Name: measuring interactions of globular and filamentous proteins by nuclear magnetic resonance spectroscopy (nmr) and microscale thermophoresis (mst)
Uploaded: 2018-11-02T14:45:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy NMR and Microscale Thermophoresis MST at JoVE.com

इस परियोजना NSERC RGPIN द्वारा समर्थित किया गया है-2018-04994, परिसर अलबर्टा नवाचार कार्यक्रम (आरसीपी-12-002C) और अलबर्टा Prion अनुसंधान संस्थान/अलबर्टा नवाचारों जैव समाधान (२०१६०००१८), एम ओ और जीनोम कनाडा और कनाडा फाउंडेशन के लिए संमानित किया Metabolomics इनोवेशन सेंटर (TMIC) तथा NANUC को नवाचार अनुदान प्रदान किया गया ।

<ol>
	<li>Vinogradova, O., Qin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR+as+a+unique+tool+in+assessment+and+complex+determination+of+weak+protein-protein+interactions.">NMR as a unique tool in assessment and complex determination of weak protein-protein interactions.</a> Topics in Current Chemistry. 326, 35-45 (2012).</li><li>McKercher, M. A., Wuttke, D. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+One+-+Next-Generation+AUC+Adds+a+Spectral+Dimension:+Development+of+Multiwavelength+Detectors+for+the+Analytical+Ultracentrifuge.">Chapter One - Next-Generation AUC Adds a Spectral Dimension: Development of Multiwavelength Detectors for the Analytical Ultracentrifuge.</a> Methods in Enzymology. 562, 1-26 (2015).</li><li>Gorbet, G. E., Pearson, J. Z., Demeler, A. K., C&#246;lfen, H., Demeler, B., Cole, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+Two+-+Next-Generation+AUC:+Analysis+of+Multiwavelength+Analytical+Ultracentrifugation+Data.">Chapter Two - Next-Generation AUC: Analysis of Multiwavelength Analytical Ultracentrifugation Data.</a> Methods in Enzymology. 562, 27-47 (2015).</li><li>Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-binding+assays+in+biological+liquids+using+microscale+thermophoresis.">Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis.</a> Nature Communications. 1, 100 (2010).</li><li>Jerabek-Willemsen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroScale+Thermophoresis:+Interaction+analysis+and+beyond.">MicroScale Thermophoresis: Interaction analysis and beyond.</a> Journal of Molecular Structure. 1077, 101-113 (2014).</li></ol>

