Name: measuring interactions of globular and filamentous proteins by nuclear magnetic resonance spectroscopy (nmr) and microscale thermophoresis (mst)
Uploaded: 2018-11-02T14:45:00
Duration: 10 min 28 s
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このプロジェクトは、アルバータ州プリオン研究所、キャンパス アルバータ州イノベーション プログラム (RCP-12-002 C) レベル RGPIN-2018-04994 に支えられてきた M.O とゲノムのカナダのためのカナダの財団にアルバータ州革新バイオ ソリューション (201600018) を受賞/革新のメタボロミクス技術革新センター (TMIC) と NANUC に授与された補助金。

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著者は利益相反を開示ないです。

2 D の15N 分解 NMR 実験は最も広く使用されているの一つか 2 つの分子を表示するメソッドのやり取り。両方のパートナーの信号ソリューション状態で滴定実験を通して継続的に監視することができる最も情報豊富な方法です。通常質的に大きな複合体の場合、メソッドも使える有利な例の結合親和性を測定する NMR 信号を高分解能スペクトルで追跡できます。割り当ては、便利に行うことができます、場所など 20 kDa のサイズの下で多くの蛋白質の場合結合部位もマップできます。MST など補完的な試金ソリューションでは、相互作用に関する定量的な情報を提供、ラベルのない状態のより少ない蛋白質を必要とします。変異バインド データの比較は NMR 線によって証明される相互作用が本物であることを確認するためのコントロール、たとえば、集計や粘度の変化のない成果物を提供するために役立ちます。
蛋白質の表現
労働集約的なタンパク質を合成する量が減ります式プロセスの合理化します。この最適化プロセスの一部には、組換えタンパク質発現のためのエシェリヒア属大腸菌の適切な株の識別が含まれます。使用するベクターの性質などの要素に依存するひずみの好みより具体的には、組換え蛋白質の究極の安定性を表明7。危険性内因性大腸菌による異種タンパク質の分解のプロテアーゼをプロテアーゼの使用によって減らすことが欠損大腸菌BL21 系統など。珍しいコドンを含む遺伝子、BL21 CodonPlus (DE3) RIPL のひずみは好まれるかもしれない。この株は、アルギニン、イソロイシン、プロリン、ロイシンのまれなコドン Trna の内因性コピーと BL21 系統のプロテアーゼ欠乏性質を兼ね備えています。また、商業ソースからコドン最適化構築の発注によって過剰発現を危険にさらすことができるまれのコドンを避けることができます。組換え遺伝子の発現はエシェリヒア属大腸菌の多くの菌株、式7の中に特定の問題の回避に最適各。この研究の場合は、標準プロテアーゼ欠損株 BL21(DE3) はそれに続く浄化および分析のため可溶性タンパク質の十分な量を生産しました。
蛋白質の浄化
特定の蛋白質の浄化のプロトコルは各蛋白質のまま安定しており、温度、塩分濃度、pH などさまざまな条件の下で溶けるという意味でユニークな多くの場合。アフィニ ティー ・ クロマトグラフィーによって精製の全体的な効果はまた精製過程など様々 なステップでイミダゾール溶出種の濃度に敏感。今回、IMAC の重要なバッファー条件は E-PRD の pH と、VimRod のイミダゾールの集中だった。7.5 の pH は、IMAC のコラムから次の初期溶出 E PRD の沈殿物を避けるために必要でした。VimRod の IMAC 浄化、最終的な溶出画分の純度で大幅な改善をして発見されたカラム洗浄ステップの間に 30 から 50 mm のイミダゾールの濃度を増加させます。溶出のステップのまた最終の溶出の収量を改善するために発見された 250 から 350 mm のイミダゾールの濃度を増加させます。250 mM のイミダゾールを用いたタンパク質を溶出する初期の試みは、列 (データは示されていない) の最終的な 1 M イミダゾール ストリップによって明らかにされた VimRod の不完全な溶出をもたらした。溶出用 350 mm のイミダゾールの集中の増加は、列にバインドされている蛋白質のすべてを回復するのに十分だった。同時にバッファー交換を実行中蛋白質の浄化のための研磨段階として機能するため、S は二重目的に役立つことができます。His6 タグ付きタンパク質を溶出に使用されるイミダゾールを削除しますので、バッファー交換はその後結合解析のための重要なステップです。また、塩分濃度や特定の下流のテクニックやアッセイの有効性に影響を与える可能性があります pH などの条件を変更する機会として機能します。タンパク質の安定なタンパク質を必要とするそれらのために特に下流の試金のための最適なバッファーを識別するために温度変化 (PTS) を使用できますに長時間室温8,9時。
結合解析
結果比較されます限り、固定された蛋白質を使用もできますが、正確なバインディング アッセイには作りたてのタンパク質が欠かせません。塩、pH 依存の方法でビメンチン multimerize など糸状のタンパク質、したがって解決条件を最適化する必要性とオリゴマーの状態推定秒10、など11、動的光散乱法による12または分析超遠心法13,14,15。NMR 分光法による原子分解能で小さな蛋白質のリガンド相互作用を測定に適しています。ただし、大きい分子と相互作用タンパク質と遅いタンブリングのすさまじい、この結果バインディングを確認できますが、それは必ずしも、信号の損失、許可の結合部位も少なくともの割り当てに必要となるマッピング バックボーン共鳴。このシナリオでは、NMR 実験に相互作用部位の同定はできません。それ故にサイトは、突然変異誘発は、連結に必要な重要な残基を識別するために適用を指示しました。したがって、このような突然変異体には信号の損失は起きません。このプロトコルでは 1914 位置置換変異フォームは VimRod の存在下でピーク強度を保持し、したがって E PRD と VimRod の相互作用の中断を確認します。バックボーンと側鎖の共鳴の割り当ては、無料 E-PRD の構造は x 線結晶構造解析4で解決されている、特にとしてこのアプローチに値を追加します。NMR の将来のアプリケーションより大きな分子間の複雑な相互作用の特性が含まれます、超高い分野磁石や13など他の観察可能なグループの使用の恩恵 C 標識と記者としてのみメチル グループ。
