Name: structural studies of macromolecules in solution using small angle x-ray scattering
Uploaded: 2018-11-05T13:00:00
Duration: 7 min 19 s
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Questo progetto è stato supportato da NSERC RGPIN-2018-04994, Campus Alberta Innovation Program (RCP-12-002C) e Alberta Prion Research Institute / sovvenzioni Alberta innova soluzioni Bio (201600018) al modus operandi TRP è un Canada Research Chair in RNA & Biofisica della proteina (201704) e riconosce grant NSERC Discovery (RGPIN-2017-04003). TM è finanziato dalla sovvenzione NSERC scoperta di TRP.

1. SAXS campione preparazione e acquisizione dati
<ol><li>Preparazione del campione:<ol>
<li>Gli esperimenti SAXS richiedono campioni omogenea, stabile e non-aggregazione proteica; osservare la stabilità e lo stato oligomerico con cromatografia di esclusione di formato (S), liste di distribuzione e/o AUC prima della raccolta dei dati.</li>
		<li>Sottoporre i campioni (nidogeno-1 e laminin γ-1 in questo caso) per analisi DLS e tricine SDS-PAGE per visualizzare esempio purezza10. Nota: I campioni possono coprire una gamma di concentrazioni (1-4 mg/mL) a seconda delle loro dimensioni, il loro comportamento di soluzione come auto-associazione e aggregazione con la stabilità; qui, cinque concentrazioni di nidogeno-1, (139 kDa), tre di laminina γ-1 (109 kDa) e quattro del complesso equimolare S-purificati sono stati preparati come descritto in precedenza10.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Raccolta dati:<ol>
<li>Raccogliere i dati SAXS utilizzando un sistema in-House o sincrotrone, secondo le linee guida del produttore o struttura. Nota: I dati utilizzati in questo lavoro è stato raccolto usando un sistema interno (Vedi Tabella materiali) che contiene una 3-pinhole camera attrezzata con + 002 microfocus tubo sigillato (radiazione Kα Cu a 1.54 Å) e ottica confocale Max-Flux (CMF) operanti a 40 w. Il sistema è anche dotato di un rilevatore 2D di 200 nm multi-filo per la raccolta dati. Tuttavia, con la disponibilità di moderni sincrotroni in Francia, Germania, UK, USA e altri paesi, che forniscono accesso a un set-up S-SAXS che facilita la separazione di una preparazione di monodispersed da eventuale aggregazione/degradazione, abbiamo ora ordinariamente raccogliere dati a sincrotrone. Un articolo pubblicato di recente su un G-quadruplex di DNA11 è un esempio di una strategia di raccolta dati S-SAXS. In questo caso, sono stati raccolti i dati SAXS nella gamma di 0,08 ≤ q ≤ 0,26 Å per 3 ore per nidogeno-1 (2.0, 2.5, 3.0, 3.5 e 4,0 mg/mL); la laminina γ-1 (1,5, 2,0 e 2,5 mg/mL) e il loro complesso (0.8, 1.0, 1,25 e 1,5 mg/mL).</li>
		<li>Ridurre i dati per buffer e campioni utilizzando software di elaborazione specifici del sistema. Sottrarre il contributo di buffer di dati della proteina utilizzando un programma come PRIMUS/qt12 (Figura 2A).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. analisi dei dati
Nota: Attualmente, ci sono alcuni pacchetti di software che sono utili per l'analisi dei dati SAXS: ScÅtter43 (download disponibile in www.bioisis.net), bioXtas RAW44e il ATSAS suite13. Questa sezione fornisce una panoramica dei passaggi generali da adottare quando analizzando SAXS raw dati utilizzando il ATSAS programma suite e passaggi specifici sono presi da ATSAS 2.8.1 scaricare. Altri programmi possono essere utilizzati e brevemente sono discussi più avanti.