लेखकों के हितों का कोई संघर्ष का खुलासा ।

प्रोटीन के बीच बातचीत आणविक मशीनों है कि कोशिकाओं के भीतर आदेश बनाने के गठन की अनुमति देते हैं । व्यक्तिगत बातचीत अक्सर कमजोर हैं, लेकिन आमतौर पर multivalent परिसरों कि सहकारी और गतिशील विनियमित किया जा सकता है के लिए योगदान । संवेदनशील परख है कि परमाणु संकल्प और इस तरह के जटिल बातचीत के बारे में मात्रात्मक जानकारी प्रदान deduce तंत्र और डिजाइन हस्तक्षेप जैसे दवा के अणुओं की तरह की जरूरत है । एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी प्रोटीन बातचीत के बारे में इस तरह की जानकारी प्राप्त करने के लिए एक कुशल तरीका है, और भी उन है कि कमजोर1बांध सहित लाइगैंडों के लिए तेजी से स्क्रीनिंग के लिए प्रयोग किया जाता है । एनएमआर तरीकों का इस्तेमाल किया उन है कि प्रोटीन का पालन कर रहे है या ligand निरीक्षण में वर्गीकृत किया जा सकता है । इस पांडुलिपि पूर्व दृष्टिकोण का उपयोग करता है जिसमें एक स्पेक्ट्रम एक स्थिर-आइसोटोप लेबल प्रोटीन है कि अपेक्षाकृत छोटे है (आमतौर पर 20 केडीए के तहत) का अधिग्रहण किया है और unlabel titrated है । यह अनुकूल मामलों में मैप किया जा करने के लिए बातचीत में शामिल लेबल अवशेषों की अनुमति. एक बार जटिल रूपों, वहां के अवशेषों बातचीत के रासायनिक वातावरण में परिवर्तन कर रहे है कि खुद को रासायनिक बदलाव और उनके एनएमआर संकेतों के आकार में परिवर्तन के रूप में प्रकट । इस तरह के परिवर्तनों की सीमा बातचीत में इन समूहों की भागीदारी की डिग्री के साथ संबद्ध । रासायनिक बदलाव perturbations (CSPs) के अभाव और ligand की अलग मात्रा की उपस्थिति में एकत्र प्रोटीन की एनएमआर स्पेक्ट्रा की एक श्रृंखला की तुलना द्वारा मापा जा सकता है । बड़े लाइगैंडों या जटिल इंटरैक्शन के लिए, पीक आकार या तीव्रता में परिवर्तन को deduce इंटरैक्शन से मापा जा सकता है.
सबसे आम 2d प्रयोग ligand बातचीत का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया 15N-heteronuclear एकल क्वांटम सहसंबंध (HSQC) प्रयोग2है । यह आवश्यक है कि एक प्रोटीन समान रूप से 15n, जो आम तौर पर उंहें समानता के रूप में व्यक्त- ई. कोलाई बैक्टीरियल 15n-समृद्ध मीडिया में हो संस्कृतियों में संस्करणों टैग के साथ लेबल किया जाना चाहिए । बाध्यकारी जब HSQC स्पेक्ट्रा अनुमापन के दौरान एकत्र आरोपित रहे हैं स्पष्ट है, जटिल गठन में शामिल अवशेषों का एक सबसेट के लिए पीक परिवर्तन खुलासा. बातचीत तेजी से विनिमय शासन में हो सकता है जहां स्वतंत्र और ligand-संतृप्त राज्य संकेतों एक जनसंख्या औसत शिखर में गिर जाते हैं । वैकल्पिक रूप से, राज्यों के बीच धीमे विनिमय के मामले में, दोनों संकेतों को उनके सापेक्ष मात्रा का प्रतिनिधित्व करने वाले अभिंन के साथ मनाया जाता है । जबकि एनएमआर lineshape विश्लेषण कुछ मामलों में बाध्यकारी समानताएं अनुमान के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, MST के रूप में तरीके भी सुविधाजनक साबित कर दिया है और वास्तविक बातचीत के पार मांयता प्रदान करते हैं ।
प्रदान की उदाहरण दो desmosomes के भीतर पाया प्रोटीन की है । वे सेल सतहों और cytoskeleton और मध्यस्थता त्वचा और दिल के ऊतकों की अखंडता को बनाए रखने और कतरनी बलों के झेलने के लिए सेल आसंजन मशीनों और मध्यवर्ती तंतुओं के बीच multivalent बातचीत के बीच जंक्शनों मध्यस्थता । रोग परिणाम कर सकते हैं जब desmosomal प्रोटीन जैसे desmoplakin या vimentin उत्परिवर्तनों या एंटीबॉडी से समझौता कर रहे हैं, सेल के स्थिरीकरण के लिए अग्रणी-सेल जंक्शनों, और इसलिए उनकी बातचीत महत्वपूर्ण महत्व के हैं3. desmosomal प्रोटीन द्वारा बाध्यकारी ligand का संरचनात्मक आधार एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा विशेषता हो सकता है, जबकि बातचीत quantified द्वारा MST किया जा सकता है । तरीकों के साथ साथ plakin दोहराने डोमेन (PRDs) है जो अक्सर साथ मिलकर सेट है कि बुनियादी खांचे, और vimentin, एक मध्यवर्ती रेशा है कि एक अंलीय अपनी पेचदार द्वारा की पेशकश की सतह के माध्यम से सूचना का आदान प्रदान के रूप में मौजूद है के बीच बातचीत की विशेषताएं थे बंडल4. इन परिसरों कोशिका झिल्ली जहां वे सेल cytoskeleton के मध्यवर्ती तंतु के लिए desmosomes कि आसंन कोशिकाओं से कनेक्ट करने के लिए लंगर का गठन कर रहे हैं, इस प्रकार एक ऊतक भर में radiates कि चिपकने वाला बांड का एक नेटवर्क बनाने ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Monolith NT.115, includes control and analysis software</td>
			<td>NanoTemper Technologies</td>
			<td>MO-G008</td>
			<td>Instrument for microscal thermophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His-Tag Labeling Kit RED-Tris-NTA</td>
			<td>NanoTemper Technologies</td>
			<td>MO-L008</td>
			<td>RED-tris-NTA dye for MST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard capillaries</td>
			<td>NanoTemper Technologies</td>
			<td>MO-K022</td>
			<td>capillaries for MST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HisTrap HP, 5 mL</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17524801</td>
			<td>IMAC column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HisPur Ni-NTA resin, 100 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88222</td>
			<td>IMAC resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiLoad 16/600 Superdex 75 pg</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28989333</td>
			<td>SEC column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEV protease</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T4455</td>
			<td>cleavage of his tag from E-PRD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21(DE3) Competent E. coli</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>C2527H</td>
			<td>cells for protein expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete Protease Inhibitor Cocktail Tablets EDTA-Free</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>11873580001</td>
			<td>protease inhibitors for protein purification by IMAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP, Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4706</td>
			<td>reducing agent for protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents (HEPES, NaCl, etc)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>various</td>
			<td>Preparation of media and buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride (15N, 99%)</td>
			<td>Cambridge Isotope Laboratories</td>
			<td>NLM-467</td>
			<td>isotope labelling for NMR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D2O, Deuterium Oxide (D, 99.8%)</td>
			<td>Cambridge Isotope Laboratories</td>
			<td>DLM-2259</td>
			<td>NMR sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSS, Sodium 2,2-dimethyl-2-silapentane-5-sulfonate-D6 (D,98%)</td>
			<td>Cambridge Isotope Laboratories</td>
			<td>DLM-8206</td>
			<td>reference for NMR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision 5 mm NMR Tubes, 7&#8221; long</td>
			<td>SJM/Deuterotubes</td>
			<td>BOROECO-5-7</td>
			<td>NMR tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMR spectrometer (14.1 Tesla)</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>acquisition of NMR data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCI 5mm z-PFG cryogenic probe</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>acquisition of NMR data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bruker TopSpin 4.0.1</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>processing of NMR data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MO.Control</td>
			<td>NanoTemper Technologies</td>
			<td></td>
			<td>included with Monlith NT.115</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MO.Affinity Analysis</td>
			<td>NanoTemper Technologies</td>
			<td></td>
			<td>included with Monlith NT.115</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring interactions of globular and filamentous proteins by nuclear magnetic resonance spectroscopy (nmr) and microscale thermophoresis (mst)

