Name: structural studies of macromolecules in solution using small angle x-ray scattering
Uploaded: 2018-11-05T13:00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering at JoVE.com

פרויקט זה בתמיכתם NSERC RGPIN-2018-04994, חדשנות תוכנית הקמפוס אלברטה (RCP-12-002 C), מכון מחקר פריון אלברטה פתרונות ביו מחדשת של אלברטה (201600018) מענקים על שיטת הפעולה TRP זה כיסא מחקר קנדה ב- RNA & ביופיזיקה חלבון (201704) ובהיותו גילוי NSERC גרנט (RGPIN-2017-04003). TM ממומן על ידי מענק גילוי NSERC TRP.

1. SAXS לטעום הכנה ורכישת נתונים
<ol><li>הכנת הדוגמא:<ol>
<li>ניסויים SAXS דורשים דגימות חלבון הומוגנית, יציבה, ללא צבירה; צפו יציבות המדינה oligomeric עם גודל אי-הכללה של כרומטוגרפיה (S), DLS ו/או חאן אל לפני איסוף נתונים.</li>
		<li>נושא דגימות (nidogen-1 ו- laminin γ-1 במקרה זה) ועד ניתוח DLS tricine מרחביות-דף להמחיש מדגם טוהר10. הערה: דגימות עשוי לכסות טווח הריכוזים (1-4 מ"ג/מ"ל) בהתאם לגודל שלהם, התנהגותם פתרון כגון האגודה עצמית וצבירת יחד עם יציבות; . חמש ריכוזי nidogen-1, (139 kDa), שלוש laminin γ-1 (109 kDa) וארבע של המתחם equimolar S-טיהור הוכנו כמו שתואר לעיל10.</li>
	</ol>
</li>
	<li>איסוף הנתונים:<ol>
<li>איסוף נתונים SAXS באמצעות מערכת פנימית או סינכרוטרון, בהתאם להנחיות היצרן או מתקן. הערה: הנתונים המשמשים בעבודה זו נאסף באמצעות המערכת ללא צורך במיקור חוץ (ראה טבלה של חומרים) המכילה 3-pinhole המצלמה מצויד + microfocus 002 אטום צינור (קרינה Cu Kα-1.54 Å) ואופטיקה קונאפוקלית מקס השטף (CMF) פועלים ב 40 W. המערכת מצויד גם עם 200 ננומטר האזנה מרובה 2D גלאי עבור איסוף נתונים. עם זאת, עם הזמינות של synchrotrons מודרני ב צרפת, גרמניה, בריטניה, ארה ב, ומדינות נוספות, המספקות גישה הגדרת S-SAXS אשר מקלה על ההפרדה של הכנה monodispersed של צבירת אפשרי/השפלה, אנחנו עכשיו באופן שגרתי איסוף נתונים סינכרוטרון מתקנים. מאמר שפורסם לאחרונה הדי ג'י-quadruplex11 הוא דוגמה של אסטרטגיית אוסף נתונים S-SAXS. במקרה זה, הנתונים SAXS נאספו בטווח של עד 0.08 q ≤ 0.26 Å במשך 3 שעות nidogen-1 (2.0, 2.5, 3.0, 3.5 ו 4.0 מ"ג/מ"ל); ה-laminin γ-1 (1.5, 2.0 ו- 2.5 מ"ג/מ"ל) ומורכב שלהם (0.8, 1.0, 1.25 ו- 1.5 mg/mL).</li>
		<li>להפחית את הנתונים עבור מאגר ודוגמאות באמצעות תוכנת עיבוד ספציפיים למערכת. להחסיר את התרומה מאגר נתונים חלבון באמצעות תוכנית כמו פרימוס/qt12 (איור 2 א).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. ניתוח נתונים
הערה: כיום יש כמה חבילות תוכנה שימושיים עבור ניתוח נתונים של SAXS: ScÅtter43 (הורד זמין במלון www.bioisis.net), bioXtas גלם44ו- סוויטת ATSAS13. סעיף זה מספק מבט כולל על שלבים כלליים שיש לנקוט בעת ניתוח SAXS גלם נתונים באמצעות ATSAS את תוכנית סוויטת צעדים ספציפיים לקוחים את ATSAS 2.8.1 להוריד. תוכניות אחרות יכול לשמש, בקצרה נידונות מאוחר יותר.
<ol><li>מאגר חיסור הערה: השלבים הרלוונטיים עבור דגימות SAXS סטטי בלבד.<ol>
<li>בחר את אפשרות התפריט 'פתח' פרימוס/qt, בחר את קבצי הנתונים של עניין. להיות מודע כי נתוני הקבצים להיות בתבנית ASCII, שבה העמודה הראשונה הוא הציר s-וקטור, העמודה השניה ויש העוצמה. חזור על שלב זה עבור הנתונים שנאספו עבור מאגר עצמה על-ידי הוספת הנתונים באותו התפריט.</li>
		<li>בחר "חיסור" בחלון עיבוד נתונים, אשר יפיק עקומת פיזור החיבור המייצג רק פיזור מקרומולקולה עניין. חזור על שלב זה עבור כל הריכוז.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ניתוח Guinier<ol>
<li>כדי לבצע ניתוח Guinier, טען עקומת פיזור מאגר המופחת פרימוס/qt כפי שתואר קודם לכן בשלב 2.1.1.</li>