<ol><li>Sottrazione di buffer Nota: Questi passaggi sono rilevanti per i campioni SAXS statici solo.<ol>
<li>Selezionare l'opzione di menu "Apri" in PRIMUS/qt e selezionare i file di dati di interesse. Essere consapevoli del fatto che i file di dati devono essere in formato ASCII, in cui la prima colonna è l'asse di s-vettore e la seconda colonna è l'intensità. Ripetere questo passaggio per i dati raccolti per il buffer stesso inserendo questi dati nel menu stesso.</li>
		<li>Selezionare "SUBTRACT" nella finestra di elaborazione dei dati, che genererà una curva di dispersione sottratto che rappresenta solo di scattering dalla macromolecola di interesse. Ripetere questo passaggio per ciascuna concentrazione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Guinier analisi<ol>
<li>Per eseguire analisi Guinier, caricare una curva di dispersione di buffer sottratto in PRIMUS/qt come precedentemente descritto al punto 2.1.1.</li>
		<li>Fare clic su "Raggio di girazione", che procederà ad aprire la procedura guidata Guinier Primus; verrà visualizzato un appezzamento di ln(I) vs q2 .</li>
		<li>Per ottenere una preliminare Rg utilizzare la funzione "AUTORG", che è un modulo esterno costruito in PRIMUS/QT. trovare il pulsante "Autorg" e fare clic su esso.</li>
		<li>Ingresso più file contemporaneamente evidenziandoli tutti e inserendoli nel menu sul lato destro, molto simile a 2.1.1.</li>
		<li>Utilizzare la trama Guinier precedentemente creata per valutare la qualità dei dati; la linea verde sotto la trama Guinier indica la trama di residui che rappresenta una linearità della fit. Essere consapevoli che non-linearità nell'analisi Guinier potrebbe essere un segno di aggregazione di esempio e ulteriori analisi non deve essere eseguita in questo caso. Nota: Una misura lineare di Guinier dà un Rg con un piccolo errore (< 5%) e suggerisce un campione di alta qualità.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analisi Kratky<ol>
<li>Caricare i dati possano essere visualizzati in modo simile, come descritto in precedenza.</li>
		<li>Fare clic su nella finestra"selezionare" accanto al nome del file di dati. Questo consente di tracciare i dati in una finestra separata.</li>
		<li>Fare clic sul pulsante "Trama" seguito da "Trama Kartky" selezione nel menu a discesa.</li>
		<li>Questo consente di tracciare i dati come "q2 x L(q) vs q". Essere consapevoli del fatto che proteine globulari visualizzano un picco gaussiano, mentre proteine "unfolded" visualizzerà un altopiano invece un picco e assomigliano a una trama iperbolica17.</li>
	</ol>
</li>
	<li>L'Unione di dati<ol>
<li>Buffer di carico sottratto dati per ciascuna concentrazione in PRIMUS/qt ancora una volta, come descritto al punto 2.1.1.</li>
		<li>Per unire i dati, è sufficiente fare clic sul pulsante "Stampa unione" nella finestra di elaborazione.</li>
		<li>Ispezionare ogni curva e il numero della scala, che correla alle concentrazioni fatta dal campione originale. Nota: Campioni a più alta concentrazione di visualizzare meno rumore nella regione della coda delle curve.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Distribuzione di p (r)<ol>
<li>Per generare il grafico di p (r), caricare le curve di dati uniti in PRIMUS/qt come descritto in precedenza.</li>
		<li>Fare clic sul pulsante "Distanza distribuzione" per aprire una nuova finestra che presenta i dati Uniti di intensità di sparsi luce vs q e coppia-distanza distribuzione funzione trama sul lato destro. Nota: Le informazioni sul lato destro presentano la qualità complessiva dei calcoli di funzioni di distribuzione di coppia-distanza.</li>
		<li>Regolare l'intervallo di dati dei dati Uniti per evitare qualsiasi rumore significativo alla fine della coda dei dati grezzi.</li>
		<li>Omettere i punti di dati vicino alla fermata del fascio della regione bassa-q.</li>
		<li>Per determinare l'inizio Dmax, con una gamma di ~ 5 volte la Rg ottenuti dall'analisi Guinier. Gradualmente diminuire questo valore fino a quando la trama di p (r) non scende bruscamente a zero sull'asse y e non ha una lunga coda prima di avvicinarsi a zero.</li>
		<li>Verifica che lo sperimentale Rg/ho0 (derivato da Guinier approssimazione) e P(r) Rg/ho0numeri sono simili. Nota: In alcuni casi, ulteriore manipolazione sull'intervallo di dati, i punti dati e alfa (un parametro di regolarizzazione che indica al programma il rapporto di quanta attenzione viene pagato per la scorrevolezza della distribuzione rispetto al montaggio i dati sperimentali) è anche richiesto21 per ottenere una trama di P(r) di buona qualità.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. una perlinab initio modellazione e una media di
<ol><li>Una volta che i dati raccolti alle concentrazioni multiple vengono Uniti, o i dati raccolti utilizzando S-SAXS sono ridotto al minimo, e la Kratky trama, la trama di P(r) e l'analisi di Guinier sono stati verificati, calcolare strutture a bassa risoluzione delle macromolecole e loro complessi. Questa pipeline può essere utilizzata per studiare le strutture della soluzione e le interazioni di acidi nucleici, proteine e acidi nucleici-proteina o proteina-proteina complessi10,11,21,22,23 ,24,25,26,27,28,29,30,31,32 ,33,34. Uno dei programmi più popolari è DAMMIN, sviluppato da Svergun35 e una parte del ATSAS pacchetto13, che si avvale di protocolli di ricottura simulate con informazioni preliminari ingresso Rg e Dmax . L'ab-initio approcci di modellazione e principi sono descritti dettagliatamente altrove18,36.</li>
</ol>

Gli autori non hanno alcuna informativa al dichiarare.

Le fasi critiche di analisi dei dati SAXS delineato nella sezione protocollo di questa sottrazione di carta Includi buffer, Guinier analisi analisi Kratky, l'Unione di dati e distribuzione p (r). La modellazione ab-initio della perla è troppo estesa per essere coperto qui in dettaglio e pertanto è coperto solo brevemente.