vimentin जैसे रेशा प्रोटीन साइटों के साथ एक संरचनात्मक पाड़ प्रदान करके कोशिकाओं के भीतर संगठन प्रदान करते है कि बांध प्रोटीन युक्त plakin दोहराता है । यहां, का पता लगाने और इस तरह के बातचीत को मापने के लिए एक प्रोटोकॉल envoplakin के गोलाकार plakin दोहराने डोमेन और vimentin के पेचदार कुंडल का उपयोग कर वर्णन किया गया है । यह निर्धारित करने के लिए एक आधार प्रदान करता है कि क्या एक प्रोटीन बांधता vimentin (या समान रेशा प्रोटीन) और बातचीत के संबध की माप के लिए । ब्याज की गोलाकार प्रोटीन समाधान में vimentin प्रोटीन के साथ 15N और titrated के साथ लेबल है । एक दो आयामी एनएमआर स्पेक्ट्रम पीक आकार या रासायनिक बदलाव में परिवर्तन देख द्वारा बातचीत का पता लगाने के लिए अधिग्रहण कर लिया है, और नमक का स्तर, जो vimentin चतुर्धातुक संरचना प्रभाव सहित समाधान की स्थिति के प्रभाव स्पष्ट । यदि ब्याज का प्रोटीन रेशा ligand बाँधता है, तो बाध्यकारी संपर्क को शुद्ध प्रोटीन का प्रयोग करके MST से quantified जाता है. दृष्टिकोण का निर्धारण करने के लिए एक सीधा रास्ता है कि ब्याज की एक प्रोटीन एक रेशा बांध, और कैसे परिवर्तन, जैसे उत्परिवर्तनों या समाधान की स्थिति के रूप में, आकलन के लिए बातचीत को प्रभावित ।

