Name: measuring interactions of globular and filamentous proteins by nuclear magnetic resonance spectroscopy (nmr) and microscale thermophoresis (mst)
Uploaded: 2018-11-02T14:45:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy NMR and Microscale Thermophoresis MST at JoVE.com

Bu proje NSERC RGPIN-2018-04994, kampüs Alberta yenilik programı (RCP-12-002 C) ve Alberta Prion Araştırma Enstitüsü tarafından desteklenen / Alberta yeniliklerin Bio çözümleri (201600018), layık M.O ve genom Kanada ve Kanada Vakfı Metabolomics yenilik Merkezi (TMIC) ve NANUC layık yenilik hibe.

<ol>
	<li>Vinogradova, O., Qin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR+as+a+unique+tool+in+assessment+and+complex+determination+of+weak+protein-protein+interactions.">NMR as a unique tool in assessment and complex determination of weak protein-protein interactions.</a> Topics in Current Chemistry. 326, 35-45 (2012).</li><li>McKercher, M. A., Wuttke, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR+Chemical+Shift+Mapping+of+SH2+Peptide+Interactions.">NMR Chemical Shift Mapping of SH2 Peptide Interactions.</a> Methods in Molecular Biology. 1555, 269-290 (2017).</li><li>Al-Jassar, C., Bikker, H., Overduin, M., Chidgey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+Basis+of+Desmosome-Targeted+Diseases.">Mechanistic Basis of Desmosome-Targeted Diseases.</a> Journal of Molecular Biology. 425 (21), 4006-4022 (2013).</li><li>Fogl, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+intermediate+filament+recognition+by+plakin+repeat+domains+revealed+by+envoplakin+targeting+of+vimentin.">Mechanism of intermediate filament recognition by plakin repeat domains revealed by envoplakin targeting of vimentin.</a> Nature Communications. 7, (2016).</li><li>Walker, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Protein Protocols Handbook. , (2002).</li><li>Wishart, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=1H,+13C+and+15N+chemical+shift+referencing+in+biomolecular+NMR.">1H, 13C and 15N chemical shift referencing in biomolecular NMR.</a> J. Biomol. NMR. 6, 135-140 (1995).</li><li>Casali, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+Host+Strains.">Escherichia coli Host Strains.</a> E. coli Plasmid Vectors. , 27-48 (2003).</li><li>Ericsson, U. B., Hallberg, B. M., DeTitta, G. T., Dekker, N., Nordlund, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermofluor-based+high-throughput+stability+optimization+of+proteins+for+structural+studies.">Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies.</a> Analytical Biochemistry. 357 (2), 289-298 (2006).</li><li>Kozak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+protein+samples+for+NMR+using+thermal+shift+assays.">Optimization of protein samples for NMR using thermal shift assays.</a> Journal of Biomolecular Nmr. 64, 281-289 (2016).</li><li>Burgess, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+practical+review+of+size+exclusion+chromatography:+Rules+of+thumb,+limitations,+and+troubleshooting.">A brief practical review of size exclusion chromatography: Rules of thumb, limitations, and troubleshooting.</a> Protein Expression and Purification. , (2018).</li><li>Kunji, E. R. S., Harding, M., Butler, P. J. G., Akamine, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+molecular+mass+and+dimensions+of+membrane+proteins+by+size+exclusion+chromatography.">Determination of the molecular mass and dimensions of membrane proteins by size exclusion chromatography.</a> Methods. 46 (2), 62-72 (2008).</li><li>Stetefeld, J., McKenna, S. A., Patel, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+light+scattering:+a+practical+guide+and+applications+in+biomedical+sciences.">Dynamic light scattering: a practical guide and applications in biomedical sciences.</a> Biophysical Reviews. 8 (4), 409-427 (2016).</li><li>Patel, T. R., Winzor, D. J., Scott, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+ultracentrifugation:+A+versatile+tool+for+the+characterisation+of+macromolecular+complexes+in+solution.">Analytical ultracentrifugation: A versatile tool for the characterisation of macromolecular complexes in solution.</a> Methods. 95, 55-61 (2016).</li><li>Pearson, J. Z., Cole, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+One+-+Next-Generation+AUC+Adds+a+Spectral+Dimension:+Development+of+Multiwavelength+Detectors+for+the+Analytical+Ultracentrifuge.">Chapter One - Next-Generation AUC Adds a Spectral Dimension: Development of Multiwavelength Detectors for the Analytical Ultracentrifuge.</a> Methods in Enzymology. 562, 1-26 (2015).</li><li>Gorbet, G. E., Pearson, J. Z., Demeler, A. K., C&#246;lfen, H., Demeler, B., Cole, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+Two+-+Next-Generation+AUC:+Analysis+of+Multiwavelength+Analytical+Ultracentrifugation+Data.">Chapter Two - Next-Generation AUC: Analysis of Multiwavelength Analytical Ultracentrifugation Data.</a> Methods in Enzymology. 562, 27-47 (2015).</li><li>Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-binding+assays+in+biological+liquids+using+microscale+thermophoresis.">Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis.</a> Nature Communications. 1, 100 (2010).</li><li>Jerabek-Willemsen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroScale+Thermophoresis:+Interaction+analysis+and+beyond.">MicroScale Thermophoresis: Interaction analysis and beyond.</a> Journal of Molecular Structure. 1077, 101-113 (2014).</li></ol>

Yazarlar hiçbir çıkar çatışmaları ifşa.

