorrektur.Wenden Sie die automatische Phasenkorrektur apk und die automatische Baseline-Korrektur absn mit dem Polynom ohne Integrationsoption an. Erstellen Sie ein neues Dataset für das SOFAST HMBC-Experiment, indem Sie im Experiment SFHMQC3GPPH auswählen. Kopieren Sie die optimierten P1 und O1 aus dem Protonenspektrum und füllen Sie P1-abhängige Impulse mit dem Befehl getprosol 1H p1 plw1, wobei p1 der optimierte P1-Wert und plw1 die Leistungsstufe für P1 ist. Optimieren Sie nun die CNST54-Konstante, um den Offset für die chemische Verschiebung im Amid einzustellen.Optimieren Sie auch CNST55, um die Bandbreite zu definieren, um die spektralen Bereiche von Interesse zu umfassen, so dass die Empfängerverstärkung optimiert werden kann. Um diese Parameter auszuwählen, extrahieren Sie die erste FID aus dem zweidimensionalen Spektrum und suchen Sie nach dem beobachteten Signal, um sie zu definieren. Darüber hinaus variieren Sie die Entspannungsverzögerung, die Anzahl der Scans und Dummy-Scans, um eine akzeptable Signalempfindlichkeit mit dem Befehl gs zu erhalten, der es go and scan ermöglicht, die Datenqualität in Echtzeit zu überwachen.Notieren Sie schließlich die Spektren mit Zero Go zg. Legen Sie die Verarbeitungsparameter auf die Größe der direkten F2- und indirekten F1-Dimensionen des Spektrums fest, mit optionaler linearer Vorhersage in der indirekten Dimension. Wählen Sie QSINE als Fensterfunktion aus und geben Sie eine Sinusglockenverschiebung von zwei ein, um das zweidimensionale Spektrum zu verarbeiten.Geben Sie den Befehl xfb ein, um die Daten in beide Richtungen mit Fensterfunktion und Fourier-Transformation zu verarbeiten. Verwenden Sie den Befehl apk2d, um die automatische Phasenkorrektur in beide Richtungen durchzuführen. Korrigieren Sie die Baseline mit der automatischen Baseline-Korrekturfunktion abs2 für 2D-Daten.Dies wendet eine Polynomfunktion zwischen den in den Verarbeitungsparametern definierten ppm-Werten an und erzeugt ein 2D-Spektrum für die weitere Analyse. Wenn Sie eine serielle Verarbeitung zum Vergleich von Interaktionsdaten mit einem anderen Molekül planen, speichern Sie die Verarbeitungsparameter mit dem Befehl wpar und rufen Sie sie mit rpar ab. Geben Sie den Befehl pp ein, um den Prozess der Spitzenauswahl zu beginnen.Definieren Sie den ppm-Bereich, die minimale Intensität und die maximale Anzahl von Spitzen basierend auf erwarteten Spitzen. Klicken Sie dann auf OK. Überprüfen Sie die Ergebnisse durch visuelle Inspektion. Führen Sie den Prozess bei Bedarf erneut aus, bis die Ergebnisse aufgrund der Spektrenqualität zufriedenstellend sind.Generieren Sie eine Spitzenliste mit dem Befehl pp. Diese Spitzenliste enthält standardmäßig Datenhöhen- und Spitzenintensitätsinformationen. Die Peak-Liste kann in nachfolgende Spektren exportiert und von anderen Programmen gelesen werden.Beobachten Sie nun das Protein HSQC-Spektren für Veränderungen der Spitzenintensitäten oder Bewegungen in chemischen Verschiebungen, die auf eine Wechselwirkung mit einem anderen Molekül hinweisen. Wenn das interagierende Molekül groß ist, erwarten Sie Eine Verringerung der Spitzenintensitäten zusammen mit dem Verschwinden einiger Spitzen. Importieren Sie die Spitzenliste in den nächsten Datensatz, indem Sie auf die Registerkarte Peaks klicken und importieren sie mit einem Rechtsklick im Peaks-Fenster auswählen.Visualisieren Sie die Spitzen über dem Spektrum und verschieben Sie sie bei Bedarf in neue Positionen. Klicken Sie auf Reset-Intensitäten für eine vollständige Tabelle, um eine Spitzenliste für das Spektrum zu generieren, das Intensitäten enthält. Diese Spitzenliste überträgt die Positionsinformationen aus der gespeicherten Peak-Liste.Exportieren Sie die Spitzenlisten aus verschiedenen Datasets zur Analyse in eine Kalkulationstabelle oder ein anderes mathematisches Programm, indem Sie die Exportfunktion auswählen. Berechnen Sie die Veränderung der Spitzenintensitäten mit der Funktionsspitzenintensität im komplexen Spektrum, der Spitzenintensität im Proteinspektrum für jeden Peak. Werte können durch Multiplikation mit 100 in prozentuale Änderung konvertiert werden.Beachten Sie, dass Spitzenvolumen ebenfalls nützlich sind, obwohl Spitzenintensitäten für Spitzen, die nahe beieinander positioniert sind, leichter zu messen sind, wie dies normalerweise bei Proteinen mit einer hohen Dichte von relativ breiten Spitzen der Fall ist. Die N15HSQCs wurden für den Wildtyp E-PRD sowie den R1914E Mutanten in Gegenwart oder Abwesenheit von VimRod erworben. Das Spektrum der Wilden-Typ E-PRD zeigt die erwartete Anzahl von gut gelösten Spitzen, was auf ein richtig gefaltetes Protein hindeutet.In Anwesenheit von VimRod zeigt das Spektrum eine umfangreiche Linienverbreiterung und das Verschwinden von Spitzen, was der Bindung zwischen E-PRD und VimRod entspricht. Zwischen dem Spektrum der R1914E Mutante allein und nach Zugabe von VimRod wird kaum eine Veränderung beobachtet, was auf einen Mangel an Bindung an diese mutierte E-PRD hindeutet. Hier wurden die E-PRD-Spitzenintensitäten in Gegenwart und Abwesenheit von VimRod verglichen und als relative Spitzenintensitäten dargestellt, um den Bereich der Spitzenerweiterung im E-PRD-Komplex anzuzeigen.Um die Bindung von VimRod und E-PRD zu validieren und zu quantifizieren, wurde die MST-Analyse mit His6-VimRod, die mit fluoreszierendem RED-Tris-NTA-Farbstoff als Ziel gekennzeichnet ist, mit abnehmenden Konzentrationen des E-PRD-Ligands durchgeführt. Die Daten passten zu einem Standardmodell der einteiligen Ligandenbindung und ergaben einen KD von 25,7 plus oder minus 2,1 Mikromolaren. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, identische Erfassungs- und Verarbeitungsbedingungen zu verwenden.wird wegen des Zugangs zu Isotopen-markierten Proteinproben für die Sammlung von NMR-Spektren kämpfen. Die Implikationen dieser Technik reichen auf die Therapie von Krebs, Infektion oder neurodegenerativen Erkrankungen, weil sie die Bildung von Protein-Wechselwirkungen beinhalten, die in der Krankheit beeinträchtigt sind.