MST には、結合相互作用16の勉強のための利点の数があります。結合パートナーがソリューションで自由でない固定化です。サンプルの質の分析は品質管理報告の集計、毛細血管や標的分子の不十分な蛍光標識への吸着とソフトウェアに組み込まれます。ターゲットの少量が用いられます、ラベル付けされたターゲットの濃度は通常 10-20 μ L のボリューム/反応で 20 ~ 50 nM の間。このプロトコルは、特徴付けられる弱い結合相互作用を許可する滴定で実現できるリガンドの濃度を最大化する、非常に小さな反応ボリューム (10 μ L) を使用します。これは、正確なピペッティングおよびまだ十分に混合しながら気泡を導入することを避けるために注意が必要となります。適切な混合シリアル希薄のセットに沿って、一貫性のある正確な蛍光測定が重要です。MST の実験でトゥイーン 20 の量が標準的な泡を作成、混合を強化する傾向を下げるために 0.015% 0.05% から減少しました。
赤トリス NTA 染料に彼を持つタンパク質を蛍光ラベルを簡単迅速かつ便利な方法が用意されていますタグ。ラベルがわずか 30 分で効果的に完了し、色素除去する必要はありません、非常にタイトです。リガンド結合特性を変えるかもしれない蛋白質のアミノ酸残基には、変更は行われません。注意点は、His6 タグをラベルを付けるだけのタンパク質が必要です。これは配位子蛋白質や E-PRD、タグと 2 番目の IMAC 列ステップで分解されていない E PRD の除去からタグの胸の谷間が必要です。可能であれば、ligand 蛋白質は彼の使用せず準備されるべきタグです。また、リジン残基またはチオールのシステイン残基に結合する結合アミンでの蛍光と共有蛋白質を分類する可能性があります。ただし、リジンまたはシステイン残基に依存する静電または極性結合の相互作用に影響を与える可能性があります、fluorophore の共有結合以来このようなシステムを使用して注意が必要があります。結合 VimRod と E-PRD MST での親和性の定量化は、塩濃度に異常に敏感だった。この問題は、当初アッセイバッファーの同じバッチにターゲットとリガンドをおこしによって軽減されました。それにもかかわらず、MST 結合曲線の彩度は、VimRod の複雑な挙動に起因する 150 ミリメートル塩化ナトリウムの存在下で MST 分析を実行するときにない達成できます。KDの正確な計算を許可する 10 mm NaCl の濃度を下げた後、信頼性の高い、完全なデータが得られました。したがって、慎重に最適化ソリューションの条件と相補的な試金との比較は堅牢な結果を達成するためにお勧めします。また、特定の相互作用のための塩濃度依存性を定量化、酵素反応速度論17に蛋白質の相互作用、モニター タンパク質の折り畳み、およびプローブの化学量論的特性を定量化する MST を使用可能性があります。

タンパク質間相互作用は、細胞内で順序を作成する分子機械の形成を許可します。個々 の相互作用は弱いことが多いが、通常協調と動的に調整することができます多価錯体に貢献。敏感な試金原子分解能およびそのような複雑な相互作用についての定量的な情報を提供するメカニズムを推測して薬のような分子などの介入を設計が必要です。NMR 分光学は蛋白質の相互作用の完全な情報を取得するための効率的な方法ですおよびまた含め弱1を結合する配位子の高速スクリーニングのために使用されます。使用される NMR 法は、タンパク質の観察や配位子を観察するに分類できます。本稿では、前者のアプローチは比較的小さい (通常 20 kDa) の下でタンパク質をラベルの安定同位元素のスペクトルを取得し、ラベルのない配位子は滴定を使用します。これにより、ラベル付きの残基は有利な例で、マップする相互作用に関与します。一度複雑なフォーム、ケミカル シフトの変化として表れる相互作用する残基の化学的環境とその NMR 信号の形状に変更があります。このような変化の範囲の相互作用でこれらのグループの関与の度合いと相関します。化学シフト摂動 (Csp) は、一連の不在とリガンドのさまざまな量の存在で収集された蛋白質の NMR スペクトルを比較することによって測定できます。大きな配位子や複雑な相互作用は、相互作用を推測するピーク形状や強度の変化を測定できます。
リガンド相互作用を検出するために使用される最も一般的な 2 D の実験は、 15N 25pxn-1 異核単一量子相関 (HSQC) 実験2です。1 つのタンパク質が15N、エシェリヒア属大腸菌細菌培養15N 濃縮メディアにし、バージョンのタグ付きの親和性として表現することによって達成される通常均一にラベルを付けることが必要です。バインディングは、明白な滴定の中に収集された HSQC スペクトルを重ね合せを明らかに複雑な形成に関わる残基のサブセットのピークの変化です。無料とリガンドで飽和状態の信号が 1 つの人口の平均ピークに崩壊高速為替制度の相互作用が発生します。また、状態の間遅い交換した場合では、両方の信号は彼らの相対的な量を表す積分で観察されます。NMR ラインシェイプ解析は、いくつかのケースで結合親和性を推定する使用できますが、MST などの方法も便利な証明しているし、本物の相互作用のクロス検証を提供します。
