Name: structural studies of macromolecules in solution using small angle x-ray scattering
Uploaded: 2018-11-05T13:00:00
Duration: 7 min 19 s
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Este projecto foi apoiado pelo RGPIN NSERC-2018-04994, programa de inovação Campus Alberta (RCP-12-002 C) e Alberta prião Research Institute / subvenções de Alberta inova Bio soluções (201600018) atribuídas aos M.O. TRP é uma cadeira de pesquisa do Canadá em RNA & Biofísica de proteínas (201704) e reconhece a concessão NSERC descoberta (04003-RGPIN-2017). TM é financiado pela subvenção NSERC descoberta de TRP.

1. SAXS amostra preparação e aquisição de dados
<ol><li>Preparação da amostra:<ol>
<li>Experiências SAXS exigem amostras homogênea, estável e não concentração de proteína; observar a estabilidade e estado oligoméricos com cromatografia de exclusão (S), DLS e/ou AUC antes da coleta de dados.</li>
		<li>Submeter amostras (nidogen-1 e laminina γ-1 neste caso) para análise DLS e tricine SDS-PAGE para visualizar amostra pureza10. Nota: As amostras podem abranger uma gama de concentrações (1-4 mg/mL), dependendo do seu tamanho, seu comportamento de solução, como a própria associação e agregação juntamente com estabilidade; aqui, cinco concentrações de nidogen-1, (139 kDa), três de laminina γ-1 (109 kDa) e quatro do complexo equimolar S-purificado foram preparadas como descrito anteriormente,10.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coleta de dados:<ol>
<li>Colete dados SAXS, usando um sistema in-house ou síncrotron, de acordo com as orientações do fabricante ou instalação. Nota: Os dados utilizados neste trabalho foram coletados usando uma casa sistema (consulte Tabela de materiais) que contém uma câmera pinhole-3 equipado com + 002 microfoco selada o tubo (radiação de Cu Kα em 1,54 Å) e óptica Confocal Max-fluxo (CMF), operando a 40 w. O sistema também é equipado com um detector de nm 200 multi fio 2D para coleta de dados. No entanto, com a disponibilidade dos síncrotrons modernos na França, Alemanha, Reino Unido, EUA e outros países, que fornecem acesso a um set-up S-SAXS que facilita a separação de uma preparação monodispersas de agregação/degradação possível, nós agora rotineiramente colete dados em instalações de síncrotron. Um artigo publicado recentemente em um G-quadruplex de DNA11 é um exemplo de uma estratégia de coleta de dados S-SAXS. Neste caso, SAXS foram recolhidos na faixa de 0,08 ≤ q ≤ 0,26 Å por 3 horas para nidogen-1 (2.0, 2.5, 3.0, 3.5 e 4,0 mg/mL); a laminina γ-1 (1.5, 2.0 e 2,5 mg/mL) e seu complexo (0.8, 1.0, 1,25 e 1,5 mg/mL).</li>
		<li>Reduza os dados para o buffer e amostras usando o software de processamento específico para o sistema. Subtrai a contribuição do buffer de dados de proteínas usando um programa como o PRIMUS/qt12 (Figura 2A).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. análise de dados
Nota: Atualmente, existem alguns pacotes de software que são úteis para análise de dados SAXS: ScÅtter43 (o download está disponível em www.bioisis.net), bioXtas-primas44e o ATSAS suíte13. Esta seção fornece uma visão geral das etapas gerais a serem tomadas quando SAXS brutos a analisar dados usando o ATSAS program suíte e etapas específicas são tomadas a partir do ATSAS 2.8.1 baixar. Outros programas podem ser usados e são brevemente discutidos mais tarde.
