Name: structural studies of macromolecules in solution using small angle x-ray scattering
Uploaded: 2018-11-05T13:00:00
Duration: 7 min 19 s
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该项目得到了 nserc rgpin-2018-04994、校园艾伯塔省创新计划 (rcp12-002c) 和艾伯塔省普隆研究所/艾伯塔省创新生物解决方案 (201618年) 赠款的支持, 该奖学金授予 m. o. trp 是加拿大 rna 和 rna 研究主席。蛋白质生物物理学 (201704), 并承认 nserc 发现赠款 (rgpin-2017-04003)。tm 由 nserc 发现计划赠款资助。

1. saxs 样品制备和数据采集
<ol><li>样品制备:<ol>
<li>saxs 实验需要均匀、稳定和非聚集的蛋白质样本;在数据采集前, 用大小排除色谱 (s)、dls 和/auc 观察稳定性和寡聚状态。</li>
		<li>主体样品 (尼多根-1 和层压体γ-1 在这种情况下) 到 dls 分析和三氯素 sds-page, 以可视化样品纯度10。 注: 样品可涵盖范围内的浓度 (1-4 mg/ml), 具体取决于其大小、其溶液行为, 如自关联和聚集以及稳定性;在此, 制备了5种浓度的 nidogen-1、(139 kda)、3种层压蛋白γ-1 (109 kda) 和4种 s 纯化等摩尔复合体, 如前所述的 10。</li>
	</ol>
</li>
	<li>数据采集：<ol>
<li>根据制造商或设施指南, 使用内部系统或同步加速器收集 saxs 数据。 注: 这项工作中使用的数据是使用内部系统 (见材料表) 收集的, 该系统包含一个3针孔摄像机, 配备了 + 002 微焦密封管 (cu kα辐射为 1.54) 和在 40 w 下工作的共聚焦最大流量 (cmf) 光学。该系统还配备了用于数据采集的200纳米多线2d 探测器。然而, 随着法国、德国、英国、美国和其他国家的现代同步加速器的出现, 我们提供了 s-saxs 设置, 便于将单分散制剂与可能的聚合/降解分离。在同步加速器设施收集数据。最近发表的一篇关于 dna g-四重奏11的文章是 s-saxs 数据收集策略的一个例子。在这种情况下, sax 数据的收集范围为 0.08≤q≤0.26 3小时 (2.0、2.5、3.0、3.5 和 4.0 mgml); 层流氨基γ-1 (1.5、2.0 和 2.5 mg/ml) 及其复合物 (0.8、1.0、1.25 和 1.5 mg/ml)。</li>
		<li>使用特定于系统的处理软件减少缓冲区和采样的数据。使用 PRIMUS/qt12 (图 2a) 等程序从蛋白质数据中减去缓冲贡献。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 数据分析
注: 目前, 有几个软件包可用于 saxs 数据分析: scotter43 (下载可在 www.bioisis.net), 生物 xtas raw 44 和 atsas套件 13.本节概述了使用 atsas 程序套件分析原始 saxs 数据时应采取的一般步骤, 并从 atsas 2.8.1 下载中采取了具体步骤。其他程序可以使用, 稍后将进行简要讨论。
<ol><li>缓冲减法 注: 这些步骤仅与静态 saxs 示例相关。<ol>
<li>选择 PRIMUS/qt 中的 "打开" 菜单选项, 然后选择感兴趣的数据文件。请注意, 数据文件必须采用 ascii 格式, 其中第一列为 s-矢量轴, 第二列为强度。通过将此数据插入同一菜单, 对为缓冲区本身收集的数据重复此步骤。</li>
		<li>在数据处理窗口中选择 "subtractact", 这将生成一条减去的散射曲线, 仅表示来自感兴趣的大分子的散射。对每个浓度重复此步骤。</li>
	</ol>
</li>