例は、デスモゾーム内で見つかった 2 つの蛋白質です。彼らは接合細胞表面と細胞骨格との間を仲介し、細胞接着装置と皮膚の整合性を維持するために中間径フィラメントの多価の相互作用を仲介して心臓組織との耐えるせん断力。Desmoplakin やビメンチンなど特異的蛋白質が変異や細胞接合の不安定化につながる自己抗体によって侵害され、そのための相互作用は非常に重要の3疾患が起因できます。デスモソーム タンパク質によるリガンド結合の構造基盤は、MST での相互作用を定量化することができますしながら NMR 分光法による特徴付けられます。ヘミデスモソーム斑リピート ドメイン (PRDs) 多くの場合提供する基本的な溝、タンデム セットとして存在しているとビメンチンのヘリカルによって提供される酸性表面を介して相互作用する中間径フィラメント間の相互作用を特徴付けるためのメソッド本4をバンドルします。これらの複合体は、デスモゾーム ティッシュを通して放射する接着のネットワークを形成、隣接する細胞に接続する細胞の細胞骨格の中間径フィラメントの停泊細胞膜で形成されています。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Monolith NT.115, includes control and analysis software</td>
			<td>NanoTemper Technologies</td>
			<td>MO-G008</td>
			<td>Instrument for microscal thermophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His-Tag Labeling Kit RED-Tris-NTA</td>
			<td>NanoTemper Technologies</td>
			<td>MO-L008</td>
			<td>RED-tris-NTA dye for MST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard capillaries</td>
			<td>NanoTemper Technologies</td>
			<td>MO-K022</td>
			<td>capillaries for MST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HisTrap HP, 5 mL</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17524801</td>
			<td>IMAC column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HisPur Ni-NTA resin, 100 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88222</td>
			<td>IMAC resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiLoad 16/600 Superdex 75 pg</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28989333</td>
			<td>SEC column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEV protease</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T4455</td>
			<td>cleavage of his tag from E-PRD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21(DE3) Competent E. coli</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>C2527H</td>
			<td>cells for protein expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete Protease Inhibitor Cocktail Tablets EDTA-Free</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>11873580001</td>
			<td>protease inhibitors for protein purification by IMAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP, Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4706</td>
			<td>reducing agent for protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents (HEPES, NaCl, etc)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>various</td>
			<td>Preparation of media and buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride (15N, 99%)</td>
			<td>Cambridge Isotope Laboratories</td>
			<td>NLM-467</td>
			<td>isotope labelling for NMR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D2O, Deuterium Oxide (D, 99.8%)</td>