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Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR) and Microscale Thermophoresis (MST)

Interpreting Nuclear Magnetic Resonance Spectra

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Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for the Identification of Multiple Phosphorylations of Intrinsically Disordered Proteins

Kernresonanzspektroskopie zur Identifizierung von Multiple Phosphorylierungen von intrinsisch ungeordneten Proteinen

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Mapping the Binding Site of an Aptamer on ATP Using MicroScale Thermophoresis

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Kovalente Immobilisierung von Proteinen für die Einzelmolekül-Spektroskopie Kraft

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

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Eine Fluoreszenz Fluktuation Spektroskopie Assay von Protein-Protein-Wechselwirkungen an den Zell-Zell-Kontakten

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Preparation of Fungal and Plant Materials for Structural Elucidation Using Dynamic Nuclear Polarization Solid-State NMR

Vorbereitung von Pilz und Pflanze-Materialien für strukturelle Aufklärung mittels dynamischen atomare Polarisation Festkörper-NMR

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Measuring Interactions between Fluorescent Probes and Lignin in Plant Sections by sFLIM Based on Native Autofluorescence

Messung von Wechselwirkungen zwischen fluoreszierenden Sonden und Lignin in Pflanzenabschnitten durch sFLIM basierend auf nativer Autofluoreszenz

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Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

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Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Querschnitt von reifem Reis (Oryza sativa L.) Kerne für die Rasterelektronenmikroskopie-Bildgebung mit Pipettenspitzen als Immobilisierungsunterstützung

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Removal and Replacement of Endogenous Ligands from Lipid-Bound Proteins and Allergens

Entfernung und Ersatz endogener Liganden aus lipidgebundenen Proteinen und Allergenen

Many major allergens bind to hydrophobic lipid-like molecules, including Mus m 1, Bet v 1, Der p 2, and Fel d 1. These ligands are strongly retained and ...