Name: measuring interactions of globular and filamentous proteins by nuclear magnetic resonance spectroscopy (nmr) and microscale thermophoresis (mst)
Uploaded: 2018-11-02T14:45:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy NMR and Microscale Thermophoresis MST at JoVE.com

Questo progetto è stato supportato da NSERC RGPIN-2018-04994, Campus Alberta Innovation Program (RCP-12-002C) e Alberta Prion Research Institute / soluzioni di Alberta Innova Bio (201600018), assegnato a Mangano e Genome Canada e Fondazione canadese per Sovvenzioni di innovazione per la metabolomica Innovation Centre (TMIC) e NANUC.

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Gli autori non divulgare conflitti di interesse.

Il 2D 15esperimento NMR N-risolto è uno dei più diffusi metodi per mostrare come due molecole interagiscono. È il metodo più ricco di informazioni che permette segnali di entrambi i partner di essere continuamente monitorati nel corso di un esperimento di titolazione in stato di soluzione. Anche se in genere qualitativa nel caso di grandi complessi, il metodo utilizzabile anche in casi favorevoli per misurare l'affinità di legame dove segnali NMR possono essere rintracciati in spettri ad alta risoluzione. Quando le assegnazioni possono essere fatte convenientemente, come nel caso di molte proteine sotto 20 kDa in dimensione, i siti di legame possono essere mappati. Saggi complementari quali MST forniscono informazioni quantitative sulle interazioni in soluzione e richiedono meno proteine negli Stati senza etichetta. Confronto di mutanti di associazione dei dati è utile per fornire controlli per garantire che le interazioni evidenziati dalla linea NMR ampliamento sono genuini e non artefatti di, ad esempio, le modifiche di aggregazione o viscosità.
Espressione della proteina
Semplificazione del processo di espressione riduce la quantità di produzione di proteine intensivo di manodopera. Parte di questo processo di ottimizzazione prevede l'individuazione di un appropriato ceppo di e. coli per l'espressione recombinant della proteina. Preferenza di ceppo dipende da elementi compresa la natura del vettore in uso e, più specificamente, il massimo della stabilità della proteina ricombinante è espresso7. Il rischio di degradazione della proteina eterologa da endogeno e. coli possono essere ridotto uso della proteasi proteasi carenti e. coli come il ceppo BL21. Per geni contenenti codoni rari, un ceppo ad esempio RIPL BL21-CodonPlus (DE3) può essere preferito. Questo ceppo unisce la natura carente di proteasi del ceppo BL21 copie aggiuntive endogeno del codone rara tRNAs per leucina, isoleucina, prolina e arginina. In alternativa, è possibile evitare codoni rari che possono compromettere la sovraespressione ordinando un costrutto codone-ottimizzato da una fonte commerciale. Molti ceppi di e. coli sono disponibili per l'espressione genica ricombinante, ciascuno ottimizzato per elusione di un particolare problema durante espressione7. Nel caso di questo studio, il ceppo carente di proteasi standard BL21 (DE3) prodotto quantità adeguate di proteine solubili per purificazione successiva e analisi.
Purificazione della proteina
Il protocollo di purificazione per una data proteina spesso è unico nel senso che ogni proteina rimane stabile e solubile in diverse condizioni quali temperatura, concentrazione di sale o pH. L'efficacia complessiva della purificazione mediante cromatografia di affinità è anche sensibile alla concentrazione di eluizione specie come imidazolo alle varie fasi durante il processo di purificazione. In questo lavoro, condizioni di buffer critico per IMAC erano pH per l'E-PRD e la concentrazione di imidazolo per il VimRod. Un pH di 7,5 era necessario per evitare la precipitazione del E-PRD seguendo eluizione iniziale dalla colonna IMAC. Per la purificazione di IMAC di VimRod, aumentando la concentrazione di imidazolo da 30 a 50 mM durante la fase di lavaggio della colonna è stato trovato per avere un miglioramento sostanza nella purezza delle frazioni eluizione finale. Per il passaggio di eluizione, anche aumentando la concentrazione di imidazolo da 250 a 350 mM è stato trovato per migliorare la resa dell'eluizione finale. I tentativi iniziali di eluire la proteina usando imidazolo 250 mM ha portato alla incompleta eluizione di VimRod come rivelato da una striscia di imidazolo 1m finale della colonna (dati non mostrati). Aumento della concentrazione di imidazolo e 350 mM per l'eluizione è stata sufficiente a recuperare tutta la proteina associata alla colonna. S può avere una duplice funzione perché agisce come un passaggio di lucidatura per purificazione della proteina durante l'esecuzione contemporaneamente cambio di buffer. Cambio di buffer è un passo fondamentale per l'analisi successiva associazione poiché rimuove l'imidazolo utilizzato per eluire la proteina His6-etichetta. Serve anche come un'opportunità per cambiare le condizioni come la concentrazione di sale o pH, che possono influenzare l'efficacia di determinate tecniche a valle o saggi. Proteina spostamento termico (PTS) può essere utilizzato per identificare il buffer ottimale per i dosaggi a valle, soprattutto per coloro che necessitano di proteina stabile per prolungati periodi di tempo a temperatura ambiente8,9.