			<td>Cambridge Isotope Laboratories</td>
			<td>DLM-2259</td>
			<td>NMR sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSS, Sodium 2,2-dimethyl-2-silapentane-5-sulfonate-D6 (D,98%)</td>
			<td>Cambridge Isotope Laboratories</td>
			<td>DLM-8206</td>
			<td>reference for NMR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision 5 mm NMR Tubes, 7&#8221; long</td>
			<td>SJM/Deuterotubes</td>
			<td>BOROECO-5-7</td>
			<td>NMR tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMR spectrometer (14.1 Tesla)</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>acquisition of NMR data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCI 5mm z-PFG cryogenic probe</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>acquisition of NMR data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bruker TopSpin 4.0.1</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>processing of NMR data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MO.Control</td>
			<td>NanoTemper Technologies</td>
			<td></td>
			<td>included with Monlith NT.115</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MO.Affinity Analysis</td>
			<td>NanoTemper Technologies</td>
			<td></td>
			<td>included with Monlith NT.115</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring interactions of globular and filamentous proteins by nuclear magnetic resonance spectroscopy (nmr) and microscale thermophoresis (mst)

ビメンチンなどの糸状のタンパク質は、ヘミデスモソーム斑を含んでいる蛋白質の結合サイトと構造の足場を提供することで細胞内組織の繰り返しを提供します。ここでは、検出し、このような相互作用を測定するためのプロトコルは、envoplakin の球状ヘミデスモソーム斑リピート ドメインおよびビメンチンのヘリカル コイルを使用して説明します。これは相互作用の親和性の測定、タンパク質結合ビメンチン (または同じような糸状の蛋白質) かどうかを決定するための基礎を提供します。興味の球状蛋白質は15N 標識し、ビメンチン タンパク質溶液で滴定します。二次元 NMR スペクトルは、化学シフトやピーク形状の変化を観察することによって相互作用を検出してビメンチン第四紀構造に影響を及ぼす塩のレベルを含むソリューションの条件の影響を明らかにする取得されます。興味の蛋白質のリガンドを糸状に、結合の相互作用は浄化された蛋白質を使用して MST によって定量化されます。アプローチは興味の蛋白質が、フィラメントをバインドするかどうかを決定しての相互作用に影響を与える突然変異やソリューションの条件などの変化を評価するための簡単な方法です。

人間 envoplakin 遺伝子と VimRod ドメイン (99-249 pET21a にクローン残基) の E-PRD ドメイン (pProEX HTC に複製残留 1822-2014 年) 人間の vimentin の4 His6 タグで表現され、精製します。図 6と図 7は、VimRod の純度のレベルを示す (18.8 kDa) と E PRD (21.8 kDa) は蛋白質の浄化のこの方法から得られます。E PRD コンストラクトのタグは VimRod 蛋白質は His6 タグ結合色素を使用してラベル付けし、染料の結合、His6 タグを保持すべての E-PRD を奪い合います MST 実験に不可欠な His6 の除去。TEV プロテアーゼ、劈開のタグと、分解されていない His6-E-PRD 残った TEV プロテアーゼとタグの胸の谷間の後 2 番目の IMAC のコラムを削除します。浄化の最終的な研磨段階は、サイズ排除クロマトグラフィーです。にもかかわらず、両方蛋白質同じようなサイズの E PRD 溶出ピークはこのサイズのタンパク質モノマーが期待される 72 mL を中心としながら、VimRod を 51 mL の列で示してください。VimRod のサイズの明らかな増加は可能性が高いために、糸状の長い棒とその特性形蛋白質の解析的遠心実験実証単量体4を VimRod にいた。タンパク質の低い利回りは、M9 最小媒体で生産されて細胞の低い量のため豊富な流体培養基からのそれらより栽培文化から取得されます。TB で M9 の準備のための大きいスターター文化の初期生育では、 15N NMR 実験に必要なラベルの範囲を維持しながら細胞収率の改善をことができます。