	<li>吉尼耶分析<ol>
<li>若要执行 guinier 分析, 请按照前面步骤2.1.1 中所述, 将缓冲减去的散射曲线加载到 primuse qt 中。</li>
		<li>点击 "旋转半径", 这将继续在打开普里穆斯吉尼耶向导;将显示 ln(i) vs q 2的图形。</li>
		<li>要获得初步的 rg , 请使用 "autog" 功能, 这是一个外部模块内置到 primus/qt. 找到 "自动" 按钮, 然后单击它。</li>
		<li>通过突出显示所有文件并将其插入右侧的菜单, 一次输入多个文件, 与2.1.1 非常相似。</li>
		<li>使用先前创建的 guier 图形来评估数据质量;吉尼尔图下的绿线显示了代表配合线性的残差图。请注意, guinier 分析中的非线性可能是样本聚合的标志, 在这种情况下不应执行进一步的分析。 注: 线性几内亚配合给出了一个rg 与一个小错误 (& lt;5%), 并建议一个高质量的样本。</li>
	</ol>
</li>
	<li>克拉特基分析<ol>
<li>以类似的方式加载要可视化的数据, 如上文所述。</li>
		<li>点击数据文件名称旁边的 "选择框"。这将在单独的窗口中绘制数据。</li>
		<li>点击下拉菜单中的 "plot" 按钮, 然后点击 "kartky plot" 选择。</li>
		<li>这将数据绘制为 "q2 x l (q) vs q "。请注意, 球状蛋白质显示高斯峰, 而展开的蛋白质将显示一个高原而不是一个峰值, 并类似于一个双曲图17。</li>
	</ol>
</li>
	<li>数据合并<ol>
<li>负载缓冲区再次减去了 PRIMUS/qt 中每个浓度的数据, 如步骤2.1.1。</li>
		<li>要合并数据, 只需单击处理窗口中的 "merge" 按钮。</li>
		<li>检查每一条曲线和 i 刻度数, 这与原始样品中的稀释有关。 注: 浓度较高的样品在曲线的尾部区域显示的噪声较小。</li>
	</ol>
</li>
	<li>p (r) 分配<ol>
<li>若要生成 p (r) 图, 请将合并的数据曲线加载到 PRIMUS/qt 中, 如前面所述。</li>
		<li>点击 "距离分布" 按钮, 打开一个新窗口, 显示在右侧的散射光强度与 q 和对距离分布函数图的合并数据。 注: 右侧的信息显示对距离分布函数计算的整体质量。</li>
		<li>调整合并数据的数据范围, 以避免原始数据尾部出现任何重大噪声。</li>
		<li>省略靠近低 q 区域中的光束停止的数据点。</li>
		<li>要确定d最大值,请从从 guier 分析中获得的rg 的范围开始。逐渐减小此值, 直到 p (r) 绘图在 y 轴上不会突然下降到零, 并且在接近零之前没有长尾。</li>
		<li>检查实验r g/i0 (从 guier 近似得到) 和p(r) r g/i 0 数字是否相似. 注: 在某些情况下, 进一步操作数据、数据点和 alpha (一个正则化参数, 它告诉程序与拟合实验数据相比, 对分布的平滑度的关注程度的比率) 也是如此。需要21才能获得高质量的p(r) 图。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3.b 个初始珠子建模和平均
<ol><li>一旦合并了在多个浓度下收集的数据, 或者将使用 s-saxs 收集的数据降至最低, 并验证了 kratky 图、 p(r) 图和 guier 分析, 计算了大分子的低分辨率结构。他们的复合体。该管道可用于研究核酸、蛋白质、核酸蛋白或蛋白质蛋白复合物 10、11、21、22、23的溶液结构和相互作用 , 24、25、26、27、28、29、30、31、32 ,33,34。最受欢迎的程序之一是 dammin, 由 svergun35开发, 是 atsas 13 包的一部分, 它使用模拟退火协议, 并在rg 和d最大值上提供初步输入信息.从一开始的建模方法和原则在其他地方详细介绍了18,36。</li>
</ol>