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Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy NMR and Microscale Thermophoresis MST

यहां, हम उत्पादन और स्थिर आइसोटोप के साथ लेबल कर रहे हैं कि प्रोटीन के शुद्धिकरण के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद है, और प्रोटीन प्रोटीन बातचीत के बाद के लक्षण वर्णन परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) स्पेक्ट्रोस्कोपी और अतिसूक्ष्म का उपयोग Thermophoresis (MST) उपाययोजना.

परमाणु चुंबकीय अनुनाद स्पेक्ट्रोस्कोपी (एनएमआर) और अतिसूक्ष्म Thermophoresis (MST) द्वारा गोलाकार और रेशा प्रोटीन की बातचीत को मापने

Filamentous proteins such as vimentin provide organization within cells by providing a structural scaffold with sites that bind proteins containing plakin ...

यह विधि प्रोटीन इंटरैक्शन क्षेत्र में महत्वपूर्ण सवालों के जवाब देने में मदद कर सकती है जैसे कि क्या प्रोटीन सीधे छोटे या बड़े अणु से बांधता है। इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि परमाणु स्तर पर सीधे बातचीत का पता लगाने का यह सरल और तेज तरीका है। इजेक्ट कमांड ईजे के साथ हवा के प्रवाह को चालू करें।इससे चुंबक से सैंपल ऊपर आ जाएगा। अब, उद्घाटन में चुंबक के शीर्ष पर एक स्पिनर के भीतर नमूना रखें। आदेश ij के साथ डालें।आगे बढ़ने से पहले नमूना चुंबक के अंदर सुलझेगी जब तक रुको। प्रयोग जेडपीपीआर का चयन करके ईडीसी कमांड और लोड स्टैंडर्ड प्रोटॉन एनएमआर मापदंडों का उपयोग करके एक नया डेटासेट बनाएं। नाम, प्रयोग संख्या और प्रोसेस किए गए डेटा फ़ोल्डर नंबर फ़ील्ड भरें.सेट सॉल्वेंट फील्ड में सॉल्वेंट का चयन करें और स्टैंडर्ड प्रोबहेड और सॉल्वेंट निर्भर पैरामीटर्स को पढ़ने के लिए एक्सिपेंड गेटप्रोसोल पर क्लिक करें। लॉक कमांड का उपयोग करके नमूना को ड्यूटेटेड सॉल्वेंट पर लॉक करें और तब तक प्रतीक्षा करें जब तक कि यह व्यापक रूप से समाप्त न हो जाए और लॉक प्राप्त न हो जाए। स्वचालित ट्यूनिंग कमांड एटमा का उपयोग करके नमूना ट्यूनिंग द्वारा चुंबक की प्रतिध्वनि आवृत्ति को सही करें।स्वचालित ट्यूनिंग पूरा होने तक लड़खड़ा वक्र की निगरानी करें। टॉपशिम का उपयोग करके चुंबकीय क्षेत्र को शिम करें। शिमिंग चुंबकीय क्षेत्र में समायोजन करता है।नमूने के चारों ओर एकरूपता प्राप्त करें। कमांड डब्ल्यूएसएच के साथ इसे मूल्यों में स्टोर करना अच्छा अभ्यास है, और यदि समान या समान नमूनों का उपयोग करते हुए टॉपशिम से पहले उन्हें rsh का उपयोग करके पढ़ा जाता है। अब शोर अनुपात के लिए अधिकतम संकेत प्राप्त करने के लिए आरजीए कमांड के साथ रिसीवर लाभ समायोजित करें।पानी की गूंज ऑफसेट पर स्पेक्ट्रम के केंद्र प्लेस, और calibo1p1 का उपयोग कर उच्च शक्ति पर ९० डिग्री प्रोटोन पल्स सेट । जीरो गो जेडजी कमांड और प्रक्रिया का उपयोग करके प्रोटोन स्पेक्ट्रम को ईएफपी के साथ ले जाएं। इसमें घातीय गुणा, लाइन विस्तार को शामिल करने वाले मुफ्त प्रेरण क्षय, एफआईआईडी के फोरियर ट्रांसफॉर्मेशन और फेज करेक्शन लागू करने के लिए पीके शामिल हैं।