2D 15N çözüldü NMR deney en çok kullanılan biridir yöntemleri nasıl iki molekül göstermek için etkileşim. Çözüm devlet titrasyon deneyde boyunca sürekli olarak izlenmesi için her iki ortaklarına sinyalleri sağlar en bilgi zengini yöntemidir. Genellikle nitel rağmen büyük kompleksler söz konusu olduğunda, yöntem da olumlu durumlarda bağlama benzeşim ölçmek için nerede NMR sinyalleri-ebilmek var olmak izci yüksek çözünürlüklü spectra kullanılabilir. Boyutu 20 kDa altında birçok protein durumunda bağlayıcı siteleri da eşlenebilir gibi nerede atamaları elverişli bir konuma sahip, yapılabilir. MST gibi tamamlayıcı deneyleri çözüm etkileşimleri hakkında kantitatif bilgi sağlar ve daha az protein etiketlenmemiş Birleşik Devletleri gerektirir. Mutant bağlama veri karşılaştırma genişletmektedir NMR satırı ile kanıtlanan etkileşimleri orijinal olduğundan emin olmak için denetim ve değil eserleri, örneğin, toplama veya viskozite değişiklikleri sağlamak için kullanışlıdır.
Protein ifade
İfade işleminin verimliğini emek yoğun protein üretim miktarını azaltır. Bu en iyi duruma getirme işlemi kimlik E. coli uygun bir baskı protein rekombinant ifade içerir. Strain tercih öğeleri vektör doğa kullanımda dahil bağlıdır ve daha ayrıntılı olarak, Rekombinant protein olmanın son istikrar7dile getirdi. Risk endojen E. coli tarafından Contegra protein bozulması proteaz proteaz kullanımıyla azaltılabilir eksik E. coli BL21 zorlanma gibi. Nadir kodon içeren genler için bir yük gibi BL21-CodonPlus (DE3) RIPL tercih edilebilir. Bu zorlanma proteaz eksik doğa BL21 baskı nadir kodon tRNA arginin, isoleucine, prolin ve lösin için ek endojen kopyaları ile birleştirir. Alternatif olarak, overexpression olumsuz etkileyebilir nadir kodon kodon optimize edilmiş bir yapı ticari bir kaynaktan gelen sipariş ederek kalmayabilir. Birçok E. coli suşları rekombinant gen ekspresyonu için kullanılabilir, her bir problem tuzağa sırasında ifade7için optimize edilmiş. Bu çalışmada söz konusu olduğunda, standart proteaz eksik soy BL21(DE3) çözünür protein sonraki ve analiz için yeterli miktarda üretilen.
Protein Saflaştırma
Belirli bir protein için arıtma Protokolü kez her protein istikrarlı ve çözünür sıcaklık, tuz konsantrasyonu veya pH gibi farklı koşullar altında kalır anlamda eşsizdir. Benzeşme kromatografi ile arınma genel etkinliği de konsantrasyon eluting imidazole çeşitli adımlar gibi arıtma işlemi sırasında duyarlıdır. Bu çalışmada, kritik arabellek koşullar IMAC için E-PRD için pH ve VimRod imidazole konsantrasyona vardı. 7,5 pH yağış IMAC sütundan ilk elüsyon takip E-PRD önlemek için gerekli oldu. VimRod IMAC arıtma için 50 mM için 30 imidazole konsantrasyon sütun yıkama adım sırasında artan önemli bir gelişme son elüsyon kesirler saflık için bulundu. Elüsyon adım için 350 mm 250 imidazole konsantrasyonu artan da son elüsyon verimini artırmak için bulundu. 250 mM imidazole kullanarak protein elute ilk girişimleri bir son 1 M imidazole şerit sütun (veri gösterilmez) tarafından ortaya VimRod eksik elüsyon için yol açtı. İmidazole konsantrasyon elüsyon için 350 mm artan tüm sütuna bağlı protein kurtarmak için yeterli idi. Aynı anda arabellek Satım gerçekleştirirken protein arıtma parlatma bir adım olarak görür çünkü S çift bir amaca hizmet edebilir. Beri protein His6 öğesini elute eskiden imidazole kaldırır arabellek Satım sonraki bağlama analiz için kritik bir adımdır. Ayrıca tuz konsantrasyonu veya belirli aşağı akım teknikleri veya deneyleri etkinliğini etkileyebilir pH gibi koşulları değiştirmek için bir fırsat olarak hizmet vermektedir. Protein termal kayması (puan) için kararlı protein arayanlar için özellikle aşağı akım deneyleri, en uygun arabelleklerini tanımlamak için kullanılan oda sıcaklığında8,9bir süre uzun.
Bağlama Analizi
Taze hazırlanmış protein doğru bağlama deneyleri için kritik olsa da sonuçları karşılaştırılır sürece donmuş protein de kullanılabilir. Vimentin multimerize tuz ve pH bağımlı bir şekilde, örneğin ipliksi protein ve dolayısıyla çözüm en iyi duruma getirilmiş gerek ve sn10,11, ışık saçılma dinamik gibi bir yöntem tarafından tahmini oligomeric durumu durumu 12 ya da analitik ultrasantrifüj13,14,15. NMR spektroskopisi ligand etkileşimleri atomik çözünürlükte küçük proteinlerin ölçmek için uygundur. Ancak, bir protein daha büyük molekül ile etkileşim, yavaş tumbling ensues ve bu sinyallerin ille öyle olmasına rağmen hangi bağlama doğrulayabilirim kaybolmasına neden eşleme de atama, en az gerektirecektir siteleri Binding izin omurga rezonanslar. Bu senaryoda, NMR deneyler etkileşim site tanımlaması izin vermez. Bu nedenle site mutagenesis bağlama için gerekli kritik artıkları tanımlamak için uygulanan yönetti. Bu tür mutantlar bu nedenle sinyal kaybı gösteren değil. Bu iletişim kuralı, bir ikame pozisyonda 1914 mutant bir formla en yüksek yoğunluklarda VimRod huzurunda korur ve bu nedenle E-PRD ve VimRod arasındaki etkileşimin bozulma onaylar. Özellikle ücretsiz E-PRD yapısını x-ışını kristalografisi4tarafından çözüldü gibi omurga ve sidechain rezonanslar tayini bu yaklaşım, değer ekleyebilirsiniz. NMR gelecekteki uygulamalar büyük moleküllerin arasındaki karmaşık etkileşimler karakterizasyonu içerir ve ultra yüksek alan mıknatıslar ve gözlemlenebilir diğer grup 13gibi kullanılması yararlanacaktır C harfiyle ve trifluoro metil grubu olarak gazetecilere.
MST bağlama etkileşimleri16eğitim için avantajları vardır. Bağlama ortağız çözümde serbest ve immobilize değil. Analiz örnekleri kalite kalite kontrol toplama raporlama, adsorpsiyon kılcal veya yetersiz floresan hedef molekülünün etiketleme yazılımıyla içine inşa edilmiştir. Hedef az miktarda genellikle kullanılan, etiketli hedef konsantrasyonu genellikle 10-20 μL birim/tepki olarak 20-50 nM arasında. Zayıf bağlama etkileşimleri karakterize edilebilir izin titrations elde edilebilir ligand konsantrasyonu en üst düzeye çıkarmak için çok küçük tepki birimleri (10 μL) bu protokolünü kullanır. Bu doğru pipetting ve hala iyice karıştırma sırasında kabarcıklar tanıtımı önlemek için alınan bakım gerektirir. Yeterli karıştırma seri dilutions kümesi boyunca doğru tutarlı floresans ölçümler için önemlidir. Ara-20 tutar MST deneylerde bir standart 0,05 0,015 kabarcıklar oluşturmak ve geliştirmek karıştırma eğilimi düşük % düşürüldü.
Kırmızı-Tris-NTA boya fluorescently bir His vardır herhangi bir protein etiketlemek için hızlı, kolay ve kullanışlı bir yol sağlar etiket. Etiketleme sadece 30 dakika içinde etkili bir şekilde tamamlandı ve hiçbir boya kaldırma yordamını gerekli olması çok sıkı. Hiçbir değişiklik ligand bağlayıcı özellikleri değiştirebilir protein amino asit kalıntılarında için yapılır. Bir ihtar etiketlenir sadece protein His6 etiketi olması gereken olmasıdır. Bu ligand protein, E-PRD ve etiket ve uncleaved E-PRD ile ikinci bir IMAC sütun adım etiketinden bölünme gerekli. Mümkünse, bir onun kullanımı olmadan ligand protein hazırlanmalıdır etiket. Alternatif olarak, proteinler kovalent lizin tortular veya sistein kalıntıları kaplin thiol için kaplin amin aracılığıyla bir fluorophore ile etiketlenmiş. Ne zaman bir fluorophore kovalent eki beri gibi sistemleri kullanarak lizin veya sistein kalıntıları üzerinde güvenerek elektrostatik veya polar bağlama etkileşimleri etkileyebilir ancak, özen göstermelidir. VimRod ve E-PRD MST tarafından arasındaki affinity bağlama miktar tuz konsantrasyonu çok hassastı. Bu sorunu başlangıçta hedef ve ligand tahlil arabellek aynı toplu işe dialyzing hafifletilmiş. Yine de, doygunluk MST bağlama eğrinin MST tahlil VimRod karmaşık davranış nedeniyle 150 mM NaCl varlığında işlemi sırasında elde edilebilir değil. NaCl konsantrasyonu 10 KDdoğru hesaplama sağlayan mM den indirdi bir kez güvenilir, tam veri elde edildi. Dolayısıyla, çözüm koşulları ve tamamlayıcı deneyleri ile karşılaştırma dikkatli optimizasyon sağlam sonuçlar elde etmek için önerilir. Ayrıca, MST verilen etkileşimi için tuz bağımlılığı ölçmek, enzim kinetiği17protein etkileşimleri, monitör protein katlanması ve sonda stokiometrik özelliklerini ölçmek için kullanılabilir.