作者没有任何披露要申报。

本文协议部分概述的 saxs 数据分析的关键步骤包括缓冲减法、吉尼耶分析、克拉特基分析、数据合并和 p (r) 分布。从一开始的珠子建模太广泛了, 无法在这里详细介绍, 因此只简单介绍。
在同步加速器 (例如德国的 desy、英国的 diamond 和法国的 esrf), 可以收集每个样本的很小一部分 (~ 少量μl) 的 saxs 数据, 因为分数是从在线连接的 s 列中提取出来的 (参见图 1)。).弹性散射的 saxs 数据是径向平均使用仪器制造商提供的包或由同步加速器, 然后才可以进行缓冲减法。生成的一维数据表示 y 轴和散射角 (q = 4 sin , 其中是入射 x 射线的波长) 上的散射光量 (在 i(q) 中), 如图 1所示。该程序 PRIMUS/qt12用于直接减去任何背景由于缓冲区, 并在第1.1 节中描述。其他方案, 如;scotter43 (下载可在www.bioisis.net), 教程可在 https://www.youtube.com/channel/UCvFatdC5HcZOLv6OSjblfeA 和生物 xtas raw44 (可在http : ps:///bioxtas-raw.readthedocs.io/en/Latest/index.html) 可用作 atsas 软件包的替代方案。
guinier 分析提供了有关样品聚集和均匀性的信息, 并根据来自低区域14的 saxs 数据为感兴趣的大分子提供了陀螺半径 (rg)。利用 PRIMUS/qt 构造了从每个浓度获得的 saxs 数据的图形, 然后是最大范围为 q x r g的最大范围为1.30的曲线拟合。单分散样品制备应在该区域提供线性吉尼耶图 (图 2d), 而聚合则产生非线性吉尼耶图15,16。如果 guier 分析是线性的, 那么在决定是执行刚体建模还是构建低分辨率模型的合奏时, 克拉特基图可以观察到感兴趣的大分子的 "展开" 程度, 这很有用。球状蛋白质将出现在克拉特基地块上, 形成钟形曲线, 而扩展分子或展开的肽将出现在高原甚至在较大的q范围内增加, 并且缺乏钟形 (图 2c)。
从 guier 分析中获取r g 只考虑一维散点图的低q区域的数据点 (图 2d), 但是, 可以使用几乎整个数据集执行间接傅立叶变换将 ln (i (q) ) vs . (q) 的往空信息转换为提供 d max 和 r g 信息的真实空间距离分布函数 (p (r) ) (图 2 b)p(r) 图的形状代表了感兴趣的大分子的总溶液构象 18,19。将往空数据转换为真实空间数据是一个关键的步骤, 但详细的描述不在本文的范围之内。因此, 请参考 svergun20的文章来了解每个参数。
一旦通过具有一致 r g 值的 guier 分析处理单个浓度下的缓冲减去数据, 然后使用 kratky 分析调查其折叠模式, 这些数据就可以合并。如上文所述, 对 nidogen-1、层压蛋白γ-1 及其复合物的合并数据进行了处理, 得到的 p (r) 图如图 2b所示。理想情况下, 还应计算每个浓度的对距分布函数 p (r), 以确定为每个浓度收集的 saxs 数据是否提供了类似的rg 和 d最大值。如果rg 和d最大值在广泛的浓度范围内保持相似, 则用户应继续。需要注意的是, 根据信号的不同, 数据可能会在数据合并之前被截断。如果正在调查的大分子的浓度和分子量较低, 通常会出现这种情况。