Analisi di associazione
Proteina che viene preparata al momento è critica per analisi accurata obbligatorie, anche se congelata proteina può essere usato anche come i risultati vengono confrontati. Proteine filamentose come vimentin multimerize in un modo dipendente dalla sale e pH, e quindi la soluzione c'è bisogno di essere ottimizzato e oligomerico stato stimato da un metodo quale SEC10,11, dynamic light scattering condizione 12 o ultracentrifugazione analitica13,14,15. La spettroscopia NMR è adatta per la misurazione interazioni ligando di piccole proteine a risoluzione atomica. Tuttavia, quando una proteina interagisce con la molecola più grande, più lento barilatura deriva, e ciò si traduce in perdita di segnali, che può confermare l'associazione anche se esso non necessariamente consentire il mapping dei siti, che richiederebbero anche assegnazione di almeno di legame spina dorsale risonanze. In questo scenario, gli esperimenti NMR non consentono l'identificazione del sito di interazione. Quindi il sito diretto mutagenesi viene applicata per identificare i residui critici necessari per l'associazione. Tali mutanti pertanto non manifestano perdita di segnale. In questo protocollo, una forma mutante con una sostituzione alla posizione 1914 mantiene le intensità di picco in presenza di VimRod e conferma pertanto la rottura dell'interazione di E-PRD e VimRod. Assegnazione delle risonanze sidechain e backbone vorrei aggiungere valore a questo approccio, in particolare come la struttura per il gratuito E-PRD è stata risolta dalla cristallografia a raggi x4. Future applicazioni di RMN comprendono la caratterizzazione delle interazioni complesse fra le più grandi molecole e potranno beneficiare di magneti di campo ultra alto e l'uso di altri gruppi osservabile come 13C-etichetta e gruppi metile trifluoro come reporter.
MST ha una serie di vantaggi per lo studio di associazione interazioni16. I soci di associazione sono liberi in soluzione e non immobilizzati. Analisi della qualità dei campioni sono incorporata nel software con controllo qualità reporting dell'aggregazione, adsorbimento al capillari o insufficiente etichettatura fluorescente della molecola target. Piccole quantità di destinazione vengono in genere utilizzati, la concentrazione del target con etichetta è di solito tra 20-50 nM in un 10-20 μL volume/reazione. Questo protocollo utilizza volumi di reazione molto piccolo (10 μL) per massimizzare la concentrazione del ligando che possa essere raggiunti nelle titolazioni consentendo l'interazione di legame debole essere caratterizzato. Ciò richiede di pipettaggio accurata e la cura per evitare di introdurre bolle, mescolando ancora accuratamente. Miscelazione adeguata è fondamentale per misure di fluorescenza preciso, coerente lungo la serie di diluizioni seriali. La quantità di Tween-20 negli esperimenti MST è stato ridotto da standard 0.05-0.015% per ridurre la tendenza a creare bolle e migliorare la miscelazione.
Il colorante rosso-Tris-NTA fornisce un modo rapido, facile e conveniente per fluorescente etichettare qualsiasi proteina che ha una sua etichetta. L'etichettatura è effettivamente completo in soli 30 minuti ed è molto stretto in modo che non è necessaria alcuna procedura di rimozione tintura. Non sono modifiche ai residui dell'amminoacido nella proteina che potrebbe alterare le proprietà di legame del ligando. Un avvertimento è che solo la proteina di essere etichettato dovrebbe avere un tag His6. Ciò ha richiesto la scissione del tag dalla proteina legante, E-PRD e la rimozione del tag e ApoAlert E-PRD con un secondo passaggio di colonna IMAC. Se possibile, la proteina legante dovrebbe essere preparata senza l'uso di un suo tag. In alternativa, proteine possono essere etichettate in modo covalente con un fluoroforo attraverso ammina accoppiamento a residui di lisina o del tiolo di accoppiamento a residui di cisteina. Tuttavia, è necessario prestare attenzione quando l'utilizzo di tali sistemi dal collegamento covalente di un fluoroforo può influenzare interazioni elettrostatiche o polare associazione basandosi sui residui di lisina o cisteina. La quantificazione delle affinità tra la VimRod ed E-PRD da MST obbligatoria era insolitamente sensibile alla concentrazione di sale. Questo problema è stato attenuato da dialisi inizialmente la destinazione e il ligando in stesso lotto di tampone del saggio. Ciò nonostante, saturazione della curva associazione MST non poteva essere raggiunti quando si esegue il test di MST in presenza di 150 mM NaCl, a causa del comportamento complesso di VimRod. Dati affidabili e completi è stati ottenuti una volta che la concentrazione di NaCl è stata abbassata a 10 mM che permette il calcolo preciso della KD. Quindi, attenta ottimizzazione delle condizioni di soluzione e confronto con saggi complementari sono raccomandato per ottenere risultati affidabili. Inoltre, MST può essere usato per quantificare la dipendenza del sale per un'interazione specificata, quantificare stechiometrico proprietà delle interazioni della proteina, monitor il protein folding e sonda in enzima cinetica17.