Proteinler arasındaki etkileşimler hücreleri içinde sipariş oluşturmak Moleküler makineler oluşumunu sağlar. Bireysel etkileşimler genellikle zayıf ama genellikle kooperatif ve dinamik olarak düzenlenmiş olabilir multivalent kompleksleri için katkıda bulunmak. Atomik çözünürlük ve böyle karmaşık etkileşimleri hakkında kantitatif bilgi sağlayan hassas deneyleri mekanizmaları anlamak ve uyuşturucu gibi moleküller gibi müdahaleler tasarlamak için ihtiyaç vardır. NMR spektroskopisi protein etkileşimleri hakkında böyle bilgi elde etmek için etkili bir yöntemdir ve zayıf1bağlamak da dahil olmak üzere ligandlar için hızlı tarama için de kullanılır. NMR yöntemleri kullanılan çoğu protein gözlemlemek veya ligand gözlemek o kategorize edilebilir. Bu el yazması kararlı izotop (genellikle altında 20 kDa) nispeten küçük protein etiketli bir spektrum kazanılır ve etiketsiz ligand titre eski yaklaşım kullanır. Bu izin etiketli artıkları olumlu durumlarda eşlenmesi için etkileşim dahil. Bir kez karmaşık formlar, kimyasal ortamlarda kendilerini kimyasal Shift değişiklikler olarak tezahür etkileşen kalıntılarının ve NMR sinyalleri şeklinde bulunan değişiklikler vardır. Ölçüde bu tür değişiklikleri bu grupların etkileşim katılımı derecesi ile karşılıklı olarak ilişkilendirir. Kimyasal shift tedirginlikler (CSP) NMR spectra devamsızlık ve ligand değişen miktarlarda varlığı toplanan protein bir dizi karşılaştırarak ölçülebilir. Daha büyük ligandlar veya karmaşık etkileşimler için en yüksek şekli veya yoğunluğunu değişikliği etkileşimleri anlamak için ölçülebilir.
Ligand etkileşimleri algılamak için kullanılan en yaygın 2D deneme 15N-heteronuclear tek kuantum korelasyon (HSQC) deney2' dir. Bunun bir protein hangi genellikle benzeşme öğesini sürümleri E. coli bakteriyel kültürlerde 15' te N zenginleştirilmiş medya yetiştirilen olarak ifade ederek elde edilir ile 15N, liflerin düzenli bir biçimde etiketlenmesi gerekir. Titrasyon sırasında toplanan HSQC spectra üst üste zaman bağlama tepe değişiklikleri kalıntılarının karmaşık oluşumunda yer alan bir alt için açığa belirgindir. Etkileşim nerede Daralt özgür ve ligand doymuş durumu sinyallerini bir popülasyon ortalaması en yüksek hızlı Döviz rejimi meydana gelebilir. Alternatif olarak, devletler arasında yavaş Satım söz konusu olduğunda, her iki sinyali göreli tutarlarını gösteren integraller ile gözlenir. NMR lineshape analiz bazı durumlarda bağlama benzeşim tahmin etmek için kullanılan, MST gibi yöntemleri de uygun kanıtlamıştır ve hakiki etkileşimlerin çapraz doğrulama sağlar.
Desmosomes içinde bulunan iki proteinlerin sağlanan örnek verilebilir. Kavşak hücre yüzeyleri ve sitoiskeleti arasında aracılık ve hücre adezyon makineleri ve deri bütünlüğünü korumak için ara filamentler multivalent Hofstede aracılık ve kalp doku ve, dayanıklı kuvvetleri kesme. Hastalıkları desmosomal proteinler kardiomyopati veya vimentin gibi mutasyonlar ve otoantikorlar, hücre-hücre kavşaklar destabilization lider tarafından tehlikeye ve dolayısıyla onların etkileşim kritik öneme sahip3olduğunda neden olabilir. Etkileşimleri MST tarafından sayısal iken ligand bağlayıcı desmosomal proteinler tarafından yapısal temeli NMR spektroskopisi ile karakterize edilebilir. Burada yöntemleri genellikle temel oluklar teklif tandem kümeleri olarak var olmayan plakin tekrar etki alanları (PRDs) ve vimentin, helisel tarafından sunulan bir asidik yüzeyi ile etkileşim bir ara filaman arasındaki etkileşimler karakterize etmek için kullanılması paket4. Bu komplekslerin nerede böylece yapışkanlı tahvil bir doku yayılan bir ağ oluşturan bitişik hücrelere bağlamak desmosomes için hücre sitoiskeleti ara filamentler için çapa hücre zarı oluşur.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Monolith NT.115, includes control and analysis software</td>
			<td>NanoTemper Technologies</td>
			<td>MO-G008</td>
			<td>Instrument for microscal thermophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His-Tag Labeling Kit RED-Tris-NTA</td>
			<td>NanoTemper Technologies</td>
			<td>MO-L008</td>
			<td>RED-tris-NTA dye for MST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard capillaries</td>
			<td>NanoTemper Technologies</td>
			<td>MO-K022</td>
			<td>capillaries for MST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HisTrap HP, 5 mL</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17524801</td>
			<td>IMAC column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HisPur Ni-NTA resin, 100 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88222</td>
			<td>IMAC resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiLoad 16/600 Superdex 75 pg</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28989333</td>
			<td>SEC column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEV protease</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T4455</td>
			<td>cleavage of his tag from E-PRD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21(DE3) Competent E. coli</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>C2527H</td>
			<td>cells for protein expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete Protease Inhibitor Cocktail Tablets EDTA-Free</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>11873580001</td>
			<td>protease inhibitors for protein purification by IMAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP, Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4706</td>
			<td>reducing agent for protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents (HEPES, NaCl, etc)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>various</td>
			<td>Preparation of media and buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride (15N, 99%)</td>
			<td>Cambridge Isotope Laboratories</td>
			<td>NLM-467</td>
			<td>isotope labelling for NMR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D2O, Deuterium Oxide (D, 99.8%)</td>
			<td>Cambridge Isotope Laboratories</td>
			<td>DLM-2259</td>
			<td>NMR sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSS, Sodium 2,2-dimethyl-2-silapentane-5-sulfonate-D6 (D,98%)</td>
			<td>Cambridge Isotope Laboratories</td>
			<td>DLM-8206</td>
			<td>reference for NMR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision 5 mm NMR Tubes, 7&#8221; long</td>
			<td>SJM/Deuterotubes</td>
			<td>BOROECO-5-7</td>
			<td>NMR tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMR spectrometer (14.1 Tesla)</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>acquisition of NMR data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCI 5mm z-PFG cryogenic probe</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>acquisition of NMR data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bruker TopSpin 4.0.1</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>processing of NMR data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MO.Control</td>
			<td>NanoTemper Technologies</td>
			<td></td>
			<td>included with Monlith NT.115</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MO.Affinity Analysis</td>
			<td>NanoTemper Technologies</td>
			<td></td>
			<td>included with Monlith NT.115</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring interactions of globular and filamentous proteins by nuclear magnetic resonance spectroscopy (nmr) and microscale thermophoresis (mst)