Al sincrotroni (ad es. DESY in Germania, diamante nel Regno Unito ed ESRF in Francia), è possibile raccogliere dati SAXS per una frazione molto piccola (~ pochi µ l) di ciascun campione come le frazioni sono essere eluiti dalla colonna s che è collegato in linea (Vedi figura 1 ). I dati SAXS elasticamente sparsi sono radialmente media utilizzando i pacchetti forniti dal costruttore dello strumento o dal sincrotrone prima sottrazione di buffer può avvenire. I dati risultanti 1D rappresentano la quantità di luce diffusa (nei io(q)) sul Y-asse e angolo di scattering (q= 4πsinθ/λ, dove λ è la lunghezza d'onda incidente X-raggi) ed è descritto nella Figura 1. Il programma PRIMUS/qt12 viene utilizzato per sottrarre direttamente qualsiasi sfondo a causa di buffer ed è descritto nella sezione 1.1. Altri programmi come; ScÅtter43 (download disponibile in www.bioisis.net) con un tutorial disponibile presso https://www.youtube.com/channel/UCvFatdC5HcZOLv6OSjblfeAe bioXtas RAW44 (https:// disponibili presso bioxtas-raw.readthedocs.io/en/Latest/index.html) può essere utilizzato come alternativa al pacchetto ATSAS.
L'analisi di Guinier fornisce informazioni su aggregazione di campione e omogeneità, nonché fornendo il raggio di girazione (Rg) per la macromolecola di interesse sulla base dei dati SAXS dal basso s regione14. Una trama è costruito con PRIMUS/qt per dati SAXS ottenuti da ciascuna concentrazione, seguita dalla curva di raccordo con la gamma massima di fino a 1,30 per q x Rg. Una preparazione del campione di monodispersed dovrebbe fornire una trama lineare Guinier in questa regione (Figura 2D), considerando che risultati di aggregazione in un Guinier non lineare trama15,16. Se l'analisi Guinier è lineare, il grado di "unfoldedness" di una macromolecola di interesse può essere osservato con la trama Kratky, che è utile al momento di decidere se eseguire la modellazione corpo rigido o costruire insiemi di modelli a bassa risoluzione. Una proteina globulare apparirà in un Kratky trama per avere una curva a campana, mentre esteso molecole o peptidi dispiegati apparirà altopiano o addirittura aumentare la più grande gamma di q e mancano la forma a campana (Figura 2).
Ottenendo il Rg da Guinier analisi prende in considerazione solo i punti dati dalla regione basso q del tracciato a dispersione 1D (Figura 2D), tuttavia, è possibile utilizzare quasi l'intero set di dati per eseguire una trasformazione di Fourier indiretta per convertire le informazioni di reciproco-spazio di ln (I (q)) vs (q) in una funzione di distribuzione di distanza di spazio reale (P(r)) che fornisce informazioni su max D e Rg (Figura 2B) La forma della trama P(r) rappresenta la conformazione di soluzione lordo della macromolecola di interesse18,19. la conversione dei dati reciproco-spazio ai dati real-spazio è un passo fondamentale, ma una descrizione dettagliata non è nell'ambito di questa carta. Pertanto, fare riferimento a un articolo Svergun20 a capire ogni parametro.
Una volta sottratto il buffer dati alle singole concentrazioni sono trattati attraverso analisi Guinier con un valore costante per Rg, seguita da indagare il loro modello pieghevole utilizzando Kratky analisi, è possibile unire questi dati. I dati Uniti per nidogeno-1, γ laminin-1 e il loro complesso erano trattati come descritto in precedenza e la risultante p (r) trame sono presentati in Figura 2B. Idealmente, si dovrebbe calcolare anche la funzione di distribuzione di coppia-distanza p (r) per ciascuna concentrazione per determinare se forniscono dati SAXS raccolti per ogni concentrazione simile Rg e i valori Dmax . Se il Rg e Dmax rimangono simili sopra una vasta gamma di concentrazioni, l'utente deve procedere. Si noti che a seconda del segnale, dati possono essere troncati prima l'Unione di dati. Questo è spesso il caso se le concentrazioni e/o il peso molecolare delle macromolecole sotto inchiesta è basso.
Analisi della forma a bassa risoluzione utilizzando DAMMIN può essere eseguita in vari modi (ad es. Fast, Slow, modalità esperto, ecc.). La modalità veloce è un primo passo ideale per valutare se la trama di p (r) fornisce modelli di buona qualità. In genere, almeno 10 modelli dovrebbero essere ottenute per ogni trama di p (r) verificare se si ottengono risultati riproducibili, in termini di struttura a bassa risoluzione, con una bassa bontà di fit parametro denominato χ (un valore di 0,5-1,0 è considerato buono basato sul nostro vasto lavoro ), un valore che descrive un accordo tra dati SAXS sperimentalmente raccolti e derivata dal modello dati. Ai fini della pubblicazione, noi in genere utilizza la modalità Slow o esperto e calcolare almeno 15 modelli. Oltre a DAMMIN, una versione più veloce di esso, DAMMIF37, nonché GASBOR38 sono anche alternative. Inoltre, per lo studio della proteina-proteina o proteina-nucleico acidi complessi, è possibile utilizzare il MONSA programma35, che facilita il montaggio simultaneo dei singoli dati SAXS per macromolecole così come il loro complesso. Per maggiori dettagli sui calcoli di modello ad alta risoluzione anche per studi di interazione della RNA-proteina, fare riferimento a un recente articolo Patel et al.3.