使用 dammin 的低分辨率形状分析可以在各种模式下执行 (例如, 快速、慢、专家模式等)。快速模式是评估 p (r) 图是否提供了高质量模型的理想第一步。通常情况下, 每个 p (r) 图至少应获得10个模型, 以检查是否获得了低分辨率结构方面的可重现结果, 拟合参数的优度较低 (根据我们的大量工作, 0.5-1.0 的值被认为是好的), 该值描述实验收集的 saxs 数据和模型派生数据之间的协议。出于发布目的, 我们通常使用 "慢速" 或 "专家" 模式, 并计算至少15个模型。除了 dammin, 它的一个更快的版本, dammif37, 以及 gasbor 38 也是替代品.此外, 为了研究蛋白质蛋白或蛋白质核酸复合物, 可以使用 monsa 程序35, 这有助于同时拟合单个 soxs 数据的两个大分子以及它们的复合体。有关高分辨率模型计算以及 rna-蛋白质相互作用研究的更多细节, 请参阅 patel等人3的最新文章。
saxs 理论上很简单, 但无疑是对其他结构生物学工具高度互补的方法, 其结果是低分辨率的结构数据, 可以单独使用, 也可以与高分辨率技术结合使用, 以阐明信息关于大分子结构和动力学只要能得到大分子及其配合物的单分散制剂, 就可以利用 saxs 研究任何类型生物大分子的溶液内结构和相互作用。在这里讨论的复合体的情况下, 值得注意的是, 只有不到10% 的氮-1 和层压蛋白γ-1 的整体可访问表面积被埋在这个复合体中, 而这两种蛋白质的其余领域都可以自由地与其他蛋白质相互作用。细胞外基质处的蛋白质, 以保持其结构刚性 (图 3)。使用其他结构生物学技术, 如 x 射线晶体学、核磁共振和低温显微镜, 获得具有 ~ 240kDa 的复杂物的此类信息将是非常具有挑战性的。
通过 x 射线晶体学或核磁共振发现蛋白质结构是一个固有的耗时过程。结构确定中的这一瓶颈是 saxs 作为结构技术的强度所在的一个领域;单个 saxs 实验的数据采集可能需要不到一个小时的时间, 借助简化的分析软件, 可以快速高效地进行分析。saxs 作为一种独立技术, 有可能大大提高结构研究的吞吐量, 因为它在获得高分辨率数据之前提供了一个低分辨率的大分子结构模型。其他结构技术的一个障碍是需要一个高度纯净、集中的样本来获取数据, 这就需要在很长一段时间内获得高水平的蛋白质表达和稳定性。虽然 saxs 样品也需要是纯和浓缩的, 但样品量大约为 100μl, 使 saxs 与其他结构技术相比是一种相对便宜的分析方法。此外, saxs 与尺寸排除色谱相结合, 变得越来越普遍, 这提供了一个额外的质量控制步骤。最近, 使用集成优化方法 (eom)45、46来阐明柔性系统的核磁共振和 saxs 数据的组合有了很大的进展。在 mertens 和 svergun47最近的一篇论文中, 作者描述了最近 eom saxs 与核磁共振的多个例子, 以及与 nmr 结合使用的许多其他 saxs 数据的例子。在 saxs 领域不断取得进展, 并正在开发新的技术, 以便将 saxs 与其他结构技术结合使用, 而不仅仅是对其他结构技术的补充。因此, 我们认为, 随着时间的推移, 对 saxs 的需求只会增加, 特别是与 nmr 一起描述由灵活性定义的动态系统。