		<li>לחץ על "רדיוס של רגע" אשר ימשיך לפתוח את אשף Guinier פרימוס; מגרש של ln(I) לעומת q2 יוצגו.</li>
		<li>כדי להשיג ראשוני Rg להשתמש בפונקציה "AUTORG", אשר נבנה מודול חיצוני לחיפוש פרימוס/qt. על כפתור "Autorg" ואז לחץ עליו פעמיים.</li>
		<li>קלט קבצים מרובים בו-זמנית על-ידי סימונם כל והכנסת אותם לתוך התפריט בצד ימין, דומה מאוד 2.1.1.</li>
		<li>השתמש העלילה Guinier יצר קודמת כדי להעריך את איכות הנתונים; הקו הירוק תחת העלילה Guinier מציג את העלילה תמלוגים המייצג של ליניאריות של התאים. להיות מודע כי אי-ליניאריות בניתוח Guinier יכול להיות סימן של מצבור לדוגמה, ניתוח נוסף לא לבצע במקרה זה. הערה: התאמה לינארית Guinier נותן של Rg עם טעות קטנה (< 5%) ומציעה דגימה באיכות גבוהה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ניתוח Kratky<ol>
<li>לטעון את הנתונים ניתן לאבחן באופן דומה כפי שתואר לעיל.</li>
		<li>לחץ על "בחר בתיבת" לצד שם קובץ הנתונים. זה להתוות את הנתונים בחלון נפרד.</li>
		<li>לחץ על לחצן "עלילה" ואחריו ""מזימה Kartky"בחירה בתפריט הנפתח.</li>
		<li>זה להתוות את הנתונים כמו "קיו2 x vs L(q) q". שימו לב כי חלבונים הכדוריים להציג לשיא לפי עקומת גאוס, בעוד חלבונים פרש להציג רמה במקום לשיא ומזכירים את העלילה היפרבולי17.</li>
	</ol>
</li>
	<li>מיזוג נתונים<ol>
<li>מאגר עומס המופחת נתונים עבור כל ריכוז פרימוס/qt שוב, כמו שלב 2.1.1.</li>
		<li>כדי למזג את הנתונים, פשוט לחץ על לחצן "מיזוג" בחלון עיבוד.</li>
		<li>לבדוק כל עקומה ואני את סולם מספר, לאפקטים דילולים זני המדגם המקורי. הערה: דגימות-ריכוז גבוה יותר להציג פחות רעש באזור הזנב של העקומות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>P(r) הפצה<ol>
<li>כדי להפיק את העלילה P(r), לטעון את הנתונים הממוזגים העקומות לתוך פרימוס/qt כאמור תיאר.</li>
		<li>לחץ על לחצן "מרחק הפצה" כדי לפתוח חלון חדש המציג את הנתונים הממוזגים של עוצמת פזורים אור לעומת q וזוג-המרחק הפצה הפונקציה plot בצד ימין. הערה: המידע בצד ימין מציג את האיכות הכוללת של חישובים פונקציית התפלגות זוג-המרחק.</li>
		<li>התאם את טווח הנתונים הנתונים הממוזגים כדי למנוע רעש משמעותית בקצה הזנב של הנתונים הגולמיים.</li>
		<li>להשמיט נקודות נתונים בקרבת התחנה קרן באזור נמוך-q.</li>
		<li>כדי לקבוע את ההתחלה Dmax, עם מגוון של 5 פעמים ~ Rg המתקבל הניתוח Guinier. בהדרגה להקטין את הערך עד העלילה P(r) אינה ירידה בבת אחת אפס בציר ה-y ואין לו סירה ארוכת־זנב בטרם הם פונים אל אפס.</li>
		<li>בדוק כי ניסיוני Rg/אני0 (נגזר Guinier קירוב) ו- P(r) Rg/אני0מספרים דומים. הערה: במקרים מסוימים, בהמשך מניפולציה על הטווח של נתונים, נקודות נתונים אלפא (ההסדרה פרמטר אשר מספרת התוכנית על היחס של כמה תשומת לב מוקדשת את החלקות של ההתפלגות בהשוואה התאמת המידע מהניסוי) נמצא גם נדרש21 כדי לקבל מגרש P(r) באיכות טובה.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3.b initio חרוז מידול, בממוצע
<ol><li>לאחר מיזוג הנתונים שנאספו בריכוזים מרובים, או הנתונים שנאספו באמצעות S-SAXS הוא ממוזער, מגרש Kratky, P(r) העלילה וניתוח Guinier אומתו, לחשב מבנים ברזולוציה נמוכה של מקרומולקולות, מתחמי שלהם. צינור זה יכול לשמש כדי ללמוד פתרון מבנים ואינטראקציות של חומצות גרעין, חלבונים, חומצות גרעין-חלבון או חלבון מתחמי10,11,21,22,23 ,24,25,26,27,28,29,30,31,32 33, ,34. אחת התוכניות הפופולריות ביותר היא DAMMIN, שפותחה על ידי Svergun35 , וחלק ATSAS החבילה13, אשר מעסיקה פרוטוקולים מחזק מדומה עם מידע ראשוני קלט על Rg ו- Dmax . Ab initio דוגמנות גישות ועקרונות מתוארים ב פירוט במקום18,36.</li>
</ol>