SAXS è teoricamente semplice ma senza dubbio un metodo altamente complementare ad altri strumenti di biologia strutturale e risultati in dati strutturali a bassa risoluzione che possono essere usati in monoterapia o in combinazione con tecniche ad alta risoluzione per delucidare le informazioni su struttura macromolecolare e dinamiche. Come una preparazione monodispersed di macromolecole e loro complessi possa essere ottenuta, SAXS possono essere utilizzate per studiare la struttura in soluzione e interazioni di qualsiasi tipo di macromolecole biologiche. Nel caso il complesso discusso qui, è notevole che meno del 10% della superficie complessiva accessibile di azoto-1 e laminin γ-1 è sepolto in questo complesso, considerando che il resto dei domini di entrambe le proteine sono liberamente accessibili per interagire con altri proteine della matrice extracellulare per mantenere la sua rigidità strutturale (Figura 3). Ottenimento di tali informazioni per un complesso con ~ 240kDa sarebbe stato molto difficile utilizzando altre tecniche di biologia strutturale come microscopia di Cryo-EM, NMR e cristallografia a raggi x.
Scoprire la struttura della proteina tramite cristallografia a raggi x o NMR è un processo intrinsecamente che richiede tempo. Questo collo di bottiglia nella determinazione della struttura è una zona dove SAXS Mostra la sua forza come una tecnica strutturale; acquisizione di dati per un singolo esperimento SAXS può prendere meno di un'ora e con l'aiuto del software di analisi semplificata, analisi possono essere fatto rapidamente ed efficientemente. SAXS ha il potenziale di aumentare notevolmente la velocità effettiva di studi strutturali come tecnica autonoma perché offre un modello a bassa risoluzione della struttura macromolecolare prima di dati ad alta risoluzione sono disponibili. Una barriera ad altre tecniche strutturali è il requisito per un campione altamente puro, concentrato per l'acquisizione di dati, che richiede un elevato livello di espressione della proteina e la stabilità per un lungo periodo di tempo. Mentre SAXS campioni anche bisogno di essere puri e concentrati, i volumi di campione sono all'incirca 100 µ l rendendo SAXS un metodo relativamente economico di analisi rispetto ad altre tecniche strutturali. Inoltre, SAXS accoppiato con cromatografia di esclusione di formato sta diventando sempre più comune che prevede un passaggio ulteriore controllo di qualità. Recentemente c'è stato un forte progresso nella combinazione di dati NMR e SAXS utilizzando il metodo di ottimizzazione Ensemble (EOM)45,46 per delucidare sistemi flessibili. In un recente libro di Mertens e Svergun47, gli autori descrivono esempi più recenti di EOM SAXS in combinazione con NMR, insieme a molti altri esempi di dati SAXS viene utilizzati in combinazione con NMR. I progressi sono stati fatti continuamente nel campo della SAXS e nuove tecniche sono stati sviluppati per SAXS essere utilizzato in combinazione con, non solo gratuito ad, altre tecniche strutturali. Di conseguenza, crediamo che la domanda di SAXS aumenterà solo nel corso del tempo, soprattutto in combinazione con NMR per la caratterizzazione di sistemi dinamici dove le funzioni sono definite dalla flessibilità.

Le cellule contengono complesse reti di proteine che agiscono come macchine molecolari per svolgere funzioni cellulari quali cascate di segnalazione e mantenere l'integrità strutturale. I modi in cui questi diversi componenti muovono e interagiscono in uno spazio tridimensionale dà luogo a delle funzioni specifiche delle macromolecole. L'importanza della struttura della proteina, dinamiche e interazioni nella determinazione della funzione ha fornito la necessità di tecniche in continua evoluzione, complesse per misurare queste proprietà. Di questi, risonanza magnetica nucleare (NMR), cristallografia a raggi x (XRC) e più recentemente, Cryo-Electron microscopia (CEM) forniscono informazioni strutturali ad alta risoluzione. Tuttavia, XRC e CEM produrre strutture di uno dei molti stati biomolecolari e la mancanza di informazioni circa le dinamiche della struttura della proteina, mentre la determinazione della struttura 3D mediante NMR è in genere limitata a piccole proteine globulari. Un modo per superare queste limitazioni è quello di utilizzare il piccolo angolo x-ray Scattering (SAXS) per generare buste molecolari di sistemi grandi, multidominio o complessati e combinare le strutture macromolecolari rigide ad alta risoluzione per delucidare il globale architettura e caratteristiche dinamiche.
SAXS produce buste a bassa risoluzione di complessi macromolecolari con una risoluzione di circa 10-20 Å 1, dando visione non solo nella struttura, ma anche le caratteristiche dinamiche che Visualizza il complesso. Anche se SAXS utilizza i raggi x per scoprire la struttura molecolare, è a differenza di XRC in quanto l'orientamento isotropo casuale delle particelle in soluzione non conduce alla diffrazione, ma piuttosto di scattering, che non può cedere risoluzione atomica. Al contrario, un elettrone "busta" della macromolecola è generato che rappresenta una media delle conformazioni che visualizza la macromolecola. Questa informazioni possono essere utilizzate nel montaggio diretto delle strutture precedentemente risolto risoluzione atomica per dedurre le regioni di flessibilità in una singola proteina o organizzazione di subunità, o dinamiche in un complesso più grande, della multi-proteina. SAXS dati vengono raccolti presso i sincrotroni utilizzando ad alta energia raggi x monocromatici o da fonti interne, che offrono una fonte di raggi x più debole che richiedono ore anziché secondi di tempo di esposizione del campione (Figura 1). Dati SAXS spesso raccolti da diversi campioni con una singola installazione sperimentale e buffer, che richiedono un tempo prolungato per raccogliere una serie di dati utili su un sistema. Campioni devono, pertanto, essere stabile e non aggregando per almeno un paio d'ore sulla base di metodi di controllo di qualità verificabile come diffusione dinamica della luce (DLS) e/o analisi ultracentrifuga analitica (AUC) di ottenere alta qualità SAXS dati2 , 3. qui forniamo una descrizione pratica di SAXS, i principi dietro sua utilizzo, benefici, limitazioni e preparazione del campione e raccolta dati pesantemente sulla messa a fuoco e analisi, lungo con toccando brevemente in ab-initio modellazione utilizzando il matrice extracellulare proteine nidogeno-1 e laminin γ-1 come un esempio sperimentale.