细胞包含复杂的蛋白质网络, 作为分子机器来执行细胞功能, 如信号级联和保持结构完整性。这些不同成分在三维空间中移动和相互作用的方式产生了大分子的特定功能。蛋白质结构、动力学和相互作用在确定功能方面的重要性提供了不断发展的复杂技术来衡量这些特性的必要性。其中, 核磁共振 (nmr)、x 射线晶体学 (xrc) 和最近, 冷冻电子显微镜 (cem) 提供了高分辨率的结构信息。然而, xrc 和 cem 的产量结构是许多生物分子状态之一, 缺乏有关蛋白质结构动力学的信息, 而核磁共振的三维结构测定通常仅限于较小的球状蛋白质。克服这些限制的一种方法是利用小角度 x 射线散射 (saxs) 生成大型、多域或复杂系统的分子包络, 并结合高分辨率刚性大分子结构来阐明全局结构和动态功能。
saxs 生产的大分子复合物低分辨率包络, 分辨率约为 10-20 1 , 不仅可以深入了解该复合物所显示的结构, 还可以了解该复合物所显示的动态特性。尽管 saxs 利用 x 射线来揭示分子结构, 但与 xrc 不同的是, 溶液中粒子的随机各向同性方向不会导致衍射, 而是导致散射, 从而不能产生原子分辨率。相反, 大分子的电子 "包络" 被产生, 代表大分子所显示的构象的平均值。这些信息可用于直接拟合先前求解的原子分辨率结构, 以推断单个蛋白质或亚单位组织中的柔性区域, 或在更大的多蛋白质复合体中的动力学。saxs 数据是在使用高能单色 x 射线的同步加速器或从内部来源收集的, 这些数据提供的 x 射线源较弱, 需要数小时而不是几秒钟的样品曝光时间 (图 1)。saxs 数据通常通过一个实验设置和缓冲区从多个样本中收集, 需要更长的时间来收集系统上的一轮有用数据。因此, 根据可验证的质量控制方法 (如动态光散射 (dls) 和/或分析超离心 (auc) 分析), 样品应至少稳定且连续几个小时不聚合, 以获得高质量的 saxs 数据2,3. 在这里, 我们提供了 saxs 的实用描述、其使用原理、优点、局限性和样品制备, 并重点关注数据收集和分析, 同时简要介绍了使用以细胞外基质蛋白 nidogen-1 和层压蛋白γ-1 为实验实例。
saxs 的原则、优点和限制:
saxs 背后的指导原则相对简单: 有关大分子单分散制备的溶液被放置在毛细管内, 并暴露在高能单色 x 射线束中。光子使原子壳的电子开始振荡, 导致球波发出相同的能量和波长。由于每个电子都会振荡, 因此将获得一个恒定的背景, 并将产生的大分子的电子密度与背景进行对比。由此产生的散射强度被收集为散射角的函数, 2 (图 1)。
虽然 xrc、nmr 和 cem 等其他技术提供了原子级别的结构信息, 但 saxs 有多种其他技术无法提供的好处。saxs 几乎可以在任何缓冲器中执行, 不需要任何特殊的样品制备。这对于研究大分子在不同条件下的行为和结构尤其重要, 例如存在或不存在单价或二价阳离子或 ph 值 4,5的变化。saxs 有能力提供有关大分子6的灵活区域的信息, 这是其他列出的技术可能难以理解的。因此, saxs 可以作为一种强大的辅助技术, 使用 xrc、nrm 或 cem 对高分子的稳定部分进行研究, 并使用 saxs 对整个高分子或复合物进行低分辨率分析, 并使用各种分析工具进行组合, 例如作为 foxsdock7或 crysol8。由于 saxs 是一种求解技术, 因此它经常被用来确认静态结构 (如从 xrc 获得的静态结构) 在解决方案6中是否一致。saxs 还具有这样一种优势, 即需要相对较少的样品投资 (通常为 50-100μl) 和相对较小的实验时间 (30分钟--小时) 的技术。
saxs 最大的限制是容易受到样本聚合和/或降解的影响, 这可能导致不正确的结构预测。聚合, 即使低至 5%, 也会非常大地散射光, 从而导致高估最大粒子尺寸 (d最大值) 和旋转半径 (rg)。另一方面, 样品降解会导致分子特性的低估。soxs 是一种平均技术, 这意味着样品均匀性对于实现可靠且可重现的结果至关重要, 因此会产生此漏洞。因此, saxs 要分析的任何样品都应经过多种纯化和均匀性检查方法, 如变性和原生凝胶电泳、尺寸排除色谱、动态光散射和分析超离心。通常情况下, saxs 波束线将通过高效液相色谱运行样品, 作为 saxs (s-saxs)3,9之前的最终质量控制步骤。saxs 数据应在多个浓度下收集, 并应比较每个数据集的rg, 以确保密切的相似性, 避免粒子间的相互作用和聚集, 从而导致粒子的高估尺寸, 导致不准确的数据分析和建模。由于散射取决于浓度和大小, 较小的大分子可能需要更具体的浓度范围优化。这是由于互惠定理, 大尺寸向小角度散射, 小尺寸向大角度散射。这体现在数据收集中, 其中 i o 与 r6成正比, 其中 r 是粒子半径。saxs 的最后一个限制是在照射过程中对样品造成辐射损害的可能性, 这可能导致数据失真。最好的做法是比较 sax 样品曝光前后的样品质量, 以确保不会发生这种情况。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>HEK 293 EBNA Cell Line</td>
			<td>In-Lab availability</td>
			<td>-</td>
			<td>Cell line used to overexpress protein(s)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni Sepharose High Performance histidine-tagged protein purification resin</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17524801</td>
			<td>Affinity protein purification resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 Increase 10/300</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28990944</td>
			<td>SEC Column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;KTA Pure FPLC</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>-</td>