לעורכים יש אין גילויים להכריז.

השלבים הקריטיים של ניתוח נתונים SAXS המתוארים בסעיף פרוטוקול זה נייר כלול מאגר חיסור, Guinier ניתוח, ניתוח Kratky, מיזוג נתונים והפצה P(r). הדגמים חרוז ab initio מדי נרחב מכוסה כאן בפירוט, לכן רק מכוסה בקצרה.
ב- synchrotrons (למשל דזי בגרמניה, יהלום בבריטניה, ESRF בצרפת), זה אפשרי לאיסוף נתונים SAXS עבור חלקיק קטן מאוד (~ µL כמה) של כל מדגם כשברים להיות eluted מהעמודה זה מחובר בשורה (ראה איור 1 ). הנתונים SAXS elastically פזורים הוא בממוצע בצורה רדיאלית באמצעות החבילות המסופקים על ידי היצרן מכשיר או את סינכרוטרון לפני מאגר חיסור יכול להתקיים. הנתונים המתקבלים 1D מייצג את כמות האור מפוזר (ב אני(q)) ב- Y-ציר והזווית פיזור (q= 4πsinθ/λ, איפה λ הוא אורך הגל של האירוע X-קרני), המותווה באיור1. התוכנית פרימוס/qt12 משמש להפחתת ישירות איזשהו רקע עקב מאגר, המתוארת בסעיף 1.1. תוכניות אחרות כגון; ScÅtter43 (הורד זמין במלון www.bioisis.net) עם ערכת לימוד זמינים ב https://www.youtube.com/channel/UCvFatdC5HcZOLv6OSjblfeAוב bioXtas גלם44 (https:// לרשותכם bioxtas-raw.readthedocs.io/en/Latest/index.html) יכול להיות מנוצל כחלופה החבילה ATSAS.
הניתוח Guinier מספק מידע על צבירת מדגם הומוגניות וכן מתן רדיוס של רגע (Rg) מקרומולקולה עניין בהתבסס על הנתונים SAXS מכל אזור נמוך s 14. מגרש נבנה עם פרימוס/qt עבור נתונים SAXS המתקבל בכל ריכוז, ואחריו עקומה פולינומיאלית עם הטווח המרבי של עד 1.30 עבור q x Rg. הכנת הדוגמא monodispersed צריך לספק מגרש Guinier ליניארית באזור זה (איור דו-ממדי), ואילו צבירת תוצאות ב Guinier לא לינארית מגרש15,16. אם הניתוח Guinier הוא ליניארי, מידת "unfoldedness" של מקרומולקולה עניין יכול להיות שנצפו עם העלילה Kratky, אשר הוא שימושי כאשר מחליטים לבצע דוגמנות של גוף קשיח או לבנות הרכבים של מודלים ברזולוציה נמוכה. חלבון הכדוריים יופיעו Kratky העלילה יש עקומת פעמון, ואילו מורחב מולקולות או פפטידים פרש יופיעו מישור או אפילו להגדיל בטווח q גדול, חסר הצורה בל (איור 2C).
קבלת את Rg מניתוח Guinier רק מחשיבה נקודות נתונים מאזור נמוך q של העלילה פיזור 1 י (איור דו-ממדי), זאת, אפשר להשתמש כמעט את כל הנתונים (dataset) כדי לבצע שינוי צורה עקיפה של פורייה כדי להמיר את מידע הדדיים-שטח של ln (I (q)) לעומת (q) מרחב אמיתי מרחק פונקציית ההתפלגות (P(r)) אשר מספק מידע על Dמקס ו- Rg (איור 2B) הצורה של העלילה P(r) מייצג את קונפורמציה פתרון דוחה מקרומולקולה של עניין18,19. ההמרה של נתוני הדדיים-החלל לנתוני אמת-שטח הוא שלב קריטי אך תיאור מפורט אינו בתוך הטווח של מאמר זה. לכן, עיין מאמר מאת Svergun20 להבין כל פרמטר.
ברגע המופחת למאגר נתונים בריכוזים בודדים מעובד באמצעות ניתוח Guinier עם ערך עקבית עבור Rg, ואחריו חוקרים דפוס קיפול שלהם באמצעות ניתוח Kratky, ניתן למזג נתונים אלה. הנתונים הממוזגים nidogen-1 laminin γ-1, מתחם שלהם עובדו כמתואר לעיל, P(r) וכתוצאה מכך מתווה מוצגים איור 2B. באופן אידיאלי, אחד צריך גם לחשב את פונקציית ההתפלגות של זוג-המרחק P(r) עבור כל ריכוז כדי לקבוע אם SAXS הנתונים שנאספו עבור כל ריכוז מספק דומה Rg וערכי Dmax . אם Rg Dmax נותרו דומים בטווח רחב של ריכוזים, ואז המשתמש צריך להמשיך. יצוין כי בהתאם האות, נתונים יכול להיחתך לפני מיזוג הנתונים. לעתים קרובות זהו המקרה אם ריכוז ו/או המשקל המולקולרי של מקרומולקולות תחת חקירה של נמוכה.