15n-1H HSQCs に E PRD R1914E 変異体と野生型の VimRod (図 8 a-8 D) の有無で買収されました。図 8 aに E PRD のスペクトルは、うまく解決ピーク、適切に折り畳まれたタンパク質を示す数の期待値を示しています。VimRod (図 8 b) 存在下では、スペクトルは、広範なラインを広げると E-PRD と VimRod 間のバインディングに対応するピーク消失を示しています。このバインディングは、図 8 と 8 Dの比較では明らかに R1914E の突然変異によって失われます。小さな変更は、この突然変異体 E PRD と VimRod 間のバインドの欠如を示す R1914E 変異体 VimRod の添加時にスペクトルで観察されます。VimRod の有無で E PRD のピーク強度を比較し、図 8 e、ピーク拡がり E PRD 複合体の範囲を示す相対ピーク強度としてプロットされます。(図示せず) E PRD R1914E 変異株は野生型 (図 8 e) の約 20% に比べると VimRod の存在下で 20% またはより高いピーク強度のピークの約 97% を保持しました。研究4であって機能点変異体、また中間の効果を持っている追加の突然変異体の損失を表します。
39.1 まで 1.28 mM から E PRD リガンドの濃度を減少させると混合を検証し、ターゲットとして赤トリス NTA 色素の付いた His6 VimRod を使用して VimRod と E-PRD MST 分析のバインディングを量的に nM を行った。3 つのバインディングの滴定を行い、結果は平均、図 9に示します。データは 1 サイト リガンド結合の標準モデルとピッタリでした、25.7 ± 2.1 μ M の KDを与えた。表面プラズモン共鳴による VimRod と E-PRD の間結合の評価は、19.1 ± 1.3 μ m 帯4のような KD値を与えた。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58537/58537fig1.jpg"> 図 1: NMR 実験のセットアップのスクリーン キャプチャします。HSQC のデータセットを収集するために標準的な実験を設定するウィンドウが表示されますが使用されます。実験パラメーターが読み込まれる実験に隣接します。示されている ZGPR の実験は、標準および溶媒依存陽子パラメーターを読み込む初期実験として選択されます。タイトル ウィンドウを使用して、記録保持の目的のための実験の詳細を入力します。HSQC スペクトルを収集するには、ZGPR の実験は SFHMQC3GPPH に置き換えられます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58537/58537fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58537/58537fig2.jpg"> 図 2: NMR 実験パラメーターを調整します。ウィンドウが表示されますは、NMR のパルス シーケンスの基本パラメーターを入力するため信号を最適化するために使用されます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58537/58537fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58537/58537fig3.jpg"> 図 3: NMR データ処理します。通常調整されるそれらを表す矢印を持つ各 NMR スペクトルの 2 つのディメンションを処理するために使用されるパラメーターが表示されます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58537/58537fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58537/58537fig4.jpg"> 図 4: NMR ピーク選択するためのパラメーターです。加工の NMR スペクトルで NMR ピークを拾うために使用パラメーターは、典型的な値で表示されます。Ppm の範囲、強度およびスペクトルを最適化するためにピークの数を調整します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58537/58537fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58537/58537fig5.jpg"> 図 5: 代表実測強度と。数値、およびその1H NMR スペクトルで選んだそれぞれのピークがあると15N 化学シフト、信号強度が表示されます。この実測は、相互作用のパートナーの有無で得られたスペクトルを比較する使用できます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58537/58537fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58537/58537fig6.jpg"> 図 6: IMAC と s. A. His6 タグ VimRod の精製IMAC のコラムからの溶出のクロマト グラムは、VimRod の 1 つの主要なピークを示しています。B. S カラムからの溶出のクロマト グラムは、1 つの主要なピークを示しています。浄化の過程で収集した分数の C. SDS-PAGE: プールのゲル (M) 細胞ライセート (1)、IMAC の流れを通して (2)、洗浄 (3)、プールされた溶出 (E1)、左に kDa S 溶出 (E2) で MW と MW 基準が示されました。