			<td>FPLC System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>-</td>
			<td>Spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic Reagents (NaCl, Tris-HCl etc.)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S-MAX3000</td>
			<td>Rigaku</td>
			<td>-</td>
			<td>SAXS Pinhole Camera System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer Nano-S</td>
			<td>Malvern Instruments Ltd</td>
			<td>-</td>
			<td>Dynamic Light Scattering instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1&#181;m Filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>JVWP04700</td>
			<td>Used to Concentrate Sample Prior to DLS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin cleavage kit</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab207000</td>
			<td>Thrombin cleavage to remove His tag</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strep-Tactin Sepharose Column</td>
			<td>IBA</td>
			<td>2-1201-010</td>
			<td>Strep-Tag Affinity Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-desthiobiotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>533-48-2</td>
			<td>Elution of Strep Tag Protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAXGUI</td>
			<td>Rigaku</td>
			<td>-</td>
			<td>Data Collection for SAXS and data reduction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATSAS Suit</td>
			<td>Franke et al., 2017</td>
			<td>-</td>
			<td>SAXS Data Analysis Software program suite</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRIMUS</td>
			<td>Konarev et al., 2003</td>
			<td>-</td>
			<td>Buffer Subtraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GNOM</td>
			<td>Svergun, 1992</td>
			<td>-</td>
			<td>Rg, Dmax and p(r) Calculation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAMMIF</td>
			<td>Franke and Svergun, 2009</td>
			<td>-</td>
			<td>Ab initio model calculation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAMAVER</td>
			<td>Volkov and Svergun, 2003</td>
			<td>-</td>
			<td>Averaged Solution Conformation calculations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MONSA</td>
			<td>Svergun, 1999</td>
			<td>-</td>
			<td>Simultaneous model fitting for the complex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GASBOR</td>
			<td>Svergun et al., 2001</td>
			<td>-</td>
			<td>Alternative Ab initio model calculations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTS Software V6.20</td>
			<td>Malvern Instruments Ltd</td>
			<td>-</td>
			<td>DLS supplied instrument software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyMOL</td>
			<td>Schrodinger, LLC.</td>
			<td>-</td>
			<td>The PyMOL Molecular Graphics System V2.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Protein Data Bank</td>
			<td>Berman et al., 2000</td>
			<td>-</td>
			<td>PDB ID: 1NPE</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