Principi, vantaggi e limitazioni di SAXS:
I principi guida di funzionamento dietro SAXS è relativamente semplice: una soluzione di preparazione monodispersed di macromolecule(s) di interesse è collocata all'interno di un capillare ed è esposto ad un fascio di raggi x ad alta energia monocromatico. I fotoni provocare gli elettroni del guscio atomico per iniziare oscillante, con un onda sferica emessa della stessa energia e lunghezza d'onda. Poiché ogni elettrone oscillerà, si otterrà un sottofondo costante, e la densità risultante dell'elettrone della macromolecola è in contrasto con lo sfondo. L'intensità dello scattering risultante è raccolti in funzione dell'angolo di scattering, 2Θ (Figura 1).
Mentre altre tecniche come XRC, NMR e CEM forniscono informazioni strutturali a livello atomico, ci sono molteplici vantaggi di SAXS che altre tecniche non possono fornire. SAXS può essere eseguita in quasi qualsiasi buffer e non richiede alcuna preparazione del campione speciale. Ciò è particolarmente importante nello studiare il comportamento e la struttura delle macromolecole sotto diverse condizioni, come ad esempio la presenza o l'assenza di mono - o cationi bivalenti o a cambiamenti di pH4,5. SAXS ha la capacità di fornire informazioni sulle aree flessibile di una macromolecola6, qualcosa le altre tecniche elencate possono lottare con. Pertanto, SAXS può essere utilizzato come una forte tecnica gratuita con le porzioni stabile di una macromolecola di essere studiata con XRC, NRM o CEM e la macromolecola intera o complessa analizzati in bassa risoluzione con SAXS e combinati utilizzando vari strumenti di analisi tali come FoXSDock7 o CRYSOL8. Poiché SAXS è una tecnica di soluzione, esso è spesso utilizzato per confermare se strutture statiche, ad esempio quelli ottenuti da XRC sono coerenti in soluzione6. SAXS ha anche il vantaggio di essere una tecnica che richiede una quantità relativamente piccola di investimento (in genere 50-100 µ l) di campione e una quantità relativamente piccola di esperimento tempo (30 min - 1 h).
La limitazione più grande di SAXS è la vulnerabilità per esempio aggregazione e/o degradazione, che può portare a errate previsioni strutturali. Un'aggregazione, anche a partire da 5%, può diffondono la luce in quantità molto elevate, che portano ad una sovrastima della dimensione massima delle particelle (Dmax) e raggio di girazione (R,g). D'altra parte, la degradazione del campione può portare a una sottostima delle proprietà molecolari. Questa vulnerabilità si pone da SAXS essendo una tecnica media, che significa che l'omogeneità del campione è fondamentale per raggiungere risultati affidabili e riproducibili. Qualsiasi campione che deve essere analizzata da SAXS dovrebbe, pertanto, subiscono più metodi di purificazione e di controlli di omogeneità, come elettroforesi denaturante e nativo, cromatografia di esclusione di formato, dynamic light scattering e analitica ultracentrifugazione. Spesso, SAXS beamlines verrà eseguito campioni mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni come un controllo di qualità finale passo prima SAXS (S-SAXS)3,9. SAXS dati dovrebbero essere raccolti alle concentrazioni più e devono essere confrontati i Rg di ogni set di dati, garantendo una stretta somiglianza per evitare interazioni interparticella e aggregazione, che si traduce in una sovrastima della particella dimensioni, che conduce all'analisi dei dati inesatti e modellazione. Poiché la diffusione dipende dalla concentrazione e la dimensione, più piccole macromolecole possono richiedere un'ottimizzazione più specifica del campo di concentramento. Ciò è dovuto il Teorema di reciprocità, dove grandi dimensioni disperdono verso piccoli angoli e piccole dimensioni verso grandi angoli. Questo si manifesta nella raccolta dei dati, dove IO è proporzionale a R6, dove R è il raggio delle particelle. Una limitazione finale di SAXS è il potenziale per danno da radiazione al campione durante l'esposizione, che può condurre ad una distorsione dei dati. Si consiglia di confrontare la qualità del campione prima e dopo l'esposizione del campione SAXS affinché che questo non si verifica.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>HEK 293 EBNA Cell Line</td>
			<td>In-Lab availability</td>
			<td>-</td>
			<td>Cell line used to overexpress protein(s)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni Sepharose High Performance histidine-tagged protein purification resin</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17524801</td>
			<td>Affinity protein purification resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 Increase 10/300</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28990944</td>
			<td>SEC Column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;KTA Pure FPLC</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>-</td>
			<td>FPLC System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>-</td>
			<td>Spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic Reagents (NaCl, Tris-HCl etc.)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S-MAX3000</td>
			<td>Rigaku</td>
			<td>-</td>
			<td>SAXS Pinhole Camera System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer Nano-S</td>