Interazioni tra proteine permettono la formazione di macchine molecolari che creano ordine all'interno delle cellule. Le interazioni individuali sono spesso deboli ma solitamente contribuiscono a complessi polivalenti che possono essere cooperativo e dinamicamente regolato. Saggi sensibili che forniscono risoluzione atomica e informazioni quantitative su tali interazioni complesse sono necessari meccanismi di dedurre e progettare interventi quali molecole di droga-come. La spettroscopia NMR è un metodo efficiente per ottenere tali informazioni sulle interazioni della proteina e inoltre è usata per lo screening rapido per ligandi compresi quelli che legano debolmente1. I metodi di NMR utilizzati possono essere classificati in quelli che sono proteine osservare o ligando osservare. Questo manoscritto utilizza il primo approccio in cui viene acquisito un spettro di un isotopo stabile con l'etichetta della proteina che è relativamente piccola (solitamente sotto 20 kDa) e il ligando adenoida è titolato. In questo modo i residui con etichettati coinvolti nell'interazione deve essere mappato in casi favorevoli. Una volta le forme complesse, ci sono cambiamenti in ambienti chimici dei residui d'interazione che si manifestano come variazioni lo spostamento chimico e la forma dei loro segnali NMR. La portata di tali modifiche si correla con il grado di coinvolgimento di questi gruppi nell'interazione. Perturbazioni di spostamento chimico (CSP) possono essere misurati confrontando una serie di spettri NMR della proteina raccolti in assenza e in presenza di quantità variabili di ligando. Per ligandi più grandi o complesse interazioni, il cambiamento nella forma di picco o l'intensità può essere misurato per dedurre le interazioni.
L'esperimento 2D più comune utilizzato per la rilevazione di interazioni ligando è l'esperimento di 15N-eteronucleari singolo quantum correlazione (HSQC)2. Questo richiede che una proteina uniformemente essere etichettati con 15N, che è tipicamente realizzato di esprimerle come affinità-tagged versioni in colture batteriche di Escherichia coli coltivate in 15media N-arricchita. Associazione è apparente quando gli spettri HSQC raccolti durante la titolazione si sovrappongono, rivelando le modifiche di picco per un sottoinsieme dei residui coinvolti nella formazione complessa. L'interazione può verificarsi in regime di scambio veloce dove i segnali di stato libero e ligando-saturi collassano in una popolazione media di picco. In alternativa, nel caso di lenti scambi tra gli Stati, entrambi i segnali sono osservati con integrali che rappresentano i loro importi relativi. Mentre analisi lineshape NMR possono essere utilizzato per stimare le affinità di legame in alcuni casi, metodi quali MST inoltre hanno provato comodi e forniscono la convalida incrociata delle interazioni genuini.