E1 と E2 のレーンで高い分子量で目に見えるバンドは、西部のしみ (データは示されていない) によって確定した純粋な VimRod のオリゴマーです。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58537/58537fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58537/58537fig7.jpg"> 図 7: IMAC と s. A. E PRD の精製MW に分子量の基準を示す IMAC 浄化の SDS ページは、最初 IMAC 列 (E1)、TEV 胸の谷間製品 (+ TEV) から kDa のゲル (M) と溶出液の左側に示されている、2 番目の IMAC のコラム (フィート) から流れる。B. S 列からクロマト グラフでは、1 つの主要なピークを示しています。C. SDS-PAGE 分子量規格 (M) の S のピークからの分数。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58537/58537fig7large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58537/58537fig8.jpg"> 図 8: 野生型および E-PRD 存在下での R1914E 変異体と VimRod の欠如の HSQC スペクトル。HSQC スペクトル表示野生型 E PRD (100 μ M) で 20 mM のトリス-HCl、150 mM の NaCl、1 mM DTT、pH 7 (A) 有無 50 μ M の VimRod (B)。C と D のパネル 50 μ M の有無が HSQC スペクトル R1914E 変異体 (100 μ m) の VimRod、それぞれ。パネル E 相対1H-15N ピークの強度 E PRD VimRod バインディングの有無は任意に割り当てられた、シーケンスの位置に基づいていないピーク数の関数として表示されます。これらの値は、配位子の添加によってピーク強度低減の意義カットオフを定義する使用できます。割り当てが利用可能な場合バインド領域にマップする重要な値をよく見かけることができます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58537/58537fig8large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58537/58537fig9.jpg"> 図 9: VimRod E-珠江デルタのバインドします。E PRD は 39.1 まで 1.28 mM から 2 倍希釈のシリーズで希釈した nM とラベル付き VimRod と MST 分析を実行する前に。3 つの独立した測定からのデータを結合しました。データは、μ m ± 2.1 KD自信を持って 25.7 μ M の KDを与える KDモデルにピッタリだった。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58537/58537fig9large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>試薬</td>
			<td>数量</td>
		</tr>
<tr>
<td>二塩基性リン酸ナトリウム (無水)</td>
			<td>6.0 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>リン酸-カリウム (無水)</td>
			<td>3.0 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>塩化ナトリウム</td>
			<td>0.5 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>H2O</td>
			<td>950 mL</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1。M9 媒体を同位体の分類のため。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>試薬</td>
			<td>数量</td>
		</tr>
<tr>
<td>
15NH4Cl</td>
			<td>1.0 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>グルコース (または13C グルコース)</td>
			<td>2.0 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M MgSO4
</td>
			<td>2 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>50 mM CaCl2
</td>
			<td>4 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>20 mg/mL チアミン</td>
			<td>1.0 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>3 mM した FeCl3
</td>
			<td>400 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>金属のミックス (表 3)</td>
			<td>500 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>H2O</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr>
</tbody></table>表 2。栄養補充の M9 媒体ミックス。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>試薬</td>