			<td>Malvern Instruments Ltd</td>
			<td>-</td>
			<td>Dynamic Light Scattering instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1&#181;m Filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>JVWP04700</td>
			<td>Used to Concentrate Sample Prior to DLS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin cleavage kit</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab207000</td>
			<td>Thrombin cleavage to remove His tag</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strep-Tactin Sepharose Column</td>
			<td>IBA</td>
			<td>2-1201-010</td>
			<td>Strep-Tag Affinity Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-desthiobiotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>533-48-2</td>
			<td>Elution of Strep Tag Protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAXGUI</td>
			<td>Rigaku</td>
			<td>-</td>
			<td>Data Collection for SAXS and data reduction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATSAS Suit</td>
			<td>Franke et al., 2017</td>
			<td>-</td>
			<td>SAXS Data Analysis Software program suite</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRIMUS</td>
			<td>Konarev et al., 2003</td>
			<td>-</td>
			<td>Buffer Subtraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GNOM</td>
			<td>Svergun, 1992</td>
			<td>-</td>
			<td>Rg, Dmax and p(r) Calculation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAMMIF</td>
			<td>Franke and Svergun, 2009</td>
			<td>-</td>
			<td>Ab initio model calculation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAMAVER</td>
			<td>Volkov and Svergun, 2003</td>
			<td>-</td>
			<td>Averaged Solution Conformation calculations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MONSA</td>
			<td>Svergun, 1999</td>
			<td>-</td>
			<td>Simultaneous model fitting for the complex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GASBOR</td>
			<td>Svergun et al., 2001</td>
			<td>-</td>
			<td>Alternative Ab initio model calculations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTS Software V6.20</td>
			<td>Malvern Instruments Ltd</td>
			<td>-</td>
			<td>DLS supplied instrument software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyMOL</td>
			<td>Schrodinger, LLC.</td>
			<td>-</td>
			<td>The PyMOL Molecular Graphics System V2.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Protein Data Bank</td>
			<td>Berman et al., 2000</td>
			<td>-</td>
			<td>PDB ID: 1NPE</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

structural studies of macromolecules in solution using small angle x-ray scattering

Interazioni proteina-proteina che coinvolgono proteine con più domini globulari presentano sfide tecniche per determinare come tale forma di complessi e come i domini sono orientati/posizionato. Qui, un protocollo con il potenziale per il delucidamento quali domini specifici mediano interazioni nel sistema multicomponente attraverso ab-initio modellazione è descritto. Un metodo per il calcolo di strutture di soluzione di macromolecole e loro assemblee è condizione che comporta l'integrazione di dati da dispersione di raggi x piccolo angolo (SAXS), cromatografia e strutture di risoluzione atomica insieme in un approccio ibrido. Un esempio specifico è quello del complesso di nidogeno Full-Length-1, che assembla le proteine della matrice extracellulare e forma una nanostruttura estesa, curvo. Uno dei suoi domini globulari attribuisce alla laminina γ-1, che strutture di membrana dello scantinato. Questo fornisce una base per la determinazione accurate strutture dei complessi della proteina del multidomain flessibile ed è abilitato per sincrotroni accoppiati con automation sistemi di cromatografia di esclusione robotica e dimensione. Questa combinazione consente un'analisi rapida in cui più Stati oligomerici sono separati appena prima della raccolta dei dati SAXS. L'analisi fornisce informazioni sul raggio di girazione, dimensione delle particelle, forma molecolare e l'associazione tra domini. Il protocollo per la generazione di modelli 3D di complessi inserendo strutture ad alta risoluzione delle proteine componente è anche dato.

L'approccio di analisi dei dati sopra descritto è stato utilizzato per calcolare la Rg e Dmax per nidogeno-1, γ laminin-1 e il loro complesso utilizzando la funzione P(r). Abbiamo ottenuto valori Rg di 7,20 nm (± 0,10), 8.10 nm (± 0.20) e 10,9 nm (± 0,4) per nidogeno-1, γ laminin-1 e il loro complesso rispettivamente (Figura 2A-B). Inoltre, i valori Dmax di 24 nm, 26 nm e 35 nm per nidogeno-1, γ laminin-1 e il loro complesso rispettivamente (Figura 2)10 sono stati ottenuti. Il programma DAMMIF è stato utilizzato per ottenere strutture a bassa risoluzione di nidogeno-1 e laminin γ-1, che ha suggerito che entrambe le proteine adottano una forma estesa in soluzione. I valori di X e NSD per nidogeno-1 (~ 1 e 0,8) e γ laminin-1 (~0.9 e 0,8 rispettivamente) erano anche nella gamma accettabile. L'allineamento delle strutture ad alta risoluzione, due domini di nidogeno-1 e due di laminina γ-1, sulle loro strutture a bassa risoluzione ottenuta utilizzando SAXS ha permesso l'identificazione delle loro regioni di N - e C-terminale10.