ניתן לבצע ניתוח צורה ברזולוציה נמוכה באמצעות DAMMIN מצבים שונים (למשל מהיר, איטי, מצבי מומחה, וכו '). מצב מהיר הוא שלב ראשון אידיאלי כדי להעריך אם העלילה P(r) מספק איכות טובה מודלים. בדרך כלל, לפחות 10 דגמים צריכה להתקבל לכל מגרש P(r) לבדוק אם מתקבלים תוצאות לשחזור, מבחינת המבנה ברזולוציה נמוכה, עם מחווה נמוכה של פרמטר מתאים שנקרא χ (ערך של 0.5-1.0 נחשב טוב מבוסס על העבודה הנרחב שלנו ), ערך המתארת הסכם בין הנתונים שנאספו השפעול SAXS נגזר מודל הנתונים. לצורך פרסום, אנו בדרך כלל להשתמש במצב איטי או מומחה, לחשב לפחות 15 דגמים. בנוסף DAMMIN, גירסה מהירה יותר של זה, DAMMIF37, כמו גם GASBOR38 הם גם חלופות. יתר על כן, ללמוד חלבון או חלבון-nucleic מתחמי חומצה, זה ניתן להשתמש MONSA תוכנית35, המאפשרת התאמה בו זמנית של הנתונים SAXS בודדות הן מקרומולקולות, כמו גם מתחם שלהם. לקבלת פרטים נוספים על החישובים דגם ברזולוציה גבוהה גם ללימודי אינטראקציית חלבון ה-RNA, עיין מאמר מאת פאטל ואח3.
SAXS היא תיאורטית פשוטה אבל ללא ספק שיטה משלימה ביותר תוצאות נתונים מבניים ברזולוציה נמוכה, בהם ניתן להשתמש בכוחות עצמו או בשילוב עם טכניקות ברזולוציה גבוהה להבהיר מידע וכלים אחרים ביולוגיה מבנית על מבנה macromolecular ואת הדינמיקה. כל עוד ניתן להשיג monodispersed הכנה של מקרומולקולות, מתחמי שלהם, SAXS יכול להיות מנוצל כדי ללמוד בפתרון מבנה ואינטראקציות של כל סוג של מקרומולקולה ביולוגי. במקרה של המתחם שנדונו כאן, זה מדהים זה פחות מ-10% על פני השטח הכולל הנגיש של חנקן-1 ו- laminin γ-1 קבור במתחם הזה, ואילו שאר התחומים של שני חלבונים נגישים באופן חופשי לקיים אינטראקציה עם אחרים חלבונים-מטריצה חוץ-תאית כדי לשמר את קפדנותה מבניים (איור 3). קבלת מידע כזה עבור מתחם עם ~ 240kDa יהיה מאוד מאתגר באמצעות טכניקות טיפול נוספות ביולוגיה מבנית קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן NMR, מיקרוסקופיה הקפאה-EM.
חשיפת מבנה החלבון באמצעות קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן או NMR היא תהליך מטבעו גוזלת זמן. זה צוואר בקביעת מבנה זה תחום אחד שבו SAXS מראה את עוצמתה כמו טכניקה מבניים; חדרי קירור והקפאה עבור ניסוי SAXS יחיד יכול לקחת פחות משעה, בעזרת ניתוח יעיל תוכנה, ניתוח יכול להיעשות במהירות וביעילות. SAXS יש פוטנציאל להגדיל באופן משמעותי את התפוקה של מחקרים מבניים כמו טכניקה עצמאית כי הוא מציע מודל ברזולוציה נמוכה של המבנה macromolecular לפני נתונים ברזולוציה גבוהה זמינה. מחסום טכניקות מבניות אחרות היא הדרישה מדגם מאוד טהור, מרוכז עבור ייבוא נתונים, אשר מחייבת רמה גבוהה של חלבון ביטוי ויציבות על פני תקופה ארוכה של זמן. בעוד SAXS דוגמאות גם צריך להיות טהור ומרוכז, אמצעי האחסון מדגם הם בערך 100 µL שהופך SAXS שיטה זולה יחסית של ניתוח לעומת טכניקות מבניות אחרות. יתר על כן, SAXS יחד עם גודל אי-הכללה של כרומטוגרפיה הופך להיות נפוץ יותר ויותר אשר מספק צעד בקרת איכות נוספים. לאחרונה חלה ההתקדמות חזק השילוב של נתונים NMR, SAXS באמצעות45,את שיטת אופטימיזציה אנסמבל (לבחירות)46 התירי מערכות גמיש. בעיתון זה התבצעה על ידי מרטנס ולא Svergun47, המחברים מתארים מספר דוגמאות לבחירות SAXS בשילוב עם NMR, יחד עם דוגמאות רבות אחרות של נתונים SAXS בשימוש בשילוב עם NMR האחרונות. ההתקדמות נעשים ללא הרף בשדה של SAXS, טכניקות חדשות מתבצעת שפותחו עבור SAXS לשמש בשילוב עם, לא רק מחמאה, טכניקות מבניות אחרות. כתוצאה מכך, אנו מאמינים כי הביקוש SAXS רק יגביר לאורך זמן, במיוחד בשילוב עם לאפיון מערכות דינאמיות איפה פונקציות מוגדרות על-ידי גמישות NMR.