एकीकरण विकल्प के बिना पॉलीनोमियल का उपयोग करके स्वचालित चरण सुधार एपीके और स्वचालित बेसलाइन सुधार एबीएसएन लागू करें। प्रयोग में SFHMQC3GPPH का चयन करके सोफास्ट एचएमबीसी प्रयोग के लिए एक नया डेटासेट बनाएं। प्रोटोन स्पेक्ट्रम से अनुकूलित पी 1 और O1 को कॉपी करें और कमांड गेटप्रोसोल 1H पी 1 पीएलडब्ल्यू1 का उपयोग करके पी 1 निर्भर दालों को पॉप्युलेट करें, जहां पी 1 अनुकूलित पी 1 मूल्य है, और plw1 पी 1 के लिए शक्ति स्तर है। अब, अमीड केमिकल शिफ्ट के लिए ऑफसेट सेट करने के लिए CNST54 को स्थिर अनुकूलित करें।ब्याज के स्पेक्ट्रल क्षेत्रों को शामिल करने के लिए बैंडविड्थ को परिभाषित करने के लिए CNST55 को भी अनुकूलित करें, जिससे रिसीवर लाभ को अनुकूलित किया जा सके। इन मापदंडों का चयन करने के लिए, दो आयामी स्पेक्ट्रम से पहले एफआईआईडी निकालें और उन्हें परिभाषित करने के लिए मनाया संकेत की तलाश करें। इसके अलावा, कमांड जीएस के साथ स्वीकार्य संकेत संवेदनशीलता प्राप्त करने के लिए विश्राम में देरी, स्कैन की संख्या और डमी स्कैन भिन्न होते हैं, जो वास्तविक समय में डेटा की गुणवत्ता की निगरानी करने के लिए जाने और स्कैन करने में सक्षम बनाता है।अंत में, शून्य गो जेडजी का उपयोग करके स्पेक्ट्रा रिकॉर्ड करें। अप्रत्यक्ष आयाम में वैकल्पिक रैखिक भविष्यवाणी के साथ स्पेक्ट्रम के प्रत्यक्ष F2 और अप्रत्यक्ष F1 आयामों के आकार के लिए प्रसंस्करण मापदंडों को निर्धारित करें। विंडो फ़ंक्शन के रूप में क्यूसिन का चयन करें और दो आयामी स्पेक्ट्रम को संसाधित करने के लिए दो की साइन बेल शिफ्ट में प्रवेश करें।विंडो फ़ंक्शन और फोरियर ट्रांसफॉर्मेशन के साथ दोनों दिशाओं में डेटा को संसाधित करने के लिए कमांड एक्सएफबी दर्ज करें। दोनों दिशाओं में स्वचालित चरण सुधार करने के लिए कमांड apk2d का उपयोग करें। 2D डेटा के लिए ऑटोमैटिक बेसलाइन करेक्शन फंक्शन abs2 के साथ बेसलाइन को सही करें।यह प्रसंस्करण मापदंडों में परिभाषित पीपीएम मूल्यों के बीच एक पॉलीनोमियल फ़ंक्शन लागू करता है, और आगे के विश्लेषण के लिए 2डी स्पेक्ट्रम का उत्पादन करेगा। यदि किसी अन्य अणु के साथ इंटरैक्शन डेटा की तुलना के लिए धारावाहिक प्रसंस्करण करने की योजना बना रहे हैं, तो कमांड wpar के साथ प्रसंस्करण मापदंडों को स्टोर करें और उन्हें आरपीएआर के साथ याद करें। पीक पिकिंग की प्रक्रिया शुरू करने के लिए कमांड पीपी दर्ज करें।अपेक्षित चोटियों के आधार पर पीपीएम रेंज, न्यूनतम तीव्रता और अधिकतम संख्या में चोटियों को परिभाषित करें। इसके बाद ओके पर क्लिक करें। दृश्य निरीक्षण द्वारा परिणामों को सत्यापित करें। यदि आवश्यक हो, तो प्रक्रिया को तब तक फिर से चलाएं जब तक कि स्पेक्ट्रा गुणवत्ता के आधार पर परिणाम संतोषजनक न हों।पीपी कमांड के साथ एक चोटी की सूची उत्पन्न करें। इस पीक सूची में डिफ़ॉल्ट रूप से डेटा ऊंचाई और चोटी की तीव्रता की जानकारी शामिल है। पीक सूची बाद के स्पेक्ट्रम के लिए निर्यात किया जा सकता है और अन्य कार्यक्रमों द्वारा पढ़ा जा सकता है।