L'esempio fornito è di due proteine che si trovano all'interno di desmosomi. Essi mediare giunzioni tra superfici delle cellule e del citoscheletro e mediare multivalenti interazioni tra macchine di adesione delle cellule e filamenti intermedi per mantenere l'integrità della pelle e tessuti del cuore e sopportare di elevate forze di taglio. Quando le proteine desmosomiali come desmoplakina o il vimentin sono compromessi da mutazioni o autoanticorpi, che conduce alla destabilizzazione delle giunzioni cellula-cellula, e quindi le loro interazioni sono di importanza critica3, possono provocare malattie. La base strutturale del ligando di proteine desmosomiali può essere caratterizzata dalla spettroscopia NMR, mentre le interazioni possono essere quantificate da MST. Metodi nel presente documento sono stati usati per caratterizzare le interazioni tra domini ripetere plakin (MDP) che spesso sono presenti come insiemi di tandem che offrono scanalature di base e il vimentin, un filamento intermedio che interagisce attraverso una superficie acida offerta dalla sua elicoidale Bundle4. Questi complessi sono formati alla membrana cellulare dove di ancoraggio per i filamenti intermedi del citoscheletro delle cellule a desmosomi che collegano alle celle adiacenti, formando così una rete di legami adesivi che si irradia durante un tessuto.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Monolith NT.115, includes control and analysis software</td>
			<td>NanoTemper Technologies</td>
			<td>MO-G008</td>
			<td>Instrument for microscal thermophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His-Tag Labeling Kit RED-Tris-NTA</td>
			<td>NanoTemper Technologies</td>
			<td>MO-L008</td>
			<td>RED-tris-NTA dye for MST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard capillaries</td>
			<td>NanoTemper Technologies</td>
			<td>MO-K022</td>
			<td>capillaries for MST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HisTrap HP, 5 mL</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17524801</td>
			<td>IMAC column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HisPur Ni-NTA resin, 100 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88222</td>
			<td>IMAC resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiLoad 16/600 Superdex 75 pg</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28989333</td>
			<td>SEC column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEV protease</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T4455</td>
			<td>cleavage of his tag from E-PRD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21(DE3) Competent E. coli</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>C2527H</td>
			<td>cells for protein expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete Protease Inhibitor Cocktail Tablets EDTA-Free</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>11873580001</td>
			<td>protease inhibitors for protein purification by IMAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP, Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4706</td>
			<td>reducing agent for protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents (HEPES, NaCl, etc)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>various</td>
			<td>Preparation of media and buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride (15N, 99%)</td>
			<td>Cambridge Isotope Laboratories</td>
			<td>NLM-467</td>
			<td>isotope labelling for NMR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D2O, Deuterium Oxide (D, 99.8%)</td>
			<td>Cambridge Isotope Laboratories</td>
			<td>DLM-2259</td>
			<td>NMR sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSS, Sodium 2,2-dimethyl-2-silapentane-5-sulfonate-D6 (D,98%)</td>
			<td>Cambridge Isotope Laboratories</td>
			<td>DLM-8206</td>
			<td>reference for NMR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision 5 mm NMR Tubes, 7&#8221; long</td>
			<td>SJM/Deuterotubes</td>
			<td>BOROECO-5-7</td>
			<td>NMR tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMR spectrometer (14.1 Tesla)</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>acquisition of NMR data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCI 5mm z-PFG cryogenic probe</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>acquisition of NMR data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bruker TopSpin 4.0.1</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>processing of NMR data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MO.Control</td>
			<td>NanoTemper Technologies</td>
			<td></td>
			<td>included with Monlith NT.115</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MO.Affinity Analysis</td>
			<td>NanoTemper Technologies</td>
			<td></td>
			<td>included with Monlith NT.115</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring interactions of globular and filamentous proteins by nuclear magnetic resonance spectroscopy (nmr) and microscale thermophoresis (mst)

Proteine filamentose come vimentin forniscono organizzazione all'interno delle cellule fornendo un'impalcatura strutturale con siti che legano proteine contenenti plakin si ripete. Qui, un protocollo per la rilevazione e la misurazione di tali interazioni è descritto utilizzando il dominio di ripetere plakin globulare di envoplakin e la bobina elicoidale di vimentina. Questo fornisce una base per determinare se una proteina si lega il vimentin (o simili proteine filamentose) e per la misura dell'affinità dell'interazione. La proteina globulare di interesse è etichettata con 15N e titolata con il vimentin proteina in soluzione. Uno spettro NMR bidimensionale viene acquisito per rilevare interazioni osservando cambiamenti in forma di picco o spostamenti chimici e per chiarire gli effetti delle condizioni di soluzione tra cui livelli di sale, che influenzano la struttura quaternaria vimentin. Se la proteina di interesse si lega il ligando filamentoso, l'interazione di associazione è quantificato dal MST utilizzando le proteine purificate. L'approccio è un modo semplice per determinare se una proteina di interesse viene associata un filamento e valutare come alterazioni, quali mutazioni o condizioni di soluzione, influenzano l'interazione.