structural studies of macromolecules in solution using small angle x-ray scattering

涉及具有多个球状域的蛋白质-蛋白质相互作用, 为确定这些复合物的形成方式以及这些领域的定位提出了技术挑战。本文介绍了一种具有阐明特定域通过从一开始就通过建模来调节多组分系统中相互作用的协议。提供了一种计算大分子及其组件溶液结构的方法, 该方法包括以混合方法将小角度 x 射线散射 (saxs)、色谱和原子分辨率结构的数据集成在一起。一个具体的例子是全长 nidogen-1 的复合体, 它组装细胞外基质蛋白, 形成一个延伸的、弯曲的纳米结构。其球状域之一附着在层流γ-1 上, 层流蛋白γ-1 结构着基底膜。这为确定柔性多域蛋白质复合物的精确结构提供了基础, 并通过同步加速器源与自动化机器人和尺寸排除色谱系统相结合进行了支持。这种组合允许快速分析, 在 saxs 数据收集之前, 多个寡聚状态被分离。该分析得出了旋转半径、粒子尺寸、分子形状和跨域配对的信息。给出了通过拟合组分蛋白的高分辨率结构生成复合物三维模型的方案。

利用上述数据分析方法, 利用p(R) 函数计算了 nidogen-1、层压蛋白γ-1 及其复杂度的rg 和 d最大值 。我们分别得到了 7.20 (±0.10) nm、8.10 (±0.20) nm 和 10.9 (±0.4) nm 的rg 值, 分别为γ-1、层流γ-1及其复合物 (图 2a-b)。此外, 还分别得到了 nidogen-1、层流中γ-1 及其复合物 (图 2) 10 的d最大值为 24 nm、26 nm 和 35 nm。采用 laminin 程序获得了 nidogen-1 和层压蛋白γ-1 的低分辨率结构, 表明两种蛋白质在溶液中均采用扩展形状。nidogen-1 (~ 1 和 0.8) 和层压蛋白γ-1 (分别约0.9 和 0.8) 的x和 nsd 值也在可接受的范围内。高分辨率结构 (nidogen-1 两个域和层流蛋白γ-1 两个域) 对其使用 saxs 获得的低分辨率结构进行了对齐, 从而能够识别其 n 端和 c 端区域10。
Nidogen-1 被确定为层流中γ-139,40的相互作用伙伴, 并利用 x 射线晶体学将相互作用位点绘制到 c 端子域 41。然而, 高分辨率结构只涉及相互作用的领域, 而不涉及全长 nidogen-1 或整个层流γ-1 臂。因此, 我们纯化了一个含有 nidogen-1 (全长) 和层流γ-1 臂的复合物, 以确定相互作用的区域, 并研究这两种蛋白质的 n 端域的相对方向。该复合体的 saxs 数据产生了 10.9 (±0.4) nm 的rg 和35 nm的 d 最大值。我们利用联氨和安全局获得了整个复合体的低分辨率结构, 这表明, 事实上, 只有这两种蛋白质的 c 端区参与介导的相互作用, 而其余的领域之间的距离很远 (图 3,视频 1)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58538/58538fig1.jpg"> 图 1.saxs 设置的原理图。制备了生物分子或其配合物的单分散制剂, 然后用高能 x 射线照射。根据来源 (例如, 内部与同步加速器), x 射线的能量和样品到源距离可能会有所不同。x 射线的散射模式 (取决于生物分子的大小和形状) 被记录并径向平均, 以获得一个一维的图形 (1d), 其中包含散射光相对于散射角的强度信息。由于缓冲分子也散射光, 这些分子的贡献被减去, 以获得一个散射模式的生物分子的利益。在同步加速器, 在 saxs 数据收集之前, 通常还使用在线尺寸排除/高性能色谱的额外纯化步骤 (顶部视图)。这一步对于去除任何聚合和/或降解的产品以及从复合物中去除任何未绑定的生物分子至关重要。将一维散射图转换为电子对距离分布图 (p(r) 图), 该图提供了生物分子的旋转半径和最大粒子尺寸。此图用作自始建模包 (即dammin/dammif) 的输入文件, 以获得生物分子的低分辨率结构, 或其他包 (即sasref/coral), 如果部分的高分辨率结构该复合体的生物分子或单个生物分子是已知的。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58538/58538fig1large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58538/58538fig2.jpg"> 图 2.(a) 散射光强度与散射角的图 (q = 4 sin,mn-1), 表明生物分子的生物分子 (低区域) 和形状 (高区域) 的质量。(b) 从散射数据中确定的电子对距离分布 p (r) 表明正在研究的生物分子呈拉长的形状 (层叠层 in γ-1、nidogen-1 及其复合物)。(c) 克拉特基图表明, 尼多根-1 和层压蛋白γ-1 蛋白没有展开。(d) 尼多根-1、层压蛋白γ-1 及其复合物的 laminin 图, 表明利用低散射角数据确定旋转半径的线性区域。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58538/58538fig2large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58538/58538fig3.jpg"> 图 3.利用 monsa 程序对合并数据集进行分析, 得到了 nidogen-1 复合物的低分辨率结构和层压蛋白γ-1。配色方案与图 2相同。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58538/58538fig3large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Movie 1" src="/files/ftp_upload/58538/58538movie1.jpg"> 视频 1。尼多根-1 和层压蛋白γ-1 复合物的低分辨率结构。这部电影是用 pymol 制作的, 目的是可视化该综合体的各种结构特征。层压-尼多根复合物 (pdbid:1npe) 的晶体结构显示为带状卡通片, 突出了该复合物的相互作用点。配色方案与图 2相同。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58538/complex_movie.mpg" target="_blank">请点击这里观看此视频。(右键单击下载.</a>