<ol><li>Subtração de reserva Nota: Estes passos são relevantes para amostras SAXS estáticas somente.<ol>
<li>Selecione a opção de menu "OPEN" no PRIMUS/qt e selecione os arquivos de dados de interesse. Esteja ciente de que os arquivos de dados devem estar no formato ASCII, em que a primeira coluna é o eixo de s-vector e a segunda coluna é a intensidade. Repita este passo de recolha de dados para o buffer se inserindo esses dados no mesmo menu.</li>
		<li>Selecione "SUBTRACT" na janela de processamento de dados, que irá gerar uma curva de espalhamento subtraídos representando apenas dispersando da macromolécula de interesse. Repita esta etapa para cada concentração.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Análise de Guinier<ol>
<li>Para efectuar a análise de Guinier, carrega uma curva de dispersão de reserva subtraída em PRIMUS/qt como descrito anteriormente na etapa 2.1.1.</li>
		<li>Clique em "Raio de giração", que prosseguirá na abertura do Primus Guinier assistente; um lote do ln(I) vs q2 será exibido.</li>
		<li>Para obter uma preliminar Rg , use a função "AUTORG", que é um módulo externo criado no PRIMUS/Qt localizar o botão de "Autorg" e clique nele.</li>
		<li>Entrada de vários arquivos ao mesmo tempo realçando todos e inseri-los no menu do lado direito, muito semelhante ao 2.1.1.</li>
		<li>Usar o enredo de Guinier criado anteriormente para avaliar a qualidade de dados; a linha verde sob o enredo de Guinier mostra a trama de resíduos que representa uma linearidade do ajuste. Esteja ciente de que a não-linearidade na análise Guinier poderia ser um sinal de agregação de amostra e análise mais profunda não deve ser realizada neste caso. Nota: Um ajuste linear de Guinier dá um R,g , com um pequeno erro (< 5%) e sugere uma amostra de alta qualidade.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kratky análise<ol>
<li>Carrega os dados para ser visualizado em uma maneira similar como descrito acima.</li>
		<li>Clique sobre a "caixa de seleção" ao lado do nome do arquivo de dados. Este traçará os dados em uma janela separada.</li>
		<li>Clique no botão de "Enredo" seguido por "Conspiração Kartky" seleção no menu suspenso.</li>
		<li>Este traçará os dados como "q2 x L(q) vs q". Esteja ciente de que proteínas globulares exibem um pico Gaussian, enquanto proteínas desdobradas exibirá um platô em vez de um pico e se assemelham a um plano hiperbólico17.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mesclagem de dados<ol>
<li>Buffer de carga subtraída dados para cada concentração no PRIMUS/qt mais uma vez, como na etapa 2.1.1.</li>
		<li>Para mesclar os dados, basta clicar no botão "MERGE" na janela de processamento.</li>
		<li>Inspecione cada curva e o número da escala, que se correlaciona com as diluições, feitas a partir da amostra original. Nota: As amostras na maior concentração exibem menos ruído na região da cauda das curvas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Distribuição de reacionamento<ol>
<li>Para gerar o enredo de reacionamento, carrega as curvas de dados mesclados em PRIMUS/qt como descrito anteriormente.</li>
		<li>Clique no botão para abrir uma nova janela apresentando os dados mesclados de intensidade de dispersas luz vs q e par-distância distribuição função plot no lado direito de "Distribuição de distância". Nota: As informações do lado direito apresentam a qualidade geral dos cálculos da função de distribuição de par-distância.</li>
		<li>Ajuste o intervalo de dados os dados mesclados para evitar qualquer ruído significativo no fim da cauda dos dados brutos.</li>
		<li>Omita os pontos de dados perto da paragem do feixe na região do baixo-q.</li>
		<li>Para determinar o início Dmáximo, com uma gama de ~ 5 vezes o Rg obtidos a partir da análise de Guinier. Gradualmente diminua esse valor até que a trama de reacionamento não cair abruptamente a zero no eixo y e não tem uma cauda longa antes de se aproximar de zero.</li>
		<li>Verifique o Experimental Rg/0 (derivado de Guinier aproximação) e P(r) Rg/0números são semelhantes. Nota: Em alguns casos, mais manipulação no intervalo de dados pontos de dados e alfa (um parâmetro de regularização que diz ao programa o rácio de quanta atenção a lisura da distribuição em relação ao encaixe os dados experimentais) é também necessário21 para obter um lote de P(r) de boa qualidade.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. um grânuloinitio b modelagem e uma média de
<ol><li>Uma vez que os dados coletados em várias concentrações são mesclados, ou os dados coletados usando S-SAXS são minimizados, e foram verificadas a Kratky enredo, a trama P(r) e a análise de Guinier, calcular estruturas de baixa resolução de macromoléculas e seus complexos. Esse pipeline pode ser usado para estudar estruturas de solução e interações de ácidos nucleicos, proteínas e ácidos nucleicos-proteína ou proteína-proteína complexos10,11,21,22,23 ,24,25,26,,27,28,29,30,31,32 ,33,34. Um dos programas mais populares é DAMMIN, desenvolvido pela Svergun35 e uma parte da ATSAS pacote13, que utiliza protocolos de recozimento simulados com dados de entrada preliminares sobre o Rg e Dmáx . Os princípios e abordagens de modelagem ab initio são descritos em detalhe em outro lugar18,36.</li>
</ol>

Autores têm sem divulgações para declarar.