Il dominio E-PRD (residui 1822-2014 clonati nel pProEX-HTC) del gene umano envoplakin e il dominio di VimRod (residui 99-249 clonati in pET21a) di vimentin umano4 erano espressi con i tag His6 e purificato. Figura 6 e Figura 7 dimostrare i livelli di purezza di VimRod (18,8 kDa) ed E-PRD (21,8 kDa) ottenuti da questo metodo di purificazione della proteina. La rimozione di His6 tag dal costrutto E-PRD è essenziale per gli esperimenti di MST come la proteina di VimRod con l'etichetta utilizzando un colorante di associazione di tag His6 e qualsiasi E-PRD mantenendo il relativo tag di His6 possono competere per il legame della tintura. La seconda colonna IMAC dopo la scissione del tag con proteasi TEV rimuove la proteasi TEV, il tag spaccato e qualsiasi ApoAlert His6-E-PRD che è rimasto. Il passaggio finale di lucidatura della purificazione è la cromatografia di esclusione di formato. Pur essendo entrambe proteine di dimensioni simili, il VimRod eluisce dalla colonna a un 51 mL mentre il picco di eluizione E-PRD è centrato a 72 mL dove ci si aspetterebbe un monomero della proteina di queste dimensioni. L'apparente aumento di dimensioni del VimRod è probabilmente dovuto la sue caratteristiche come una lunga asta filamentosa a forma di proteina come analiticamente ultracentrifuga gli esperimenti hanno dimostrato che il VimRod è stato monomerico4. Rese più basse della proteina sono ottenute dalle colture coltivate in M9 rispetto a quelli da brodo ricco a causa di una quantità inferiore di cellule si producono in media minimi. La crescita iniziale di grandi colture starter per le preparazioni di M9 in TB permette il miglioramento delle rese di cella mantenendo nella misura di 15N etichettatura necessarie per gli esperimenti NMR.
15N -1H HSQC sono stati acquisiti per la wild-type e mutanti di R1914E di E-PRD in presenza o assenza di VimRod (Figura 8A-8D). Lo spettro di E-PRD in Figura 8A Mostra il numero previsto di picchi ben risolti, indicativi di una proteina correttamente piegata. In presenza di VimRod (Figura 8B) lo spettro mostra ad ampliare la vasta gamma e la scomparsa di picco, corrispondente a associazione tra E-PRD e VimRod. Questa associazione è perso dalla mutazione di R1914E come evidenziato dal confronto di Figura 8 e 8D. Piccolo cambiamento è osservata nello spettro con l'aggiunta di VimRod per il mutante di R1914E che indica una mancanza di associazione tra questo mutante E-PRD e VimRod. Le intensità di picco E-PRD in presenza/assenza di VimRod sono state confrontate e tracciate come le intensità di picco relativa in Figura 8E, che indica l'intervallo del picco ampliando nel complesso E-PRD. Il mutante di R1914E di E-PRD (non mostrato) mantenuto circa il 97% delle cime a 20% o intensità di picco più elevate in presenza di VimRod rispetto a circa il 20% per il tipo selvaggio (Figura 8E). Questo rappresenta una perdita del mutante di punto di funzione, con ulteriori mutanti avendo effetti intermedi anche essendo stato studiato4.
Per convalidare e quantificare l'associazione di analisi VimRod ed E-PRD MST utilizzando His6-VimRod marcati con colorante fluorescente rosso-tris-NTA come destinazione mista con la diminuzione della concentrazione del ligando E-PRD da 1,28 mM a 39,1 nM sono stati effettuati. Tre titolazioni di associazione sono stati effettuati e i risultati sono una media e illustrati nella Figura 9. I dati erano idonei con un modello standard di one-sito ligando e dato KD di 25,7 ± 2.1 μM. Valutazione dell'associazione tra VimRod ed E-PRD di risonanza plasmonica di superficie ha dato un simile valore KD 19.1 ± 1.3 μM4.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58537/58537fig1.jpg"> Figura 1: Screen Capture del Setup dell'esperimento NMR. La finestra mostrata viene utilizzata per impostare un esperimento standard per raccogliere un dataset HSQC. Esperimento i parametri vengono letti nella adiacente all'esperimento. L'esperimento ZGPR mostrato viene scelto come un esperimento iniziale per caricare i parametri standard e solvente protone dipendente. La finestra di titolo viene utilizzata per immettere dettagli sperimentali per scopi di conservazione. Per raccogliere lo spettro HSQC l'esperimento ZGPR viene sostituito con SFHMQC3GPPH. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58537/58537fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58537/58537fig2.jpg"> Figura 2: regolazione dei parametri sperimentali NMR. La finestra mostrata è utilizzata per l'immissione di parametri fondamentali per la sequenza di impulsi NMR al fine di ottimizzare il segnale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58537/58537fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58537/58537fig3.jpg"> Figura 3: elaborazione dei dati NMR. Parametri utilizzati per l'elaborazione di ciascuna delle due dimensioni dello spettro NMR sono indicati, con le frecce che indica quelli che solitamente sono regolati. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58537/58537fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58537/58537fig4.jpg"> Figura 4: parametri per la raccolta di picco NMR. I parametri utilizzati per la raccolta di NMR picchi nello spettro NMR trasformato vengono visualizzati con valori tipici. Regolare la gamma ppm, intensità e numero di picchi per ottimizzare gli spettri. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58537/58537fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58537/58537fig5.jpg"> Figura 5: rappresentante Peaklist con intensità. Ogni picco che viene raccolto nello spettro NMR viene dato un numero e relativo 1H e 15N chimico sposta e intensità del segnale vengono visualizzati. Questo peaklist può quindi essere utilizzato per confrontare spettri ottenuti in presenza/assenza di un partner interagente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58537/58537fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58537/58537fig6.jpg"> Figura 6: purificazione di VimRod His6-etichetta di IMAC e s. A. Il cromatogramma per l'eluizione dalla colonna IMAC Mostra un picco principale di VimRod. B. il cromatogramma per l'eluizione da colonna S Mostra un picco principale. C. SDS-PAGE delle frazioni raccolte nel corso di purificazione: standard MW con il MW indicato in kDa a sinistra del gel (M), lisato cellulare (1), IMAC flusso continuo (2), lavaggio (3), riunita eluizione (E1), riunito S eluizione (E2). Bande visibili alle più alti pesi molecolari in vicoli E1 ed E2 sono oligomeri di puro VimRod come confermato mediante western blot (dati non mostrati). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58537/58537fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58537/58537fig7.jpg"> Figura 7: purificazione del E-PRD di IMAC e s. A. SDS-PAGE della purificazione IMAC mostrando gli standard di peso molecolare con il MW indicato in kDa a sinistra del gel (M) e l'eluito dalla prima colonna IMAC (E1), TEV il clivaggio di prodotti (+ TEV) e il flusso attraverso dalla seconda colonna IMAC (FT). B. il cromatografo dalla colonna S Mostra un picco principale. C. SDS-PAGE delle norme peso molecolare (M) e le frazioni da picco S. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58537/58537fig7large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58537/58537fig8.jpg"> Figura 8: HSQC spettri di Wild-type e mutanti di R1914E di E-PRD in presenza e assenza di VimRod. Gli spettri HSQC Visualizza selvaggio-tipo E-PRD (100 µM) in 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 millimetro DTT, pH 7 nell'assenza o nella presenza di 50 µM (A) VimRod (B). Pannelli C e D sono gli spettri HSQC del mutante R1914E (100 µm) nell'assenza o nella presenza di 50 µM VimRod, rispettivamente. Nel pannello E il picco di15N relativa 1H - intensità del E-PRD con o senza associazione di VimRod vengono visualizzati come una funzione del numero di picco, che è assegnato arbitrariamente e non basato sulla posizione di sequenza. Questi valori possono essere utilizzati per definire un valore soglia di significatività per riduzione di intensità di picco con l'aggiunta di un legante. Se le assegnazioni sono disponibili, i valori significativi spesso possono essere visto eseguire il mapping a una area di associazione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58537/58537fig8large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58537/58537fig9.jpg"> Figura 9: associazione di E-PRD a VimRod. E-PRD è stata diluita in una serie di diluizioni da 1,28 mM a 39,1 nM e incubati con VimRod con etichetta prima di eseguire analisi di MST. Dati da tre saggi indipendenti sono stati combinati. I dati erano idonei a un modello KD dando KD di 25,7 μM con una fiducia KD ± 2.1 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58537/58537fig9large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Reagente</td>
			<td>Quantità</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fosfato di sodio bibasico (anidro)</td>
			<td>6,0 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fosfato di potassio monobasico (anidro)</td>
			<td>3,0 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cloruro di sodio</td>
			<td>0,5 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>H2O</td>
			<td>Fino a 950 mL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1. M9 media per l'etichettatura isotopica.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Reagente</td>
			<td>Quantità</td>
		</tr>
<tr>
<td>
15 NH4Cl</td>
			<td>1,0 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glucosio (o 13C-glucosio)</td>
			<td>2,0 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M MgSO4
</td>
			<td>2 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>50mm CaCl2
</td>
			<td>4 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>20 mg/mL della tiamina</td>
			<td>1,0 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>3 mM FeCl3
</td>
			<td>400 Μ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>Metallo Mix (tabella 3)</td>
			<td>500 Μ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>H2O</td>
			<td>Fino a 50 mL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 2. Miscela nutriente per il completamento della M9 media.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Reagente</td>
			<td>Quantità</td>
		</tr>
<tr>
<td>4 mM ZnSO4
</td>
			<td>323 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 mM MnSO4
</td>
			<td>75,5 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>4.7 mM H3BO3
</td>
			<td>145 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>0,7 mM CuSO4
</td>
			<td>55,9 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>H2O</td>
			<td>Fino a 500 mL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 3. Supplemento di mescolare metalli per arricchire la miscela nutriente di MT.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Campione</td>
			<td>tampone A1 (µ l) di 1 mM E-PRD</td>
			<td>tampone A (µ l) di 1mM VimRod</td>
			<td>Buffer di un (µ l)</td>
			<td>200 µM DSS in D2O (µ l)</td>
			<td>Tampone B2 (µ l)</td>
			<td>Totale Volume (µ l)</td>
		</tr>
<tr>
<td>E-PRD da solo</td>
			<td>50</td>
			<td>0</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
			<td>350</td>
			<td>500</td>
		</tr>
<tr>
<td>E-PRD + VimRod</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
			<td>0</td>
			<td>50</td>
			<td>350</td>
			<td>500</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">
1 Tampone a: 20 mM Tris-HCl, 1 millimetro DTT, pH 7</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">
2 Tampone b: 23 mM Tris-HCl, 1,14 mM DTT, pH 7</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 4. Preparazione del campione NMR.