अब प्रोटीन एचएसक्यूसी स्पेक्ट्रा का निरीक्षण करें जो किसी अन्य अणु के साथ बातचीत का संकेत देने वाले रासायनिक बदलावों में अधिकतम तीव्रता या आंदोलन में परिवर्तन के लिए होता है। यदि बातचीत करने वाला अणु बड़ा है, तो कुछ चोटियों के गायब होने के साथ-साथ चोटी की तीव्रता में कटौती की उम्मीद करें। चोटियों टैब पर क्लिक करके और चोटियों खिड़की में एक सही क्लिक के साथ आयात का चयन करके सेट अगले डेटा के लिए पीक सूची आयात।स्पेक्ट्रम पर चोटियों की कल्पना करें और यदि आवश्यक हो, तो उन्हें नए पदों पर स्थानांतरित करें। स्पेक्ट्रम के लिए एक चोटी की सूची उत्पन्न करने के लिए पूरी तालिका के लिए रीसेट तीव्रता पर क्लिक करें जिसमें तीव्रता शामिल है। इस चोटी की सूची संग्रहीत शिखर सूची से स्थिति जानकारी पर ले जाएगा ।निर्यात समारोह का चयन करके विश्लेषण के लिए विभिन्न डेटासेट से एक स्प्रेडशीट या अन्य गणितीय कार्यक्रम के लिए चोटी की सूचियों का निर्यात करें। जटिल स्पेक्ट्रम में समारोह पीक तीव्रता, प्रत्येक चोटी के लिए प्रोटीन स्पेक्ट्रम में पीक तीव्रता के साथ पीक तीव्रता में परिवर्तन की गणना करें। मानों को 100 गुणा करके प्रतिशत परिवर्तन में परिवर्तित किया जा सकता है।ध्यान दें कि चोटी की मात्रा भी उपयोगी है, हालांकि पीक तीव्रता चोटियों कि एक दूसरे के करीब तैनात हैं के लिए उपाय करने के लिए आसान कर रहे हैं, के रूप में आम तौर पर अपेक्षाकृत व्यापक चोटियों के एक उच्च घनत्व के साथ प्रोटीन के लिए मामला है । N15HSQCs जंगली प्रकार ई-पीआरडी के लिए अधिग्रहीत किए गए थे, साथ ही साथ R1914E उत्परिवर्ती, विमरोड की उपस्थिति या अनुपस्थिति में। जंगली प्रकार ई-पीआरडी के स्पेक्ट्रम अच्छी तरह से हल चोटियों की अपेक्षित संख्या से पता चलता है, एक ठीक से मुड़ा प्रोटीन का संकेत है ।विमरोड की उपस्थिति में, स्पेक्ट्रम ई-पीआरडी और विमरोड के बीच बाध्यकारी होने के अनुरूप व्यापक लाइन विस्तार और चोटी गायब होने को दर्शाता है। थोड़ा परिवर्तन R1914E उत्परिवर्ती के स्पेक्ट्रम के बीच अपने दम पर और VimRod के अलावा पर मनाया जाता है, इस उत्परिवर्ती ई पीआरडी के लिए बाध्यकारी की कमी का संकेत है । यहां VimRod की उपस्थिति और अनुपस्थिति में ई-पीआरडी पीक तीव्रता की तुलना की गई और ई-पीआरडी परिसर में चोटी के विस्तार की सीमा को इंगित करने के लिए सापेक्ष चोटी की तीव्रता के रूप में प्लॉट किया गया।विमरोड और ई-पीआरडी के बंधन को मान्य और मात्रा में निर्धारित करने के लिए, लक्ष्य के रूप में फ्लोरोसेंट रेड-ट्राइस-एनटीए डाई के साथ लेबल किए गए हिस 6-विमरॉड का उपयोग करके एमएसटी विश्लेषण, ई-पीआरडी लिगांड की घटती सांद्रता का उपयोग करके किया गया था। डेटा एक साइट लिगांड बाइंडिंग के एक मानक मॉडल के साथ फिट थे और 25.7 प्लस या माइनस 2.1 माइक्रोमोलर का केडी दिया। इस प्रक्रिया का प्रयास करते समय, समान अधिग्रहण और प्रसंस्करण स्थितियों का उपयोग करना याद रखना महत्वपूर्ण है।एनएमआर स्पेक्ट्रा के संग्रह के लिए आइसोटोप लेबल प्रोटीन नमूनों तक पहुंच के कारण संघर्ष करेंगे। इस तकनीक के निहितार्थ कैंसर, संक्रमण, या न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग की चिकित्सा की ओर विस्तार करते हैं क्योंकि उनमें प्रोटीन इंटरैक्शन का गठन शामिल होता है जो बीमारी में समझौता किया जाता है।