Os passos críticos de análise de dados SAXS descritas na seção de protocolo deste papel incluir reserva, Guinier análise, análise Kratky, mesclando dados e subtração reacionamento distribuição. A modelagem ab initio do grânulo é demasiado extensa para ser abordado aqui em detalhes e, portanto, está apenas coberta brevemente.
Os síncrotrons (por exemplo, DESY em Alemanha, diamante no Reino Unido e ESRF em França), é possível coletar dados SAXS para uma fração muito pequena (~ alguns µ l) de cada amostra como as frações estão sendo eluída da coluna s é conectado em linha (ver Figura 1 de ). Os dados SAXS elasticamente dispersos é radialmente média usando os pacotes fornecidos pelo fabricante do instrumento ou o síncrotron antes subtração de buffer pode ocorrer. Os dados resultantes de 1D representam a quantidade de luz dispersa (em eu(q)) sobre o Y-eixo e ângulo de dispersão (q= 4πsinθ/λ, onde λ é o comprimento de onda de incidente X-raios) e é descrito na Figura 1. Do programa PRIMUS/qt12 é usado para subtrair diretamente qualquer fundo devido a reserva e é descrito na seção 1.1. Outros programas tais como; ScÅtter43 (o download está disponível em www.bioisis.net) com um tutorial disponível em https://www.youtube.com/channel/UCvFatdC5HcZOLv6OSjblfeAe bioXtas RAW44 (https:// disponível em bioxtas-raw.readthedocs.io/en/Latest/index.html) pode ser utilizado como uma alternativa para o pacote ATSAS.
A análise de Guinier fornece informações sobre agregação de amostra e homogeneidade bem como fornecendo o raio de giração (Rg) para a macromolécula de interesse baseado nos dados SAXS da região baixa s 14. Um enredo é construído com PRIMUS/qt para dados SAXS obtidos de cada concentração, seguida por curva de encaixe com o alcance máximo de até 1,30 para q x Rg. Uma preparação de amostra monodispersas deve fornecer um enredo linear de Guinier nesta região (Figura 2D), Considerando que os resultados de agregação em um não-linear Guinier lote15,16. Se a análise de Guinier é linear, o grau de "unfoldedness" de uma macromolécula de interesse pode ser observado com o enredo Kratky, que é útil quando decidir realizar a modelagem de corpo rígido ou construir conjuntos de modelos de baixa resolução. Uma proteína globular aparecerá em um Kratky trama para ter uma curva em forma de sino, prorrogar as moléculas ou peptídeos desdobrados aparecerá planalto ou mesmo aumentar na faixa maior q e falta a forma de sino (Figura 2).
Obtendo o Rg de Guinier análise só considera pontos de dados da região de baixo q do 1 D gráfico de dispersão (Figura 2D), no entanto, é possível usar quase o todo conjunto de dados para executar uma transformação de Fourier indireta para converter a informação recíproca-espaço de ln (I (q)) vs (q) em uma função de distribuição de distância do espaço real (P(r)) que fornece informações sobre Dmax e Rg (Figura 2B) A forma da trama P(r) representa a conformação bruta solução a macromolécula de interesse18,19. a conversão de dados recíproca-espaço para dados real-espaço é uma etapa crítica, mas uma descrição detalhada não é dentro do escopo deste artigo. Portanto, se referir a um artigo por Svergun20 para entender cada parâmetro.