Vimentin gibi ipliksi protein organizasyon proteinler plakin içeren siteleri ile yapısal bir iskele sağlayarak hücreleri içinde yinelenen denetim sağlar. Burada, tespit ve bu tür etkileşimler ölçüm için bir protokol envoplakin küresel plakin tekrar etki alanını ve vimentin sarmal bobin kullanılarak açıklanmıştır. Bu bir protein vimentin (veya benzer ipliksi protein) bağlar olup olmadığını belirlemek için ve etkileşim yakınlık ölçüm için bir temel sağlar. Faiz küresel protein 15ile N etiketli ve çözüm vimentin protein ile titre. Bir iki boyutlu NMR spektrumu tepe şekil veya kimyasal vardiya değişiklikleri gözlemleyerek etkileşimleri algılamak ve etkileri vimentin dördüncül yapı etkisi tuz düzeyleri de dahil olmak üzere çözüm koşullardan aydınlatmak için kazanılır. Faiz protein ipliksi ligand bağlar, bağlama etkileşim saf protein kullanarak MST tarafından sayılabilir. Bir protein ilgi bir filament bağlar olup olmadığını belirlemek için ve nasıl etkileşim değişikliği, mutasyonlar çözüm koşullar, gibi etkiler değerlendirmek için basit bir yol yaklaşımdır.