			<td>数量</td>
		</tr>
<tr>
<td>4 mM ZnSO4
</td>
			<td>323 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 mM MnSO4
</td>
			<td>75.5 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>4.7 mM H3ボー3
</td>
			<td>145 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>0.7 mM CuSO4
</td>
			<td>55.9 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>H2O</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
</tbody></table>表 3。メタル ミックス MT 栄養組合せを豊かにするサプリメント。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>サンプル</td>
			<td>1 mM E PRD バッファー A1 (μ L)</td>
			<td>1 mM VimRod バッファー A (μ L)</td>
			<td>バッファー (μ L)</td>
			<td>200 μ M DSS は D2O (μ L)</td>
			<td>バッファー B2 (μ L)</td>
			<td>合計量 (μ L)</td>
		</tr>
<tr>
<td>E-PRD だけで</td>
			<td>50</td>
			<td>0</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
			<td>350</td>
			<td>500</td>
		</tr>
<tr>
<td>E PRD + VimRod</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
			<td>0</td>
			<td>50</td>
			<td>350</td>
			<td>500</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">
1バッファー a: 20 mM トリス-HCl、1 mM DTT、pH 7</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">
2バッファー b: 23 mM トリス-HCl、1.14 mM DTT、pH 7</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>表 4。NMR サンプル準備。

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Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy NMR and Microscale Thermophoresis MST

ここで、安定同位体と核磁気共鳴 (NMR) 分光法とマイクロ スケールを用いたタンパク質間相互作用の後の評価と生産のラベルが付いている蛋白質の浄化のためのプロトコルを紹介します。働く (MST) 実験。

核磁気共鳴分光法 (NMR) とマイクロ働く (MST) による球状と糸状のタンパク質の相互作用を測定

Filamentous proteins such as vimentin provide organization within cells by providing a structural scaffold with sites that bind proteins containing plakin ...

この方法は、タンパク質が小さな分子や大きな分子に直接結合するかどうかなど、タンパク質相互作用分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、原子レベルで直接相互作用を検出する簡単かつ迅速な方法です。エジック コマンド ej でエアー フローをオンにします。これにより、磁石からサンプルが上がります。次に、開口部の磁石の上にスピナー内にサンプルを配置します。ij コマンドを使用して挿入します。サンプルが磁石の中に落ち着くまで待ってから、先に進みます。edc コマンドを使用して新しいデータセットを作成し、実験 ZGPR を選択して標準の陽子 NMR パラメータを読み込みます。NAME、実験番号、および処理済みデータ フォルダ番号のフィールドを入力します。[溶媒の設定]フィールドで溶媒を選択し、getprosol実行をクリックして、標準のプローブヘッドおよび溶媒依存パラメータを読み取ります。lockコマンドを使用して、サンプルを重水素化された溶媒にロックし、スイープが完了し、ロックを達成するまで待ちます。自動チューニングコマンド atma を使用してサンプルをチューニングすることにより、磁石の共振周波数を補正します。自動チューニングが完了するまで、ぐらつきカーブを監視します。トップシムを使用して磁場をシム。シムミングは磁場を調整します。サンプルの周囲の均一性を達成する。同じまたは類似のサンプルを使用する場合は、これをコマンド wsh で値に格納し、topshim の前に rsh を使用して読み取ることをお勧めします。これで、最大信号対ノイズ比を達成するために、rgaコマンドで受信機のゲインを調整します。スペクトルの中心を水共振オフセットに置き、calibo1p1を用いて90度のプロトンパルスを高出力に設定します。ゼロgo zgコマンドを使用してプロトンスペクトルを収集し、efpで処理します。