התאים מכילים רשתות מורכבות של חלבונים שפועלים למכונות המולקולריות כדי לבצע פונקציות הסלולר כגון איתות cascades ושמירה על שלמות מבנית. הדרכים שבה מרכיבים שונים אלה לנוע ולתקשר במרחב תלת הולידה פונקציות ספציפיות של מקרומולקולות. החשיבות של מבנה החלבון, דינמיקה, אינטראקציות בקביעת פונקציה סיפק את הצורך טכניקות המתפתחת ללא הרף, מורכבים למדידת תכונות אלו. אלה, תהודה מגנטית גרעינית (NMR), קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן (XRC) ועוד לאחרונה, הקפאה-אלקטרון מיקרוסקופ (CEM) לספק נתוני מבנה ברזולוציה גבוהה. אולם, XRC ו CEM תשואות מבנים של אחת המדינות למערכות ביולוגיות רבות, חוסר מידע אודות הדינמיקה של מבנה החלבון, תוך קביעת מבנה תלת-ממדי על ידי NMR מוגבל בדרך כלל קטן יותר הכדוריים חלבונים. דרך אחת כדי להתגבר על מגבלות אלה היא לנצל את קטן זווית צילום רנטגן פיזור (SAXS) כדי ליצור מעטפות המולקולרי של מערכות גדולות, וחשבונות ומורכבת או, ולשלב את המבנים macromolecular נוקשה ברזולוציה גבוהה התירי העולמי אדריכלות ותכונות דינמי.
SAXS מייצר מעטפות ברזולוציה נמוכה של מתחמי macromolecular עם רזולוציה של 10-20 Å 1, נותן תובנה לא רק לתוך המבנה, אלא גם את מאפייני דינמי המציג המתחם. למרות SAXS מנצל רנטגן כדי לחשוף את המבנה המולקולרי, זה בניגוד XRC בכך כיוון איזוטרופיות אקראי של החלקיקים בתמיסה אינו מוליד עקיפה, אלא מעדיף פיזור, אשר לא יכול להניב ברזולוציה אטומית. במקום זאת, אלקטרון "מעטפת" מקרומולקולה נוצר מייצג ממוצע של הצורות המציג מקרומולקולה. מידע זה יכול לשמש ישירה ההתאמה של מבנים ברזולוציה אטומית פתור בעבר להסיק מחוזות גמישות חלבון יחיד או יחידת משנה בארגון, או דינאמיקה של מתחם גדול יותר חלבון רב. SAXS נתונים נאספים synchrotrons שימוש באנרגיה גבוהה רנטגן מונוכרומטי או ממקורות ללא צורך במיקור חוץ, אשר מציעים מקור רנטגן חלש יותר הדורשים שעות ולא שניות של המדגם זמן החשיפה (איור 1). SAXS נתונים נאספים לעתים קרובות מדגימות מספר עם הגדרת הניסוי יחיד, מאגר, הדורשים זמן ממושך כדי לאסוף את סיבוב של נתונים שימושיים במערכת. דוגמאות, לכן, להיות ויציבה ללא צבירה לפחות לכמה שעות המבוסס על שיטות בקרת איכות לאימות כגון פיזור אור דינאמי (DLS) ו/או ניתוח אנליטי ultracentrifuge (AUC) כדי לקבל נתונים באיכות גבוהה SAXS2 , 3. כאן אנו מספקים תיאור מעשי של SAXS, העקרונות מאחורי השימוש שלה, הטבות, מגבלות, הכנת הדוגמא, המוקד בכבדות על איסוף נתונים, ניתוח, יחד עם נגיעה בקצרה על ab initio מידול בעזרת מטריצה חוץ-תאית חלבונים nidogen-1 ו- laminin γ-1 כדוגמה ניסיוני.
עקרונות, יתרונותיה וחסרונותיה של SAXS:
Principle(s) המנחה מאחורי SAXS היא פשוטה יחסית: פתרון של הכנת monodispersed macromolecule(s) עניין ממוקם בתוך נימי והוא חשוף קרן רנטגן באנרגיה גבוהה מונוכרומטי. חלקיקי האור לגרום אלקטרונים של מעטפת האטום כדי להתחיל נדנוד, וכתוצאה מכך גל כדורית הנפלטת של אותה אנרגיה, אורך הגל. מאז כל אלקטרון נעים, רקע מתמיד תושג, צפיפות אלקטרונים וכתוצאה מכך מקרומולקולה הוא מנוגד לרקע. עוצמת הפיזור וכתוצאה מכך נאסף כפונקציה של זווית פיזור, 2Θ (איור 1).
ואילו טכניקות אחרות כגון XRC NMR, צ'ם לספק מידע מבניים ברמה אטומית, קיימים יתרונות מרובים SAXS טכניקות אחרות לא יכול לספק. SAXS ניתן לבצע כמעט כל מאגר, אינו דורש כל הכנה מיוחדת מדגם. הדבר חשוב במיוחד ללמוד את התנהגות ואת המבנה של מקרומולקולות בתנאים שונים, כגון נוכחות או היעדרות של מונו - או קטיונים דו ערכיים או שינויים ב- pH4,5. SAXS יש את היכולת לספק מידע אודות אזורים גמישים של מקרומולקולה6, משהו טכניקות המפורטים אחרות נאבקות עם. לכן, SAXS יכול לשמש חזקה ללא תשלום טכניקה בחלקים יציב של ישות מקרומולקולה למדה עם XRC, NRM או צ'ם של מקרומולקולה כולו או מורכבות ניתח ברזולוציה נמוכה עם SAXS ושילב באמצעות מגוון כלי ניתוח, כזה FoXSDock7 או CRYSOL8. מאחר SAXS היא טכניקה פתרון, זה משמש לעתים קרובות כדי לאשר אם סטטי מבנים כגון אלו המתקבל XRC יהיו עקביות פתרון6. SAXS יש גם את היתרון של להיות טכניקה הדורשת כמות קטנה יחסית של מדגם ההשקעה (בדרך כלל µL 50-100) ואת כמות קטנה יחסית של זמן הניסוי (30 דקות - 1h).
המגבלה הגדולה של SAXS היא הפגיעות מדגם צבירת ו/או השפלה, אשר יכול להוביל תחזיות מבניים שגוי. מצבור, אפילו המתחילים 5%, יכול פיזור אור בכמויות גבוהות מאוד, המוביל אל הערכה מופרזת של חלקיקים מקסימלי ממד (Dmax), רדיוס עומדים (Rg). מצד שני, דוגמת השפלה יכול להוביל אל תזלזל של תכונות מולקולאריות. פגיעות זו נובע SAXS להיות שיטת חישוב ממוצע רגיל, מה שאומר כי המדגם הומוגניות הוא קריטי להשגת תוצאות אמין לשחזור. דוגמה זו כדי להיות מנותח על ידי SAXS צריך, לכן, עוברים בשיטות מרובות של היטהרות, בדיקות הומוגניות, כגון denaturing, יליד אלקטרופורזה בג'ל, גודל אי-הכללה של כרומטוגרפיה, אור דינאמי פיזור, אנליטיים ultracentrifugation. לעתים קרובות, SAXS beamlines יפעל דגימות באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים כפקד איכות סופית צעד לפני3,SAXS (S-SAXS)9. SAXS נתונים צריכים להיאסף בריכוזים מרובים ו Rg של כל ערכת נתונים להשוות, להבטיח דמיון קרוב כדי למנוע צבירת, ובאמצעי הערכה מופרזת של החלקיקים אינטראקציות interparticle מידות, שמוביל ניתוח נתונים לא מדויקים, מידול. מאז פיזור תלוי ריכוז וגודל, מקרומולקולות קטנים יותר עשויים לדרוש אופטימיזציה יותר ספציפי של טווח הריכוז. זאת בשל משפט ההדדיות, איפה במידות גדולות פיזור לקראת קטן זוויות וגדלים קטן לכיוון בזוויות גדולות. דבר הבא לידי ביטוי באוסף נתונים, אניO איפה פרופורציונליים ל- R6, כאשר R הוא הרדיוס של חלקיקים. מגבלה הסופי של SAXS הוא פוטנציאל נזק הקרינה לדגימת במהלך חשיפה, מה שעלול לגרום לעיוות של הנתונים. . זה תרגול טוב כדי להשוות איכות מדגם לפני ואחרי חשיפה מדגם SAXS כדי להבטיח שזאת אינה מתרחשת...