(Artıkları 1822-2014 klonlanmış pProEX-HTC) E-PRD etki VimRod etki alanı (artıkları 99-249 pET21a klonlanmış) ve insan envoplakin gen insan vimentin4 His6 etiketleri ile ifade ve saf. Şekil 6 ve Şekil 7 göstermek VimRod saflık düzeyleri (18,8 kDa) ve E-PRD (21,8 kDa) elde edilen protein saflaştırma bu yöntem. E-PRD yapı VimRod protein His6 etiket bağlama boya kullanılarak etiketlenir ve herhangi bir E-PRD onun His6 etiketi istinat boya bağlama için rekabet edebilir MST deneyler için gerekli etikettir His6 kaldırılması. TEV proteaz etiketiyle bölünme sonra ikinci IMAC sütun TEV proteaz, cleaved etiket ve herhangi bir uncleaved His6-E-kalan PRD kaldırır. Son parlatma arıtma boyutu dışlama Kromatografi adımdır. E-PRD elüsyon tepe 72 nerede bu büyüklükte bir protein monomer beklenir mL ortalanır iken her ikisi proteinler de benzer bir boyutu rağmen 51 mL adresindeki sütun üzerinden VimRod elutes. VimRod boyutunu belirgin artış nedeniyle muhtemeldir karakteristiklerini ipliksi uzun çubuk olarak şeklinde protein analitik ultracentrifuge deneyler VimRod monomeric4olduğunu gösterdi. Protein düşük verimleri bu zengin suyu en az medyada üretilen hücreler daha düşük bir miktarı nedeniyle from M9 içinde yetiştirilen kültür elde edilir. TB M9 hazırlıkları için daha büyük starter kültürlerin ilk büyüme hücre sayıları 15N NMR deneyler için gerekli etiketleme ölçüde korurken geliştirilmesi sağlar.
15N -1H HSQCs alınan E-PRD R1914E mutant ve vahşi türü için varlığı ya da yokluğu VimRod (Şekil 8A-8 D) içinde. E-PRD Şekil 8A yelpazesi de çözümlenmiş tepeler, düzgün katlanmış bir protein gösterge beklenen sayısını gösterir. VimRod (resim 8B) huzurunda geniş hattı genişletmeyi ve tepe kaybolması, E-PRD ile VimRod arasındaki karşılık gelen spektrum gösterir. Bu bağlama tarafından R1914E mutasyon kıyasla kanıtladığı Şekil 8 c ve 8 Dolarak kaybolur. Küçük değişiklik VimRod ek olarak bu mutant E-PRD ve VimRod arasında bağ eksikliği gösteren R1914E mutant üzerine spektrumda görülmektedir. E-PRD en yüksek yoğunluklarda yokluğunda varlığı/VimRod karşılaştırmak ve en yüksek E-PRD tesisin genişletilmesi aralığı gösteren rakam 8E, göreli en yüksek yoğunluklarda olarak çizilen. E-PRD (gösterilmez) R1914E mutant doruklarına % 20 veya daha yüksek en yüksek yoğunluklarda yaklaşık % 97'si vahşi türü (rakam 8E) için yaklaşık % 20 ile karşılaştırıldığında VimRod varlığı içinde korunur. Bu kaybı temsil eder, ek mutantlar da ara etkilere sahip ile işlev noktası mutant okudu4yapılmış olması.
Doğrulamak ve VimRod ve E-PRD MST Analizi His6 VimRod floresan kırmızı-tris-NTA boya hedef olarak etiketlenmiş kullanarak bağlama quantitate için karışık 39.1 için 1.28 mm E-PRD ligand konsantrasyonları azaltılarak nM gerçekleştirilen. Üç bağlama titrations yapılmıştır ve sonuçları Ortalama ve Şekil 9' da gösterilen. Verileri bir site ligand bağlayıcı standart bir model ile uygun ve bir KD 25.7 ± 2.1 mikron verdi. VimRod ve E-PRD arasında bağ yüzey plasmon rezonans tarafından değerlendirilmesi 19,1 ± 1.3 mikron4benzer KD değeri verdi.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58537/58537fig1.jpg"> Şekil 1: ekran yakalama NMR deney kurulumunun. Pencerenin gösterildiği bir HSQC veri toplamak için standart bir deneme oluşturmak için kullanılır. Deney parametreleri içinde okumak deney bitişik. Gösterilen ZGPR deney ilk bir deney olarak bağımlı proton standart ve Çözücü parametreleri yüklemek için seçilir. Başlık pencere kayıt tutma amaçları için deneysel ayrıntıları girmek için kullanılır. HSQC spektrum toplamak için ZGPR deneme SFHMQC3GPPH ile değiştirilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58537/58537fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58537/58537fig2.jpg"> Şekil 2: NMR deneysel parametrelerini ayarlama. Gösterilen penceresi NMR titreşim sıra temel parametrelerini girmek için sinyal en iyi duruma getirmek için kullanılır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58537/58537fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58537/58537fig3.jpg"> Şekil 3: NMR veri işleme. Her iki boyut NMR spektrumu sayısını işlemek için kullanılan parametreler, bu da tipik olarak ayarlanır gösteren oklarla gösterilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58537/58537fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58537/58537fig4.jpg"> Şekil 4: NMR en yüksek malzeme çekme parametrelerini. NMR doruklarına işlenmiş NMR spektrumu aldığın için kullanılan parametreler ile tipik değerler gösterilir. Ppm aralığı, yoğunluk ve spectra optimize etmek için zirveleri sayısını ayarlayın. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58537/58537fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58537/58537fig5.jpg"> Şekil 5: yoğunluklarda ile temsilcisi Peaklist. Bir numara ve onun 1H NMR spektrumu aldı her tepe verilir ve 15N kimyasal vardiya ve sinyal şiddeti görüntülenir. Bu peaklist daha sonra etkileşen bir ortak varlığı/olmaması durumunda elde edilen spectra karşılaştırmak için kullanılabilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58537/58537fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58537/58537fig6.jpg"> Şekil 6: His6 öğesini VimRod IMAC ve S. A. arıtma Kromatografik elüsyon IMAC sütun için bir büyük en yüksek VimRod gösterir. B. kromatografik elüsyon S sütun için bir büyük pik gösterir. C. SDS-sayfa kesirler arıtma boyunca toplanan: MW standartları MW ile havuza alınmış kDa soldaki jel (M), hücre lysate (1), IMAC akışı ile (2), yıkama (3), havuza alınan elüsyon (E1), S elüsyon (E2) gösterilir. Bantları daha yüksek moleküler ağırlık Lanes E1 ve E2 görünür Batı leke (veri gösterilmez) tarafından onaylanmış olarak saf VimRod reaksiyonlar vardır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58537/58537fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58537/58537fig7.jpg"> Şekil 7: E-PRD IMAC ve S. A. arıtma SDS-sayfa MW molekül ağırlığı standartlara gösterilen IMAC arınma ilk IMAC sütunundan (E1), TEV bölünme ürünleri (+ TEV), jel (M) ve eluate soluna kDa içinde belirtilen ve aracılığıyla akış ikinci IMAC sütundaki (FT). B. Kromatograf S sütundan bir büyük pik gösterir. C. SDS-sayfa molekül ağırlığı standartları (M) ve kesirler S tepe üzerinden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58537/58537fig7large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58537/58537fig8.jpg"> Şekil 8: HSQC Spectra vahşi-tipi ve R1914E Mutant, E-PRD varlığı ve yokluğu VimRod. HSQC spectra vahşi-türü E-PRD göster (100 µM) 20 mm Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM DTT, Devamsızlık (A) veya 50 µM varlığı pH 7 VimRod (B). C ve D panelleridir R1914E mutant (100µM) HSQC spectra yokluğu veya 50 µM varlığı VimRod, anılan sıraya göre. Masası'nda E göreli 1H -15N en yüksek yoğunluklarda E PRD veya VimRod bağlama olmadan keyfi olarak atanan ve sıra konumuna göre değil en sayısı bir fonksiyonu olarak gösterilir. Bu değerler bir önemi kesim en yüksek yoğunluk azaltma üzerine bir ligand eklenmesi için tanımlamak için kullanılabilir. Atamaları yoksa, önemli değerleri kez harita için bir bağlayıcı alanı görülebilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58537/58537fig8large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58537/58537fig9.jpg"> Şekil 9: E-PRD VimRod için bağlama. E-PRD seyreltilmiş 1.28 mm iki kat dilutions 39.1 için bir dizi nM ve MST çözümlemeyi gerçekleştirmeden önce etiketli VimRod ile inkübe. Veri üç bağımsız deneyleri kombine edilmiştir. Verileri bir KD 25.7 mikron ile ± 2.1 μm kalınlığında bir KD güven veren bir KD modeline uygun. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58537/58537fig9large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Reaktif</td>
			<td>Miktar</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sodyum fosfat, dibasic (susuz)</td>
			<td>6.0 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>Potasyum fosfat, Yem mono (susuz)</td>
			<td>3.0 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sodyum klorür</td>
			<td>0,5 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>H2O</td>
			<td>950 mL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1. M9 medya izotopik etiketleme için.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Reaktif</td>
			<td>Miktar</td>
		</tr>
<tr>
<td>
15 NH4Cl</td>
			<td>1.0 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glukoz (veya 13C-glikoz)</td>
			<td>2.0 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M MgSO4
</td>
			<td>2 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>50 mM CaCl2
</td>
			<td>4 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>20 mg/mL tiamin</td>
			<td>1.0 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>3 mM FeCl3
</td>
			<td>400 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mix (Tablo 3) metal</td>
			<td>500 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>H2O</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 2. M9 takviyesi medya için besin karışımı.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Reaktif</td>
			<td>Miktar</td>
		</tr>
<tr>
<td>4 mM ZnSO4
</td>
			<td>323 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 mM MnSO4
</td>
			<td>75,5 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>4.7 mM H3BO3
</td>
			<td>145 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>0.7 mM CuSO4
</td>
			<td>55,9 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>H2O</td>
			<td>İlâ 500 mL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 3. MT besin karışımı zenginleştirmek için metal karışımı ek.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Örnek</td>
			<td>1 mM E-PRD tampon A1 (µL)</td>
			<td>1mM VimRod tampon A (µL)</td>
			<td>Arabellek (µL)</td>
			<td>200 µM DSS (µL) D2O</td>
			<td>Tampon B2 (µL)</td>
			<td>Toplam hacim (µL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>E-PRD yalnız</td>
			<td>50</td>
			<td>0</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
			<td>350</td>
			<td>500</td>
		</tr>
<tr>
<td>E-PRD + VimRod</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
			<td>0</td>
			<td>50</td>
			<td>350</td>
			<td>500</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">
1 Arabellek A: 20 mM Tris-HCl, 1 mM DTT, pH 7</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">
2 Arabellek B: 23 mM Tris-HCl, 1.14 mM DTT, pH 7</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 4. NMR numune hazırlama.