これには、指数乗算、ラインの広がり、FIDのフーリエ変換、位相補正を適用するpkを組み込んだ自由誘導減衰が含まれます。統合オプションを使用して、自動位相補正 apk と自動ベースライン補正 absn を適用します。実験で SFHMQC3GPPH を選択して、SOFAST HMBC 実験用の新しいデータセットを作成します。最適化された P1 と O1 をプロトンスペクトルからコピーし、p1 が最適化された P1 値であるコマンド getprosol 1H p1 plw1 を使用して P1 に依存するパルスを設定します。ここで、CNST54定数を最適化して、アミド化学シフトのオフセットを設定します。また、CNST55を最適化して、対象のスペクトル領域を包含するために帯域幅を定義し、受信機のゲインを最適化できるようにします。これらのパラメータを選択するには、2次元スペクトルから最初のFIDを抽出し、それらを定義するために観測された信号を探します。さらに、リラクゼーション遅延、スキャン数、ダミースキャンを変えて、gコマンドで許容可能な信号感度を得ることができ、ゴースキャンとスキャンでリアルタイムでデータ品質を監視できます。最後に、ゼロゴーzgを使用してスペクトルを記録します。処理パラメータをスペクトルの直接 F2 次元および間接 F1 次元のサイズに設定し、間接ディメンションでオプションの線形予測を行います。ウィンドウ関数として QSINE を選択し、2 次元スペクトルを処理するために 2 の Sine ベルシフトを入力します。ウィンドウ関数とフーリエ変換を使用して両方向のデータを処理するコマンド xfb を入力します。コマンド apk2d を使用して、両方向で自動位相補正を実行します。2D データの自動ベースライン補正関数 abs2 を使用してベースラインを修正します。これにより、処理パラメータで定義された ppm 値の間に多項式関数が適用され、さらに解析するために 2D スペクトルが生成されます。相互作用データと他の分子との比較のためにシリアル処理を実行する場合は、処理パラメータをコマンド wpar に保存し、rpar で呼び出します。コマンド pp を入力して、ピークピッキングのプロセスを開始します。予想ピークに基づいて、ppm 範囲、最小強度、最大ピーク数を定義します。次に、[OK] をクリックします。目視検査で結果を確認します。必要に応じて、スペクトルの品質に基づいて結果が満足できるまで、プロセスを再実行します。pp コマンドを使用してピーク・リストを生成します。このピーク リストには、既定でデータの高さとピーク強度の情報が含まれています。ピークリストは、後続のスペクトルにエクスポートすることができ、他のプログラムによって読み取ることができます。次に、別の分子との相互作用を示す化学シフトのピーク強度または動きの変化について、タンパク質HSQCスペクトルを観察します。相互作用分子が大きい場合は、いくつかのピークの消失と共にピーク強度の低下を期待する。ピーク・リストを次のデータ・セットにインポートするには、「ピーク」タブをクリックし、「ピーク」ウィンドウで右クリックしてインポートを選択します。スペクトル上のピークを視覚化し、必要に応じて、新しい位置にそれらをシフトします。完全なテーブルのリセット強度をクリックして、強度を含むスペクトルのピークリストを生成します。このピークリストは、保存されたピークリストの位置情報を引き継ぐ。異なるデータセットから、エクスポート関数を選択して分析用にスプレッドシートやその他の数学プログラムにピークリストをエクスポートします。関数のピーク強度の関数の複雑なスペクトル、各ピークのタンパク質スペクトルのピーク強度でピーク強度の変化を計算します。値は、100 を掛け合算することで変化率に変換できます。ピークボリュームも有用ですが、ピーク強度は互いに近くに配置されているピークを測定しやすくなりますが、通常は比較的広いピークの密度が高いタンパク質の場合に当てはまる点です。N15HSCSは、VimRodの存在または不在中に、野生型E-PRDおよびR1914E変異体のために取得された。野生型E-PRDのスペクトルは、適切に折り畳まれたタンパク質を示す、よく解決されたピークの予想数を示しています。VimRodの存在下で、スペクトルは広範囲のラインの広がりおよびピーク消失を示し、E-PRDとVimRodの間の結合に対応する。R1914E変異体のスペクトルとVimRodの添加時のスペクトル間にはほとんど変化が認められず、この変異体E-PRDへの結合の欠如を示す。ここでVimRodの存在と不在におけるE-PRDピーク強度を比較し、E-PRD複合体におけるピークの広がりの範囲を示す相対的なピーク強度としてプロットした。VimRodとE-PRDの結合を検証し定量するために、蛍光赤トリスNTA色素を標的とするHis6-VimRodを用いたMST分析を、E-PRD配位子の減少濃度を用いて実施した。データは、ワンサイトリガンド結合の標準モデルに適合し、25.7プラスマイナス2.1マイクロモルのKDを与えた。この手順を試みる際には、同一の取得条件と処理条件を使用することが重要です。NMRスペクトルの収集のための同位体標識タンパク質サンプルへのアクセスのために苦労します。この技術の影響は、癌、感染症、または神経変性疾患の治療に及ぶ。

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Removal and Replacement of Endogenous Ligands from Lipid-Bound Proteins and Allergens

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Many major allergens bind to hydrophobic lipid-like molecules, including Mus m 1, Bet v 1, Der p 2, and Fel d 1. These ligands are strongly retained and ...