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>HEK 293 EBNA Cell Line</td>
			<td>In-Lab availability</td>
			<td>-</td>
			<td>Cell line used to overexpress protein(s)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni Sepharose High Performance histidine-tagged protein purification resin</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17524801</td>
			<td>Affinity protein purification resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 Increase 10/300</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28990944</td>
			<td>SEC Column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;KTA Pure FPLC</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>-</td>
			<td>FPLC System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>-</td>
			<td>Spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic Reagents (NaCl, Tris-HCl etc.)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S-MAX3000</td>
			<td>Rigaku</td>
			<td>-</td>
			<td>SAXS Pinhole Camera System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer Nano-S</td>
			<td>Malvern Instruments Ltd</td>
			<td>-</td>
			<td>Dynamic Light Scattering instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1&#181;m Filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>JVWP04700</td>
			<td>Used to Concentrate Sample Prior to DLS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin cleavage kit</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab207000</td>
			<td>Thrombin cleavage to remove His tag</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strep-Tactin Sepharose Column</td>
			<td>IBA</td>
			<td>2-1201-010</td>
			<td>Strep-Tag Affinity Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-desthiobiotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>533-48-2</td>
			<td>Elution of Strep Tag Protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAXGUI</td>
			<td>Rigaku</td>
			<td>-</td>
			<td>Data Collection for SAXS and data reduction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATSAS Suit</td>
			<td>Franke et al., 2017</td>
			<td>-</td>
			<td>SAXS Data Analysis Software program suite</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRIMUS</td>
			<td>Konarev et al., 2003</td>
			<td>-</td>
			<td>Buffer Subtraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GNOM</td>
			<td>Svergun, 1992</td>
			<td>-</td>
			<td>Rg, Dmax and p(r) Calculation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAMMIF</td>
			<td>Franke and Svergun, 2009</td>
			<td>-</td>
			<td>Ab initio model calculation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAMAVER</td>
			<td>Volkov and Svergun, 2003</td>
			<td>-</td>
			<td>Averaged Solution Conformation calculations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MONSA</td>
			<td>Svergun, 1999</td>
			<td>-</td>
			<td>Simultaneous model fitting for the complex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GASBOR</td>
			<td>Svergun et al., 2001</td>
			<td>-</td>
			<td>Alternative Ab initio model calculations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTS Software V6.20</td>
			<td>Malvern Instruments Ltd</td>
			<td>-</td>
			<td>DLS supplied instrument software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyMOL</td>
			<td>Schrodinger, LLC.</td>
			<td>-</td>
			<td>The PyMOL Molecular Graphics System V2.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Protein Data Bank</td>
			<td>Berman et al., 2000</td>
			<td>-</td>
			<td>PDB ID: 1NPE</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

structural studies of macromolecules in solution using small angle x-ray scattering