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy NMR and Microscale Thermophoresis MST at JoVE.com

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy NMR and Microscale Thermophoresis MST

Burada, üretim ve arıtma etiketlenir proteinlerin için bir protokol kararlı izotop ve protein-protein etkileşimleri nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopisi ve MicroScale kullanarak sonraki karakterizasyonu ile mevcut Thermophoresis (MST) deneyler.

Nükleer manyetik rezonans spektroskopisi (NMR) ve Microscale Thermophoresis (MST) tarafından küresel ve ipliksi protein etkileşimleri ölçme

Filamentous proteins such as vimentin provide organization within cells by providing a structural scaffold with sites that bind proteins containing plakin ...

Bu yöntem, protein etkileşimi alanında proteinin doğrudan küçük veya büyük bir moleküle bağlanıp bağlanmadığı gibi anahtar soruların yanıtlatına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, atomik düzeyde doğrudan etkileşimleri tespit etmek için basit ve hızlı bir şekilde olmasıdır. Fırlatma komutu ej ile hava akışını açın.Bu mıknatıstan gelen örneği getirecek. Şimdi, açıkta mıknatıs üstüne bir spinner içinde örnek yerleştirin. komut ij ile ekleyin.Devam etmeden önce örnek mıknatısın içine yerleşene kadar bekleyin. Edc komutunu kullanarak yeni bir veri kümesi oluşturun ve zGPR deneyini seçerek standart proton NMR parametrelerini yükleyin. AD, deneme numarası ve işlenmiş veri klasörü numarası alanlarını doldurun.Set çözücü alanında çözücüseçin ve standart probkafası ve solventbağımlı parametreleri okumak için Execute getprosol tıklayın. Kilidi komutunu kullanarak numuneyi deuterated çözücüye kilitleyin ve süpürme bitene ve kilit elde edene kadar bekleyin. Otomatik ayar komutunu kullanarak örneği ayarlayarak mıknatısın rezonans frekansını düzeltin.Otomatik ayar tamamlanana kadar titreme eğrisini izleyin. Topşimi kullanarak manyetik alanı shim. Shimming manyetik alana ayarlama yapar.Örnek etrafında tekdüzelik elde edin. Bu komut wsh ile değerlerde bu depolamak için iyi bir uygulamadır ve aynı veya benzer örnekleri kullanıyorsanız, topshim önce rsh kullanarak okuyun. Şimdi gürültü oranı maksimum sinyal elde etmek için rga komutu ile alıcı kazanç ayarlayın.Spektrumun merkezini su rezonans ofsetine yerleştirin ve calibo1p1 kullanarak 90 derecelik proton darbesini yüksek güçte ayarlayın. Proton spektrumunu sıfır go zg komutunu kullanarak toplayın ve efp ile işlem leyin. Buna üstel çarpma, satır genişletmeyi içeren serbest indüksiyon bozunması, FID'nin Fourier dönüşümü ve faz düzeltmesi uygulamak için pk dahildir.Entegrasyon seçeneği olmadan polinom kullanarak otomatik faz düzeltme apk ve otomatik taban çizgisi düzeltme absn uygulayın. Deneyde SFHMQC3GPPH'yi seçerek SOFAST HMBC denemesi için yeni bir veri kümesi oluşturun. Proton spektrumundan optimize edilmiş P1 ve O1'i kopyalayın ve P1'in p1'in optimize edilmiş P1 değeri olduğu ve plw1'in P1'in güç seviyesi olduğu getprosol 1H p1 plw1 komutunu kullanarak P1'e bağımlı darbeleri doldurun. Şimdi, amide kimyasal kayması için ofset ayarlamak için CNST54 sabiti optimize edin.Ayrıca, alıcı kazancının optimize edilmesine izin vererek spektral ilgi bölgelerini kapsayacak şekilde bant genişliğini tanımlamak için CNST555'i optimize edin. Bu parametreleri seçmek için, iki boyutlu spektrumdan ilk FID ayıklayın ve bunları tanımlamak için gözlenen sinyali arayın. Buna ek olarak, gkomutu ile kabul edilebilir sinyal hassasiyeti elde etmek için gevşeme gecikmesini, tarama sayısını ve sahte taramaları değiştirin ve veri kalitesini gerçek zamanlı olarak izlemek için gidip taramayı sağlar.Son olarak, Zero Go zg kullanarak spektrumları kaydedin. İşlemparametrelerini, dolaylı boyutta isteğe bağlı doğrusal tahminle, spektrumun doğrudan F2 ve dolaylı F1 boyutlarıboyutuna ayarlayın. Pencere işlevi olarak QSINE'yi seçin ve iki boyutlu spektrumu işlemek için iki nin Sine çan kaydırmasını girin.Pencere fonksiyonu ve Fourier dönüşümü ile her iki yönde verileri işlemek için xfb komutunu girin. Her iki yönde de otomatik faz düzeltmesi gerçekleştirmek için apk2d komutunu kullanın. 2B veriler için otomatik taban çizgisi düzeltme işlevi abs2 ile taban çizgisini düzeltin.Bu işlem parametrelerinde tanımlanan ppm değerleri arasında bir polinom işlevi uygular ve daha fazla analiz için bir 2B spektrum üretecektir. Etkileşim verilerinin başka bir molekülle karşılaştırılması için seri işleme yapmayı planlıyorsanız, işlem parametrelerini wpar komutuyla saklayın ve rpar ile geri çağırın. Tepe toplama işlemini başlatmak için pp komutunu girin.Ppm aralığını, minimum yoğunluğu ve beklenen en yüksek tepelere göre maksimum tepe sayısını tanımlayın. Ardından Tamam'ı tıklatın. Sonuçları görsel inceleme ile doğrulayın. Gerekirse, sonuçlar spektrum kalitesine göre tatmin edici olana kadar işlemi yeniden çalıştırın.pp komutu ile bir tepe listesi oluşturun. Bu tepe listesi varsayılan olarak veri yüksekliği ve en yüksek yoğunluk bilgilerini içerir. Tepe listesi sonraki spektrumlara dışa aktarılabilir ve diğer programlar tarafından okunabilir.Şimdi başka bir molekül ile etkileşimi gösteren kimyasal kaymalarda zirve yoğunlukları veya hareket değişiklikleri için protein HSQC spektrumları gözlemleyin. Etkileşen molekül büyükse, bazı zirvelerin kaybolması ile birlikte tepe yoğunluklarında azalmalar bekleyin. Zirveler sekmesini tıklatarak ve zirveler penceresinde sağ tıklatarak içe aktarma'yı seçerek bir sonraki veri kümesine tepe listesini aktarın.Spektrum üzerindeki zirveleri görselleştirin ve gerekirse yeni konumlara kaydırın. Yoğunlukları içeren spektrum için bir tepe listesi oluşturmak için tam tablo için sıfırlama yoğunluklarını tıklatın. Bu tepe listesi, depolanan tepe listesindeki konum bilgilerini taşır.Dışa Aktarma işlevini seçerek, farklı veri kümelerinden gelen tepe listelerini bir elektronik tabloya veya analiz için başka bir matematiksel programa dışa aktarın. Karmaşık spektrumdaki fonksiyon pik yoğunluğu, her tepe için protein spektrumundaki pik yoğunluk ile tepe yoğunluklarında değişimi hesaplayın. Değerler 100 ile çarpılarak yüzde değişimine dönüştürülebilir.Tepe hacimleri de yararlı olduğunu unutmayın, ancak tepe yoğunlukları birbirine yakın konumlandırılmış zirveler için ölçmek daha kolay olsa da, nispeten geniş zirveleri yüksek yoğunluklu proteinler için genellikle olduğu gibi. N15HSQCs vahşi tip E-PRD için satın alındı, yanı sıra R1914E mutant, varlığı veya VimRod yokluğunda. Yabani tip E-PRD spektrumu iyi çözülmüş zirvelerin beklenen sayısını gösterir, düzgün katlanmış protein göstergesi.VimRod varlığında, spektrum geniş çizgi genişletme ve pik ortadan kalkması gösterir, E-PRD ve VimRod arasında bağlayıcı karşılık. R1914E mutantının spektrumu arasında tek başına ve VimRod'in eklenmesi yle bu mutant E-PRD'ye bağlanma eksikliğini gösteren çok az değişiklik gözlenir. Burada VimRod varlığı ve yokluğunda E-PRD tepe yoğunlukları karşılaştırıldı ve E-PRD kompleksinde pik genişletme aralığı nı göstermek için göreceli tepe yoğunlukları olarak çizilmiştir.VimRod ve E-PRD'nin bağlanmasını doğrulamak ve quantitate etmek için, Hedef olarak floresan RED-tris-NTA boya ile etiketlenmiş His6-VimRod kullanılarak MST analizi, E-PRD ligand azalan konsantrasyonları kullanılarak yapıldı. Veriler tek siteli ligand bağlama standart bir model ile uygun ve 25.7 artı veya eksi 2.1 mikromolar bir KD verdi. Bu yordamı çalışırken, aynı edinme ve işleme koşullarını kullanmayı unutmamak önemlidir.NMR spektrumlarının toplanması için izotop etiketli protein örneklerine erişim nedeniyle mücadele edecektir. Bu tekniğin etkileri kanser, enfeksiyon veya nörodejeneratif hastalığın tedavisine doğru uzanır, çünkü hastalıkta tehlikeye atılan protein etkileşimlerinin oluşumunu içerirler.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Analytical Chemistry