Depois de subtraído o buffer de dados em concentrações individuais são processados através da análise de Guinier com um valor consistente para R,g, seguido de investigar seu padrão dobrável usando análise Kratky, estes dados podem ser mesclados. Os dados mesclados para nidogen-1, laminina γ-1 e seu complexo foram processados conforme descrito acima e o resultante reacionamento parcelas são apresentados na Figura 2B. Idealmente, um deve calcular também a função de distribuição de par-distância reacionamento para cada concentração para determinar se os dados SAXS coletados para cada concentração fornecem similar Rg e valores Dmáx . Se o Rg e Dmáximo permanecem similar ao longo de uma ampla gama de concentrações, em seguida, o usuário deve proceder. Note-se que, dependendo do sinal, dados podem ser truncados antes da mesclagem de dados. Este é frequentemente o caso se as concentrações e/ou o peso molecular das macromoléculas sob investigação é baixa.
Análise de forma baixa resolução usando DAMMIN pode ser executada em vários modos (por exemplo, rápido, lento, modos de peritos, etc.). O modo rápido é um primeiro passo ideal para avaliar se o enredo de reacionamento fornece modelos de boa qualidade. Normalmente, pelo menos 10 modelos devem ser obtidos para cada parcela de reacionamento verificar se são obtidos resultados reprodutíveis, em termos de estrutura de baixa resolução, com uma baixa bondade de ajuste parâmetro chamado χ (um valor de 0.5-1.0 é considerado bom baseado no nosso exame extenso ), um valor que descreve um acordo entre experimentalmente coletados dados SAXS e modelo-derivado. Para efeito de publicação, normalmente usamos o modo lento ou perito e calcular pelo menos 15 modelos. Além de DAMMIN, uma versão mais rápida do, DAMMIF37, bem como GASBOR38 também são alternativas. Além disso, para estudo da proteína-proteína ou complexos de ácido nucleico da proteína, é possível usar o MONSA programa35, que facilita a instalação simultânea dos dados individuais de SAXS para macromoléculas, bem como seu complexo. Para mais detalhes sobre cálculos de modelo de alta resolução, bem como para estudos de interação RNA-proteína, se referir a um artigo recente por Pinheiro et al.3.
SAXS é teoricamente simples mas, sem dúvida, um método altamente complementar a outras ferramentas de biologia estrutural e resultados em baixa resolução dados estruturais que podem ser usados isoladamente ou em conjunto com técnicas de alta resolução para elucidar informações sobre a estrutura macromolecular e dinâmica. Enquanto uma preparação monodispersas de macromoléculas e seus complexos pode ser obtida, SAXS podem ser utilizados para estudar a estrutura em solução e interações de qualquer tipo de macromolécula biológica. No caso do complexo discutido aqui, é notável que menos de 10% da área de superfície acessível globalmente de nitrogênio-1 e laminina γ-1 está enterrado neste complexo, Considerando que o resto dos domínios de ambas as proteínas são livremente acessíveis para interagir com outros proteínas na matriz extracelular para manter a sua rigidez estrutural (Figura 3). Obtenção de tais informações para um complexo com ~ 240kDa seria muito desafiador usando outras técnicas de biologia estrutural como cristalografia de raios x, NMR e microscopia Cryo-EM.