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Unit 1

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR) and Microscale Thermophoresis (MST)

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Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for the Identification of Multiple Phosphorylations of Intrinsically Disordered Proteins

आंतरिक रूप से बेक़ायदा प्रोटीन के एकाधिक Phosphorylations की पहचान के लिए परमाणु चुंबकीय अनुनाद स्पेक्ट्रोस्कोपी

Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer's disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, ...

Mapping the Binding Site of an Aptamer on ATP Using MicroScale Thermophoresis

बाध्यकारी microscale thermophoresis का उपयोग करते हुए एटीपी पर एक Aptamer की साइट मानचित्रण

Characterization of molecular interactions in terms of basic binding parameters such as binding affinity, stoichiometry, and thermodynamics is an ...

Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

परमाणु पैमाने पर Macromolecular विधानसभाओं के संरचनात्मक अध्ययन ठोस राज्य परमाणु चुंबकीय अनुनाद स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा

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सेल-सेल संपर्कों में प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन की एक प्रतिदीप्ति अस्थिरता स्पेक्ट्रोस्कोपी परख

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Preparation of Fungal and Plant Materials for Structural Elucidation Using Dynamic Nuclear Polarization Solid-State NMR

गतिशील परमाणु ध्रुवीकरण ठोस राज्य एनएमआर का उपयोग कर संरचनात्मक Elucidation के लिए कवक और संयंत्र सामग्री की तैयारी

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देशी ऑटोफ्लोरेसेंस के आधार पर एसएफआईएम द्वारा संयंत्र अनुभागों में फ्लोरोसेंट जांच और लिग्निन के बीच बातचीत को मापना

In lignocellulosic biomass (LB), the activity of enzymes is limited by the appearance of non-specific interactions with lignin during the hydrolysis ...

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

प्रोटीन-लिपिड इंटरैक्शन को मापने के लिए माइक्रोस्केल थर्मोफोरेसिस का उपयोग

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

परिपक्व चावल के अनुप्रस्थ विभाजन(Oryza sativa एल.) स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी इमेजिंग के लिए कर्नेल्स स्थिरीकरण समर्थन के रूप में पिपेट युक्तियाँ का उपयोग कर

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Removal and Replacement of Endogenous Ligands from Lipid-Bound Proteins and Allergens

लिपिड-बाउंड प्रोटीन और एलर्जेंस से एंडोजेनस लिगांड को हटाना और प्रतिस्थापन

Many major allergens bind to hydrophobic lipid-like molecules, including Mus m 1, Bet v 1, Der p 2, and Fel d 1. These ligands are strongly retained and ...