Nidogeno-1 è stato identificato come un partner interagente di laminina γ-139,40 e il sito di interazione è stato mappato utilizzando la cristallografia a raggi x al C-terminale domini41. Tuttavia, ad alta risoluzione strutture coinvolte solo domini interagenti e non il full-length nidogeno-1 o il braccio di γ-1 intero laminin. Di conseguenza, abbiamo purificato un complesso contenente nidogeno-1 (integrale) e il laminin γ-1 braccio per identificare le regioni interagenti anche per studiare l'orientazione relativa dei domini N-terminale di entrambe le proteine. I dati SAXS per il complesso ha reso un Rg di 10,9 nm (± 0,4) e un Dmax di 35 nm. Abbiamo utilizzato MONSA per ottenere la struttura a bassa risoluzione dell'intero complesso, che ha suggerito che, infatti, soltanto la regione C-terminale di entrambe le proteine partecipano nel mediare interazioni, mentre il resto dei domini sono molto distanti tra loro ( Figura 3, Video 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58538/58538fig1.jpg"> Figura 1. Schemi di set-up SAXS. Una preparazione monodispersed di biomolecole o loro complessi è preparata, seguita dall'esposizione ai raggi x ad alta energia. A seconda dell'origine (ad es., in-House vs synchrotron), l'energia dei raggi x e il campione a distanza di origine può variare. Modello di dispersione dei raggi x (che dipende dalla dimensione e forma di biomolecole) è registrata e radialmente in media per ottenere una trama 1-dimensionali (1D) che contiene informazioni sull'intensità di luce diffusa rispetto all'angolo di scattering. Come molecole di buffer anche diffondono la luce, i contributi da queste molecole vengono sottratte per ottenere un modello di dispersione di biomolecole di interesse. Presso il sincrotrone, prima della raccolta di dati SAXS, un passo ulteriore purificazione mediante cromatografia di esclusione/ad alte prestazioni in linea formato anche in genere viene eseguito (vista superiore). Questo passaggio è fondamentale per rimuovere qualsiasi prodotto aggregato e/o degradato, nonché come per rimuovere qualsiasi biomolecole non associato dal complesso. La trama di scattering 1D viene convertita la trama di distribuzione di coppia elettrone-distanza (P(r) trama), che fornisce il raggio di girazione e dimensione massima delle particelle di biomolecole. Questa trama è utilizzata come file di input per l' ab-initio modellazione pacchetti (cioè, DAMMIN/DAMMIF) per ottenere strutture a bassa risoluzione di biomolecole, o altri pacchetti (cioè, SASREF/CORAL) se la struttura ad alta risoluzione delle parti di le biomolecole o singole biomolecole del complesso è noto.  <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58538/58538fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58538/58538fig2.jpg"> Figura 2. (A) un terreno di un'intensità di sparsi luce vs angolo di scattering (q = 4πsinθ/λ, nm-1) suggerendo la qualità di biomolecole (bassa regione) e forma (alta regione) di biomolecole. (B) la distribuzione di coppia elettrone-distanza P(r) determinato utilizzando i dati di scattering suggeriscono una forma allungata di biomolecole sotto inchiesta (laminina γ-1, nidogeno-1 e loro complesso). (C) Kratky trama suggerendo che nidogeno-1 e laminin γ-1 proteine non sono spiegati. (D) Guinier trama per nidogeno-1, laminina γ-1 e il loro complesso, che indica la regione lineare per la determinazione del raggio di girazione utilizzando dati a bassa dispersione dell'angolo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58538/58538fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58538/58538fig3.jpg"> Figura 3. Struttura a bassa risoluzione del complesso di nidogeno-1 e laminin γ-1 ottenuta da analisi di insiemi di dati unite utilizzando il programma di MONSA. La combinazione di colori è lo stesso come nella figura 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58538/58538fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Movie 1" src="/files/ftp_upload/58538/58538movie1.jpg"> Video 1. La struttura a bassa risoluzione del nidogeno-1 e laminin complesso γ-1. Questo film è stato preparato utilizzando PYMOL di visualizzare varie caratteristiche strutturali del complesso. La struttura cristallina del complesso laminin-nidogeno (PDB ID: 1NPE) è indicato come cartoni animati nastro, evidenziando l'interazione siti per questo complesso. La combinazione di colori è lo stesso come nella figura 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58538/complex_movie.mpg" target="_blank">Per favore clicca qui per vedere questo video. (Tasto destro per scaricare.)</a>

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Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering

Qui, presentiamo come Scattering di raggi x piccolo angolo (SAXS) può essere utilizzato per ottenere informazioni sulle buste a bassa risoluzione che rappresentano le strutture macromolecolari. Quando utilizzato in combinazione con tecniche ad alta risoluzione strutturale come la cristallografia a raggi x e risonanza magnetica nucleare, SAXS è in grado di fornire approfondimenti dettagliati in proteine di multidomain e complessi macromolecolari in soluzione.