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Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering

在这里, 我们介绍了如何利用小角度 x 射线散射 (saxs) 来获取代表大分子结构的低分辨率信封的信息。当与 x 射线晶体学和核磁共振等高分辨率结构技术结合使用时, saxs 可以提供对多域蛋白质和高分子复合物溶液的详细洞察。

小角度 x 射线散射溶液中大分子的结构研究

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and ...

该方法有助于回答生物化学领域关键问题，如生物分子的大小、形状和构象变化及其复合物。该技术的主要优点是，在生物分子稳定的环境中，可以在生理相关的缓冲条件下进行实验。SAXS 是许多其他生物物理和结构生物学方法的免费技术。将SAXS与这些方法相结合，可以帮助我们开发基于结构的治疗方法。虽然这种方法可以提供生物分子复合物的见解，它也可以应用于其他系统，如研究纳米部分和药物输送的细胞。通常，对此方法的新鲜用户将难以为之，因为它看起来是一个压倒性而复杂的过程，从原始散射数据到低分辨率结构。此方法的可视化演示至关重要，因为从原始数据获取结构模型的数据分析管道很难学习，因为它涉及使用许多不同的软件包。有几个软件包可用于 SAXS 数据分析。其中包括散射、BioXTAS RAW 和 ATSAS 套件。在此视频中，我们将概述使用 ATSAS 程序套件分析原始 SAXS 数据时要采取的一般步骤。首先，安装并加载 ATSAS 程序套件。打开 PRIMUS/Qt 程序并转到"打开菜单"选项。在这里，选择最多13个感兴趣的数据文件。数据文件必须采用 ASCII 格式，其中第一列为 s 向量轴，第二列为强度。仅对缓冲区数据重复此步骤，将此数据插入第二个"工具"菜单。接下来，导航到"数据处理"窗口并选择"减法"。这将生成一条减去的散射曲线，只表示来自感兴趣的大分子的散射。要执行 Guinier 分析，请从加载到 PRIMUS/Qt 中的缓冲区减去散点曲线开始。接下来单击"回油半径"，该半径将打开普里莫斯吉尼尔向导。此时，将显示显示强度与散射角度平方的自然日志的图。要获得回变的初步半径，请查找"命令提示"窗口并使用 Autorg 函数。按下 Autorg 后，单击上限向上一个，然后向下单击一个以强制程序更新统计测量值。或者，通过单击同一打开提示并选择多个数据文件名称，以与前面描述的相同方式突出显示多个文件，一次输入多个文件。若要开始 Kratky 分析，请单击以选择数据文件名。这将绘制窗口中的数据。然后，选择"绘图"。接下来，在"绘图"按钮下方，单击 Kratky 绘图。因此，球状蛋白质显示GALC-ean峰，而展开的蛋白质将显示高原而不是峰值，类似于类似此处所示的双曲图。负载缓冲器再次减去 PRIMUS/Qt 中每个浓度的数据。在"处理"选项卡下，单击"缩放"并检查每个曲线和 i 刻度编号，该数字与原始样品的稀释相关。检查后，单击"处理"窗口中的"合并"按钮合并数据。要生成距离分布图，请将合并的数据曲线加载到 PRIMUS/Qt 中，然后在"分析"选项卡中单击"距离分布"。调整合并数据的数据范围，以避免原始数据尾部出现任何显著噪声。此外，通过选择较低范围值并增加数字，省略低 q 区域中靠近光束停止的数据点。要确定 Dmax，请从从 Guinier 分析中获得的旋转半径的五倍的范围开始。然后，逐渐降低此值，直到距离分布图在 y 轴上不会突然下降到零，并且在接近零之前没有长尾。检查从吉尼尔近似值派生的陀螺与强度图的实验半径与陀螺强度数的距离分布半径是否相似。在这里，散射光的强度显示与散射角，建议生物分子尼多根-1，层丁伽马-1的质量及其复杂，以及其形状。从散射数据中确定的电子对距离分布表明，生物分子具有拉长的形状，而Kratky图表明，随着数据趋于稳定，甚至更大的q范围增加，并且缺少钟形曲线形状，蛋白质处于折叠状态。此外，Guinier 图使用低散射角的数据，指示用于确定回波半径的线性区域，此处显示了 nidogen-1、层丁伽马-1 及其复杂度。为了研究蛋白质-蛋白质复合物，MONSA用于获得整个尼多根-1层丁伽马-1复合物的低分辨率结构，表明只有两种蛋白质的C-终端区域参与调解相互作用，而其他域彼此相距甚远。不要忘记，使用 Synchrotron 辐射可能非常危险，在进行初始数据收集时，应始终采取每个不同光束线概述的预防措施和安全。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

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结合 x 射线晶体学与小角度 x 射线散射到模型的非结构化区域的 Nsa1 从s 酿酒酵母

Determination of the full-length structure of ribosome assembly factor Nsa1 from Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is challenging because of the ...

科研

生物化学

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

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采用自动结晶耦合原位动态光散射的不同尺寸生长蛋白晶体

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

用 X 射线晶体学和生物物理技术表征免疫球蛋白折叠的糖蛋白

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Contrast-Matching Detergent in Small-Angle Neutron Scattering Experiments for Membrane Protein Structural Analysis and Ab Initio Modeling

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用于膜蛋白结构分析和从头建模的小角中子散射实验中的对比匹配洗涤剂

The biological small-angle neutron scattering instrument at the High-Flux Isotope Reactor of Oak Ridge National Laboratory is dedicated to the ...

Structure Solution of the Fluorescent Protein Cerulean Using MeshAndCollect

利用网格和收集荧光蛋白陶瓷的结构解

X-ray crystallography is the major technique used to obtain high resolution information concerning the 3-dimensional structures of biological ...

Fully Autonomous Characterization and Data Collection from Crystals of Biological Macromolecules

生物大分子晶体的完全自主表征及数据采集

High-brilliance X-ray beams coupled with automation have&#160;led to the use of synchrotron-based macromolecular X-ray crystallography (MX) beamlines for ...

Ion Exchange Chromatography (IEX) Coupled to Multi-angle Light Scattering (MALS) for Protein Separation and Characterization

Ion Exchange Chromatography IEX Coupled to Multi-angle Light Scattering MALS for Protein Separation and Characterization

离子交换色谱 (IEX) 与多角度光散射 (ALS) 相结合, 用于蛋白质分离和表征

Ion-exchange chromatography with multi-angle light scattering (IEX-MALS) is a powerful method for protein separation and characterization. The combination ...

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering SEC-MALS

蛋白质的表征(按尺寸-排除色谱与多角度光散射相结合(SEC-MALS)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

用于大分子 X 射线晶体学的一体式样品支架,具有最小的背景散射

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...