אינטראקציות חלבון-חלבון לערב חלבונים עם תחומים מרובים הכדוריים מציגים אתגרים טכניים לקביעת איך מהטפסים מתחמי ואת האופן שבו קבוצות המחשבים אוריינטציה/מוצבים. . הנה, מתואר פרוטוקול עם פוטנציאל שחקרתי אינטראקציות התחלקות אילו תחומים ספציפיים במערכת ל דרך ab initio דוגמנות. שיטה לחישוב פתרון מבנים של מקרומולקולות וההרכבות שלהם הוא בתנאי המערבת שילוב נתונים זווית קטנה רנטגן פיזור (SAXS), ביולוגיה מולקולרית, ברזולוציה אטומית מבנים יחד בגישה היברידית. דוגמה ספציפית היא של המתחם של nidogen באורך מלא-1, אשר מרכיב חלבוני מטריצה חוץ-תאית וצורות של ננו-מבנה מורחב, מעוגל. אחד התחומים הכדוריים שלו מייחסת laminin γ-1, אשר מבנים קרום המרתף. זה מספק בסיס לקביעת מבנים מדויק של מתחמי חלבון וחשבונות גמיש, מופעלת על ידי מקורות synchrotron בשילוב עם רובוטיקה וגודל אי-הכללה של כרומטוגרפיה מערכות אוטומציה. שילוב זה מאפשר ניתוח מהיר שבו מופרדים למספר מצבים oligomeric רק לפני איסוף נתונים SAXS. הניתוח התשואות מידע על הרדיוס של רגע, ממד של חלקיקים, הצורה המולקולרית, זיווג בין קבוצות מחשבים. הפרוטוקול ליצירת דגמי תלת-ממד של מתחמי על ידי התאמת מבנים ברזולוציה גבוהה של החלבונים רכיב ניתנת גם.

הגישה ניתוח הנתונים שתוארו לעיל היה מנוצל כדי לחשב את Rg ו- Dמקס nidogen-1, laminin γ-1 של מתחם שלהם באמצעות הפונקציה P(r). השגנו ערכי Rg 7.20 nm (±0.10), 8.10 חת אקו nm (±0.20) ו- 10.9 nm (±0.4) nidogen-1, laminin γ-1, מתחם שלהם בהתאמה (איור 2 א-ב). בנוסף, ערכי Dמקסימום 24 nm, 26 ננומטר, ו-35 ננומטר nidogen-1, laminin γ-1 של מתחם שלהם בהתאמה (איור 2)10 התקבלו. התוכנית DAMMIF שימש כדי להשיג מבנים ברזולוציה נמוכה של nidogen-1 ו- laminin γ-1, אשר הציע שני חלבונים לאמץ צורת מורחב בפתרון. ערכי X ו- NSD nidogen-1 (~ 1 ו- 0.8) ו- laminin γ-1 (~0.9 ו- 0.8 בהתאמה) גם הם היו על הטווח המקובל. היישור של מבנים ברזולוציה גבוהה, שתי קבוצות המחשבים של nidogen-1 ו-2 laminin γ-1, על מבנים ברזולוציה נמוכה שלהם תוך שימוש SAXS מותר זיהוי של האזורים שלהם N - ו C-מסוף10.
Nidogen-1 זוהה שותף אינטראקציה של laminin γ-139,40 , האתר אינטראקציה מופה בעזרת קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן כדי תחומים C-מסוף41. עם זאת, מבנים ברזולוציה גבוהה רק מעורב שמעצבת תחומים ולא את nidogen-1 באורך מלא או הזרוע γ-1 laminin כולו. לכן, אנחנו טהור של קומפלקס המכיל nidogen-1 (באורך מלא) וזרוע γ-1 laminin כדי לזהות את האזורים שמעצבת גם כדי ללמוד את הכיוון היחסי של N-מסוף קבוצות המחשבים של שני חלבונים. הנתונים SAXS למתחם הניב של Rg של 10.9 nm (±0.4) ו יחמרבי של 35 ננומטר. אנחנו מנוצל MONSA כדי להשיג את המבנה ברזולוציה נמוכה של המתחם כולו, אשר הציע כי אכן, רק אזור C-מסוף של שני חלבונים להשתתף תיווכה אינטראקציות, ואילו שאר התחומים הם רחוקים אחד מהשני ( איור 3, וידאו 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58538/58538fig1.jpg"> איור 1. . השרטוטים של הגדרת SAXS הכנה monodispersed של מולקולות או קומפלקסים שלהם מוכן, ואחריו חשיפה עם אנרגיה גבוהה רנטגן. בהתאם לסוג מקור (למשל, ללא צורך במיקור חוץ לעומת סינכרוטרון), האנרגיה של צילומי רנטגן, המדגם מקור מרחק יכול להשתנות. דפוס הפיזור של צילומי הרנטגן (זה תלוי הגודל והצורה של מולקולות) הוקלט, בצורה רדיאלית בממוצע כדי לקבל מגרש חד-מימדי (1 ד) המכיל מידע על עוצמת האור מפוזר ביחס הזווית פיזור. כמו מאגר מולקולות גם פיזור אור, התרומה מולקולות אלה הן המופחת כדי לקבל דפוס הפיזור של מולקולות עניין. ב סינכרוטרון, לפני איסוף הנתונים SAXS, גם בדרך כלל מתבצע שלב טיהור נוסף באמצעות כרומטוגרפיה הדרה/ביצועים גבוהים בתוך שורה בגודל (מבט מלמעלה). שלב זה הוא קריטי כדי להסיר כל מוצר צבורים ו/או מפורק גם כדי להסיר את כל מולקולות לא מאוגד מהמתחם. העלילה פיזור 1D מומר העלילה זוג אלקטרון-המרחק הפצה (P(r) העלילה), אשר מספק את רדיוס עומדים וממד חלקיקים המרבי של מולקולות. מגרש זה משמש את קובץ הקלט עבור ab initio מידול חבילות (קרי, DAMMIN/DAMMIF) להשיג מבנים ברזולוציה נמוכה של מולקולות או חבילות אחרות (קרי, SASREF/אלמוג) אם המבנה ברזולוציה גבוהה של חלקים מולקולות או מולקולות בודדות של המתחם ידוע.  <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58538/58538fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58538/58538fig2.jpg"> איור 2- (א) חלקת עוצמה של פזורים אור לעומת פיזור זווית (q = 4πsinθ/λ, nm-1) מציע את האיכות של מולקולות (אזור נמוך) וצורה (אזור גבוה) של מולקולות. (ב) התפלגות זוג אלקטרון-המרחק P(r) נקבע מתוך נתוני הפיזור מציעים צורה מוארכת של מולקולות תחת חקירה (laminin γ-1, nidogen-1 ומתחם שלהם). (ג) Kratky עלילה רומז כי nidogen-1 וחלבונים γ-1 laminin אינם פרש. (ד) העלילה Guinier nidogen-1, laminin γ-1, מתחם שלהם, המציינת את האזור הליניארי לקביעת רדיוס עומדים שימוש בנתונים בזווית נמוכה-פיזור. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58538/58538fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58538/58538fig3.jpg"> איור 3- מבנה ברזולוציה נמוכה של המתחם של nidogen-1, וγ laminin-מתקבל על ידי ניתוח של ערכות נתונים ממוזגים באמצעות התוכנית MONSA 1. ערכת הצבעים היא אותו הדבר כמו באיור 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58538/58538fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Movie 1" src="/files/ftp_upload/58538/58538movie1.jpg"> וידאו 1. המבנה ברזולוציה נמוכה של nidogen-1 ו- laminin γ-1 מתחם. הסרט הזה הוכן בעזרת PYMOL להציג באופן חזותי תכונות מבניות שונות של המתחם. מבנה הגביש של המתחם laminin-nidogen (מזהה PDB: 1NPE) מוצג בתור קריקטורות רצועת הכלים, הדגשת למרבה הצער באתרי מתחם זה. ערכת הצבעים היא אותו הדבר כמו באיור 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58538/complex_movie.mpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)</a>