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Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy NMR and Microscale Thermophoresis MST

Qui, presentiamo un protocollo per la produzione e purificazione di proteine che sono etichettati con isotopi stabili e successiva caratterizzazione delle interazioni proteina-proteina mediante spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR) e Microscala Esperimenti di Termoforesi (MST).

Interazioni di proteine globulari e filamentose di spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR) e Microscala submicronica (MST) di misura

Filamentous proteins such as vimentin provide organization within cells by providing a structural scaffold with sites that bind proteins containing plakin ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'interazione proteica, ad esempio se la proteina si lega direttamente a una molecola piccola o grande. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è un modo semplice e veloce per rilevare le interazioni dirette a livello atomico. Accendere il flusso d'aria con il comando di espulsione ej.Questo porterà il campione dal magnete. Ora, posizionare il campione all'interno di uno spinner sopra il magnete nell'apertura. Inserire con il comando ij.Attendere che il campione si stabilizza all'interno del magnete prima di procedere. Creare un nuovo set di dati utilizzando il comando edc e caricare i parametri NMR proton standard selezionando l'esperimento ZGPR. Compilare i campi NOME, numero dell'esperimento e numero di cartella dati elaborati.Selezionate il solvente nel campo Imposta solvente (Set solvent) e fate clic su Esegui getprosol per leggere i parametri standard dipendenti da probehead e solvent. Bloccare il campione sul solvente deuterato utilizzando il comando lock e attendere che sia terminato di spazzare e ottenere il blocco. Correggere la frequenza di risonanza del magnete sintonizzando il campione utilizzando il comando di sintonizzazione automatica atma.Monitora la curva di oscillazione fino al completamento dell'accordatura automatica. Shim il campo magnetico usando topshim. Lo shimming si regola al campo magnetico.Ottenere uniformità intorno al campione. È buona pratica archiviarlo in valori con il comando wsh e leggerli usando rsh prima di topshim, se si utilizzano campioni uguali o simili. Ora regola il guadagno del ricevitore con il comando rga per ottenere il massimo rapporto segnale/rumore.Posizionare il centro dello spettro sull'offset di risonanza dell'acqua e impostare l'impulso protonico di 90 gradi ad alta potenza utilizzando calibo1p1. Raccogli lo spettro protonico usando il comando e il processo zero go zg con efp. Ciò include la moltiplicazione esponenziale, il decadimento a induzione libera che incorpora l'allargamento della linea, la trasformazione di Fourier della FID e la pk per applicare la correzione di fase.Applicare l'apk di correzione automatica della fase e l'assale di correzione automatica della linea di base utilizzando l'opzione polinomiale senza integrazione. Creare un nuovo set di dati per l'esperimento SOFAST HMBC selezionando SFHMQC3GPPH nell'esperimento. Copiare il P1 e l'O1 ottimizzati dallo spettro protonico e popolare gli impulsi dipendenti P1 usando il comando getprosol 1H p1 plw1, dove p1 è il valore P1 ottimizzato, e plw1 è il livello di potenza per P1. Ora, ottimizza la costante CNST54 per impostare l'offset per lo spostamento chimico dell'ammide.Ottimizzare anche CNST55 per definire la larghezza di banda al fine di comprendere le regioni spettrali di interesse, consentendo di ottimizzare il guadagno del ricevitore. Per selezionare questi parametri, estrarre il primo FID dallo spettro bidimensionale e cercare il segnale osservato per definirli. Inoltre, variare il ritardo di rilassamento, il numero di scansioni e le scansioni fittizie per ottenere una sensibilità del segnale accettabile con i comandi gs, che consente di andare e scansionare per monitorare la qualità dei dati in tempo reale.Infine, registrare gli spettri usando Zero Go zg. Impostate i parametri di elaborazione sulla dimensione delle dimensioni F2 diretta e F1 indiretta dello spettro, con previsione lineare opzionale nella dimensione indiretta. Selezionate QSINE come funzione Finestra (Window) e immettete uno spostamento a campana seno di due per elaborare lo spettro bidimensionale.Immettete il comando xfb per elaborare i dati in entrambe le direzioni con funzione finestra e trasformazione di Fourier. Utilizzare il comando apk2d per eseguire la correzione