Studi strutturali di macromolecole in soluzione con piccolo angolo x-ray Scattering

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biochimica come dimensioni, forma e cambiamenti conformazionali delle biomolecole e dei loro complessi. Il vantaggio principale di questa tecnica è che gli esperimenti possono essere eseguiti in condizioni tampone fisiologicamente rilevanti in un ambiente in cui le biomolecole sono stabili. SAXS è una tecnica gratuita per molti altri metodi di biologia biofisica e strutturale.Combinare SAXS con questi metodi può aiutarci nello sviluppo di terapie basate sulla struttura. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sui complessi biomolecolari, può anche essere applicato ad altri sistemi come lo studio dei nanopartici e la somministrazione di farmaci versicoli. In generale, gli individui nuovi a questo metodo avranno difficoltà perché appare come un processo travolgente e complicato, per passare dai dati di scattering grezzi alle strutture a bassa risoluzione.La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto la pipeline di analisi dei dati per ottenere modelli strutturali da dati grezzi è difficile da apprendere perché comporta l'uso di molti pacchetti diversi di software. Ci sono alcuni pacchetti software utili per l'analisi dei dati SAXS. Questi includono SCATTER, BioXTAS RAW e la suite ATSAS.In questo video, forniremo una panoramica dei passaggi generali da adottare quando si analizzano i dati SAXS grezzi, utilizzando la suite di programmi ATSAS. Per iniziare, installare e caricare la suite di programmi ATSAS. Aprire il programma PRIMUS/Qt e passare all'opzione Apri menu.Qui, seleziona fino a 13 file di dati di interesse. I file di dati devono essere nel formato ASCII, in cui la prima colonna è l'asse del vettore s e la seconda colonna è l'intensità. Ripetere questo passaggio solo per i dati del buffer, inserendo questi dati in un secondo menu Strumenti.Passare quindi alla finestra Elaborazione dati e selezionare Sottrai. Ciò genererà una curva di scattering sottratta, che rappresenta solo la dispersione dalla macromolecola di interesse. Per eseguire l'analisi di Guinier, iniziare con una curva di dispersione sottratta buffer caricata in PRIMUS/Qt.Quindi fai clic su Raggio di Gyration, che aprirà il Mago Primus Guinier. A questo punto, verrà visualizzato un grafico che mostra il registro naturale dell'intensità rispetto agli angoli di dispersione al quadrato. Per ottenere un raggio preliminare di rotazione, individuare la finestra del prompt dei comandi e utilizzare la funzione Autorg.Dopo aver spinto Autorg, fare clic sul limite superiore verso l'alto di uno, quindi verso il basso uno per forzare il programma ad aggiornare le misurazioni statistiche. In alternativa, immettere più file contemporaneamente facendo clic sullo stesso prompt aperto e selezionando più nomi di file di dati evidenziandoli nello stesso modo descritto in precedenza. Per iniziare l'analisi di Kratky, fare clic per selezionare il nome del file di dati.In questo modo verranno tracciati i dati nella finestra. Quindi, selezionate Plottaggio( Plot). Quindi, sotto il pulsante Trama, fai clic su Kratky Plot.Di conseguenza, le proteine globulari mostrano un picco GALC-ean mentre le proteine dispiegate mostrerà un plateau invece di un picco e assomiglieranno a un grafico iperbolico come quello mostrato qui. Il buffer di carico ha sottratto ancora una volta i dati per ogni concentrazione in PRIMUS/Qt. E nella scheda Elaborazione fare clic su Scala e ispezionare ogni curva e il numero di scala i, che è correlato alle diluizioni effettuate dal campione originale.Dopo l'ispezione, unire i dati facendo clic sul pulsante Unisci nella finestra Elaborazione. Per generare il plottaggio di distribuzione della distanza, caricare le curve di dati unite in PRIMUS/Qt, quindi fare clic su Distribuzione distanza nella scheda Analisi. Regolare l'intervallo di dati dei dati uniti per evitare rumori significativi all'estremità posteriore dei dati non elaborati.Inoltre, omettete i punti dati vicino al beamstop nella regione low-q selezionando il valore dell'intervallo inferiore e aumentando il numero. Per determinare il Dmax, iniziare con un intervallo di cinque volte il raggio di rotazione ottenuto dall'analisi di Guinier. Quindi, diminuire gradualmente questo valore fino a quando il grafico di distribuzione della distanza non scende bruscamente a zero sull'asse y e non ha una lunga coda prima di avvicinarsi allo zero.Controllare che il raggio sperimentale di rotazione rispetto al grafico di intensità, che è derivato dall'approssimazione di Guinier e dal raggio di distribuzione della distanza tra rotazione e numeri di intensità, sia simile. Qui, l'intensità della luce diffusa è mostrata tracciata contro l'angolo di dispersione, suggerendo sia la qualità delle biomolecole nidogen-1, la laminina gamma-1 e il loro complesso, sia la loro forma. La distribuzione della distanza della coppia di elettroni determinata dai dati di scattering suggerisce che le biomolecole hanno una forma allungata e il grafico di Kratky suggerisce che le proteine sono in uno stato piegato, poiché i dati tendono ad stabilizzarsi, o addirittura ad aumentare nell'intervallo q più grande e mancano di una forma curva a campana.Inoltre i grafici di Guinier, che usano dati a basso angolo di dispersione, indicano la regione lineare per la determinazione del raggio di rotazione, che è mostrato qui per nidogen-1, gamma-1 laminina e il loro complesso. Per studiare i complessi proteina-proteina, la MONSA è stata utilizzata per ottenere la struttura a bassa risoluzione dell'intero complesso gamma-1 di laminina nidogeno-1, suggerendo che solo la regione C-terminale di entrambe le proteine partecipa alle interazioni di mediazione mentre il resto dei domini è lontano l'uno dall'altro. Non dimenticare che lavorare con la radiazione di Sincrotrone può essere estremamente pericoloso e le precauzioni e la sicurezza delineate da ogni diversa linea di fascio devono sempre essere prese durante l'esecuzione della raccolta iniziale dei dati.

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