Watch this Scientific Journal Video about Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering at JoVE.com

Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering

כאן, אנו מציגים כיצד פיזור קרני רנטגן זווית קטנה (SAXS) יכול להיות מנוצל כדי לקבל מידע על מעטפות ברזולוציה נמוכה המייצג את המבנים macromolecular. בעת שימוש בשילוב עם טכניקות מבניים ברזולוציה גבוהה כגון קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן, תהודה מגנטית גרעינית, SAXS יכול לספק נתונים היסטוריים תובנות וחשבונות חלבונים ו macromolecular מתחמי בפתרון.

לימודי המבנית של מקרומולקולות בפתרון באמצעות פיזור קרני רנטגן זווית קטנה

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביוכימיה כגון גודל, צורה ושינויים קונפורמיים של ביומולקולות והמתחמים שלהן. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לבצע ניסויים בתנאי חיץ רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית בסביבה שבה הביומולקולים יציבים. SAXS היא טכניקה משלימה לשיטות ביולוגיות ביופיזיות ומבניות רבות אחרות.שילוב SAXS עם שיטות אלה יכול לעזור לנו בפיתוח טיפולים מבוססי מבנה. למרות שיטה זו יכולה לספק תובנה לתוך קומפלקסים ביומולקולריים, זה יכול להיות מיושם גם על מערכות אחרות כגון לימוד חלקיקים ו versicles משלוח סמים. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו כי זה נראה כמו תהליך מכריע ומורכב, לעבור מנתונים פיזור גלם למבנים ברזולוציה נמוכה.הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית כמו הצינור של ניתוח נתונים כדי להשיג מודלים מבניים מנתונים גולמיים קשה ללמוד כי זה כרוך בשימוש בחבילות רבות ושונות של תוכנה. קיימות מספר חבילות תוכנה שימושיות לניתוח נתוני SAXS. אלה כוללים פיזור, BioXTAS RAW וסוויטת ATSAS.בסרטון וידאו זה, אנו נספק סקירה כללית של הצעדים הכלליים שיש לנקוט בעת ניתוח נתוני SAXS גולמיים, באמצעות חבילת התכנתים ATSAS. כדי להתחיל, התקן וטען את חבילת התכנתים של ATSAS. פתחו את תוכנית PRIMUS/Qt והלכו לאפשרות 'תפריט פתוח'.כאן, בחר עד 13 קבצי נתונים מעניינים. קבצי הנתונים חייבים להיות בתבנית ASCII, שבה העמודה הראשונה היא הציר הווקטורי והעמודה השניה היא העוצמה. חזור על שלב זה עבור נתוני המאגר בלבד, תוך הוספת נתונים אלה לתפריט כלים שני.לאחר מכן, נווט אל החלון עיבוד נתונים ובחר הפחת. פעולה זו תיצור עקומת פיזור מופחתת, המייצגת רק את ההתפזרות מהמאקרומולקול של העניין. לביצוע ניתוח Guinier, התחילו בעקומת פיזור מופחתת של מאגר שנטענה ל-PRIMUS/Qt.לאחר מכן לחץ על רדיוס של Gyration, אשר יפתח את אשף פרימוס Guinier. בשלב זה תוצג עלילה המציגה את היומן הטבעי של העוצמה לעומת זוויות פיזור בריבוע. כדי לקבל רדיוס ראשוני של gyration, אתר את חלון שורת הפקודה ולהשתמש בפונקציה Autorg.לאחר דחיפת Autorg, לחץ על הגבול העליון למעלה, ולאחר מכן למטה אחד כדי לאלץ את התוכנית לעדכן את המידות הסטטיסטיות. לחלופין, הזן קבצים מרובים בו-זמנית על-ידי לחיצה על אותה בקשה פתוחה ובחירת שמות קבצי נתונים מרובים על-ידי הדגשתם באותו אופן כפי שתואר קודם לכן. כדי להתחיל בניתוח Kratky, לחץ כדי לבחור את שם קובץ הנתונים.פעולה זו תתוות את הנתונים בחלון. ולאחר מכן, בחר התוויה. לאחר מכן, מתחת ללחצן עלילה, לחץ על עלילה Kratky.כתוצאה מכך, חלבונים כדוריים מציגים פסגת GALC-ean בעוד חלבונים שנפרשו יציגו מישור במקום שיא ודומים לעלילה היפרבולית כמו זו המוצגת כאן. טען שוב נתונים מופחתים של מאגר עבור כל ריכוז ב- PRIMUS/Qt. ותחת הכרטיסיה עיבוד, לחץ על שנה קנה מידה ובדוק כל עקומה ואת מספר i-scale, אשר תואם את הדילולים שנעשו מהדגימה המקורית.לאחר הבדיקה, מזג את הנתונים על-ידי לחיצה על לחצן מזג בחלון העיבוד. כדי ליצור את התוויית התפלגות המרחק, טען את עקומות הנתונים הממוזגות לתוך PRIMUS/Qt ולאחר מכן לחץ על 'התפלגות מרחק' בכרטיסיה 'ניתוח'. התאם את טווח הנתונים של הנתונים הממוזגים כדי למנוע רעש משמעותי בקצה הזנב של הנתונים הגולמיים.כמו כן, השמט נקודות נתונים קרוב למעצור הקורות באזור הנמוך על-ידי בחירת ערך הטווח התחתון והגדלת המספר. כדי לקבוע את Dmax, להתחיל עם טווח של חמש פעמים את הרדיוס של gyration המתקבל מניתוח Guinier. לאחר מכן, הפחת ערך זה בהדרגה עד שתווית התפלגות המרחק לא תרד בפתאומיות לאפס על ציר ה- y ואין לה זנב ארוך לפני שתתקרב לאפס.בדוק כי הרדיוס הניסיוני של gyration לעומת עלילה אינטנסיבית, אשר נגזר קירוב Guinier ואת רדיוס חלוקת המרחק של gyration לעומת מספרים בעוצמה דומים. כאן, עוצמת האור המפוזר מוצגת על פיזור זווית, מה שמרמז הן על איכות הביומולקולס נידוגן-1, גמא-1 למינין והן על צורתם המורכבת, כמו גם על צורתם. התפלגות המרחק של זוג האלקטרונים הנקבעת מנתוני פיזור מצביעה על כך שלבימולקולים יש צורה מוארכת והמזימה של קרצקי מרמזת על כך שחלבונים נמצאים במצב מקופל, מכיוון הנתונים, או אפילו עלייה בטווח q הגדול יותר וחסרים צורת עקומת פעמון.בנוסף חלקות Guinier, המשתמשת בנתונים בזווית פיזור נמוכה, מציין את האזור ליניארי לקביעת רדיוס של gyration, אשר מוצג כאן עבור nidogen-1, למינין גמא-1 ומורכב שלהם. כדי לחקור קומפלקסים חלבון חלבון, MONSA שימש כדי להשיג את המבנה ברזולוציה נמוכה של כל nidogen-1 laminin גמא-1 קומפלקס, מה שמרמז כי רק אזור C-מסוף של שני החלבונים להשתתף אינטראקציות תיווך ואילו שאר התחומים רחוקים זה מזה. אל תשכח כי עבודה עם קרינת Synchrotron יכול להיות מסוכן מאוד אמצעי זהירות ובטיחות המתוארים על ידי כל קו קרן שונה תמיד צריך להילקח בעת ביצוע איסוף נתונים ראשוני.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

שילוב קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן עם זווית קטנה פיזור קרני רנטגן ליצור מודל לא מובנה מחוזות Nsa1 של Cerevisiae ס

Determination of the full-length structure of ribosome assembly factor Nsa1 from Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is challenging because of the ...

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

גידול גבישים חלבון עם ממדים ברורים באמצעות כלים אוטומטיים התגבשות בשילוב עם בחיי עיר פיזור אור דינאמי

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

אפיון של Glycoproteins עם הקיפול בנוגדנים על ידי קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן וטכניקות ביופיזיקלי

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Contrast-Matching Detergent in Small-Angle Neutron Scattering Experiments for Membrane Protein Structural Analysis and Ab Initio Modeling

Contrast-Matching Detergent in Small-Angle Neutron Scattering Experiments for Membrane Protein Structural Analysis and Ab Initio Modeling

התאמת ניגודיות דטרגנט בניסויים פיזור ניוטרון זווית קטנה עבור ניתוח מבנה של חלבון ממברנה ומודלים Initio אלב

The biological small-angle neutron scattering instrument at the High-Flux Isotope Reactor of Oak Ridge National Laboratory is dedicated to the ...

Structure Solution of the Fluorescent Protein Cerulean Using MeshAndCollect

מבנה תמיסת Cerulean חלבון פלואורסצנטי באמצעות MeshAndCollect

X-ray crystallography is the major technique used to obtain high resolution information concerning the 3-dimensional structures of biological ...

Fully Autonomous Characterization and Data Collection from Crystals of Biological Macromolecules

איסוף נתונים מקריסטלים של מקרומולקולות ביולוגיות ואפיון עצמאית לחלוטין

High-brilliance X-ray beams coupled with automation have&#160;led to the use of synchrotron-based macromolecular X-ray crystallography (MX) beamlines for ...

Ion Exchange Chromatography (IEX) Coupled to Multi-angle Light Scattering (MALS) for Protein Separation and Characterization

Ion Exchange Chromatography IEX Coupled to Multi-angle Light Scattering MALS for Protein Separation and Characterization

יונים כרומטוגרפיה (IEX) מצמידים מרובה זווית פיזור אור (MALS) עבור חלבון הפרדה ואפיון

Ion-exchange chromatography with multi-angle light scattering (IEX-MALS) is a powerful method for protein separation and characterization. The combination ...

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering SEC-MALS

אפיון של חלבונים לפי גודל כרומטוגרפיה הדרה מצמידים לפיזור אור רב זווית (SEC-דוליטל)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

מחזיק מדגם All-in-one עבור קריסטלוגרפיה Macromolecular X-ray עם פיזור רקע מינימלי

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...