automatica della fase in entrambe le direzioni. Correggere la linea di base con la funzione di correzione automatica della linea di base abs2 per i dati 2D.Questo applica una funzione polinomiale tra i valori ppm definiti nei parametri di elaborazione e produrrà uno spettro 2D per ulteriori analisi. Se si prevede di eseguire l'elaborazione seriale per il confronto dei dati di interazione con un'altra molecola, memorizzare i parametri di elaborazione con il comando wpar e richiamarli con rpar. Immettere il comando pp per iniziare il processo di prelievo di picco.Definire l'intervallo ppm, l'intensità minima e il numero massimo di picchi in base ai picchi previsti. Quindi fare clic su OK. Verificare i risultati mediante ispezione visiva. Se necessario, eseguire di nuovo il processo fino a quando i risultati non sono soddisfacenti in base alla qualità degli spettri.Generare un elenco di picco con il comando pp. Questo elenco di picco contiene informazioni sull'altezza dei dati e sull'intensità del picco per impostazione predefinita. L'elenco di picco può essere esportato negli spettro successivi e può essere letto da altri programmi.Ora osservate gli spettri HSQC proteici per i cambiamenti nelle intensità di picco o il movimento nei cambiamenti chimici che indicano l'interazione con un'altra molecola. Se la molecola interagente è grande, aspettatevi riduzioni delle intensità di picco insieme alla scomparsa di alcuni picchi. Importare l'elenco di picco nel set di dati successivo facendo clic sulla scheda picchi e selezionando Importa con un clic con il pulsante destro del mouse nella finestra picchi.Visualizza i picchi sullo spettro e, se necessario, spostali in nuove posizioni. Fare clic sulle intensità di ripristino per la tabella completa per generare un elenco di picco per lo spettro che include intensità. Questo elenco di picco riporterà le informazioni sulla posizione dall'elenco di picco memorizzato.Esportare gli elenchi di picco da set di dati diversi in un foglio di calcolo o in un altro programma matematico per l'analisi selezionando la funzione Esporta. Calcola la variazione delle intensità di picco con l'intensità del picco della funzione nello spettro complesso, l'intensità di picco nello spettro proteico per ogni picco. I valori possono essere convertiti in variazione percentuale per moltiplicazione per 100.Si noti che anche i volumi di picco sono utili, anche se le intensità di picco sono più facili da misurare per i picchi posizionati uno vicino all'altro, come di solito accade per le proteine con un'alta densità di picchi relativamente ampi. Gli N15HSQC sono stati acquisiti per il tipo selvaggio E-PRD, così come il mutante R1914E, in presenza o assenza di VimRod. Lo spettro del tipo selvaggio E-PRD mostra il numero previsto di picchi ben risolti, indicativo di una proteina correttamente piegata.In presenza di VimRod, lo spettro mostra un ampio allargamento della linea e la massima scomparsa, corrispondente all'associazione tra E-PRD e VimRod. Poco cambiamento si osserva tra lo spettro del mutante R1914E da solo e l'aggiunta di VimRod, indicando una mancanza di legame con questo mutante E-PRD. Qui le intensità di picco E-PRD in presenza e assenza di VimRod sono state confrontate e tracciate come intensità di picco relative per indicare la gamma di picco che si allarga nel complesso E-PRD.Per convalidare e quantificare il legame di VimRod ed E-PRD, l'analisi MST utilizzando His6-VimRod etichettato con colorante FLUORESCENTE RED-tris-NTA come bersaglio, è stata eseguita utilizzando concentrazioni decrescenti del ligando E-PRD. I dati erano adatti a un modello standard di legatura del ligando a un sito e davano un KD di 25,7 più o meno 2,1 micromolare. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di utilizzare condizioni di acquisizione ed elaborazione identiche.avrà difficoltà a causa dell'accesso a campioni proteici etichettati isotopici per la raccolta di spettri NMR. Le implicazioni di questa tecnica si estendono verso la terapia del cancro, dell'infezione o delle malattie neurodegenerative perché comportano la formazione di interazioni proteiche compromesse nella malattia.

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Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR) and Microscale Thermophoresis (MST)

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Nucleare spettroscopia di risonanza magnetica per l&#39;identificazione di più di fosforilazioni intrinsecamente disordinati proteine

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