Biochemistry

Unit 1

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR) and Microscale Thermophoresis (MST)

Interpreting Nuclear Magnetic Resonance Spectra

SCIENTISTS IN ACTION

Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for the Identification of Multiple Phosphorylations of Intrinsically Disordered Proteins

Özünde Düzensiz Proteinlerin Çoklu fosforilasyon Saptanma Nükleer Manyetik Rezonans Spektroskopisi

Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer's disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, ...

Mapping the Binding Site of an Aptamer on ATP Using MicroScale Thermophoresis

Mikro Termoforesis kullanarak ATP bir aptamer Bağlama Sitesi Haritalama

Characterization of molecular interactions in terms of basic binding parameters such as binding affinity, stoichiometry, and thermodynamics is an ...

Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Atomik yapısal çalışmaların makromoleküllerin meclisleri tarafından katı hal Nükleer manyetik rezonans spektroskopisi

Supramolecular protein assemblies play fundamental roles in biological processes ranging from host-pathogen interaction, viral infection to the ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Proteinler kovalent immobilizasyon için tek molekül kuvvet spektroskopisi

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Bir floresan dalgalanma spektroskopisi tahlil Protein-Protein etkileşimlerinin hücre-hücre kişiler

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Preparation of Fungal and Plant Materials for Structural Elucidation Using Dynamic Nuclear Polarization Solid-State NMR

Yapısal aydınlatma kullanarak dinamik nükleer polarizasyon Solid-State NMR için bitki malzeme ve mantar hazırlanması

This protocol shows how uniformly 13C, 15N-labeled fungal materials can be produced and how these soft materials should be proceeded for solid-state NMR ...

Measuring Interactions between Fluorescent Probes and Lignin in Plant Sections by sFLIM Based on Native Autofluorescence

Floresan Problar ve Lignin Bitki Kesitlerinde Doğal Otofloresan Dayalı SFLIM Ile Etkileşimlerinin Ölçülmesi

In lignocellulosic biomass (LB), the activity of enzymes is limited by the appearance of non-specific interactions with lignin during the hydrolysis ...

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

Protein-Lipid Etkileşimlerini Ölçmek için Mikro Ölçekli Termoforez Kullanımı

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Olgun Pirincin Enine Kesiti (Oryza sativa L.) Hareketsizleştirme Desteği Olarak Pipet İpuçlarını Kullanarak Elektron Mikroskopi Görüntülemesini Taramak için Çekirdekler

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Removal and Replacement of Endogenous Ligands from Lipid-Bound Proteins and Allergens

Lipid'e Bağlı Proteinler ve Alerjenlerden Endojen Ligandların Çıkarılması ve Değiştirilmesi

Many major allergens bind to hydrophobic lipid-like molecules, including Mus m 1, Bet v 1, Der p 2, and Fel d 1. These ligands are strongly retained and ...