Descobrindo a estrutura através de cristalografia de raios x ou NMR é um processo inerentemente demorado. Este gargalo na determinação da estrutura é uma área onde SAXS mostra sua força como uma técnica estrutural; aquisição de dados para uma única experiência SAXS pode levar menos de uma hora e com a ajuda do software de análise simplificada, a análise pode ser feita rapidamente e eficientemente. SAXS tem o potencial de aumentar significativamente a taxa de transferência de estudos estruturais como uma técnica autônoma porque oferece um modelo de baixa resolução da estrutura macromolecular antes de dados de alta resolução estão disponíveis. Uma barreira para outras técnicas estruturais é a exigência de uma amostra altamente pura, concentrada para aquisição de dados, o que exige um alto nível de expressão de proteínas e estabilidade durante um longo período de tempo. Enquanto SAXS amostras também a necessidade de ser puro e concentrado, os volumes de amostra são aproximadamente 100 µ l fazendo SAXS um método relativamente barato de análise em comparação com outras técnicas estruturais. Além disso, SAXS, juntamente com a cromatografia de exclusão está se tornando cada vez mais comum que fornece um passo adicional de controle de qualidade. Recentemente, tem havido avanços fortes na combinação de dados NMR e SAXS, usando o método de otimização de Ensemble (Moe)45,46 elucidar sistemas flexíveis. Em um artigo recente de Mertens e Svergun47, os autores descrevem vários exemplos recentes de EOM SAXS em combinação com NMR, juntamente com muitos outros exemplos de dados SAXS sendo usados em conjunto com NMR. Continuamente avanços no campo de SAXS, e novas técnicas estão sendo desenvolvidos para SAXS ser usado em conjunto com, não só complementar a, outras técnicas estruturais. Consequentemente, acreditamos que a demanda por SAXS só aumentarão ao longo do tempo, especialmente em conjunto com NMR para caracterizar sistemas dinâmicos onde as funções são definidas pela flexibilidade.

As células contêm intricadas redes de proteínas que agem como máquinas moleculares para realizar funções celulares tais como cascatas de sinalização e manter a integridade estrutural. As formas em que estes diferentes componentes mover em interagem no espaço tridimensional dá origem a funções específicas a macromoléculas. A importância da estrutura de proteínas, dinâmica e interações na determinação de função tem proporcionado a necessidade de continuamente em evolução, complexas técnicas medir essas propriedades. Destes, ressonância magnética Nuclear (RMN), cristalografia de raios x (XRC) e mais recentemente, microscopia Cryo-elétron (CEM) fornecem informações estruturais de alta resolução. No entanto, XRC e CEM produzem estruturas de um dos muitos Estados biomolecular e faltam de informação sobre a dinâmica da estrutura da proteína, enquanto a determinação de estrutura 3D por NMR é normalmente limitada a pequenas proteínas globulares. Uma maneira de ultrapassar estas limitações é utilizar pequeno ângulo x-ray Scattering (SAXS) para gerar envelopes moleculares de sistemas grandes, vários domínios ou complexados e combinar as estruturas macromoleculares rígidas de alta resolução para elucidar o global arquitetura e características dinâmicas.
SAXS produz envelopes de baixa resolução de complexos macromoleculares com uma resolução de aproximadamente 10-20 Å 1, dando uma visão não só em estrutura, mas também as características dinâmicas que exibe o complexo. Embora SAXS utiliza raios x para descobrir a estrutura molecular, é ao contrário XRC em que a orientação isotrópica aleatória das partículas em solução não leva a difração, mas prefiro a dispersão, que não é possível gerar resolução atômica. Em vez disso, um elétron "envelope" da macromolécula é gerado, que representa uma média das conformações que exibe a macromolécula. Esta informação pode ser usada em montagem direta de estruturas de resolução atômica anteriormente resolvido para inferir a regiões de flexibilidade em uma única proteína ou subunidade organização ou dinâmica em um complexo maior, várias proteína. SAXS dados são coletados nos síncrotrons usando raios-x monocromáticos de alta energia ou de fontes internas, que oferecem uma fonte de raios-x mais fraca que exigem horas ao invés de segundos de tempo de exposição da amostra (Figura 1). Dados SAXS são muitas vezes coletados de várias amostras com uma única instalação experimental e reserva, que exigem um tempo prolongado para coletar uma rodada de dados úteis em um sistema. As amostras devem, portanto, ser estável e não-agregando pelo menos algumas horas com base em métodos de controle de qualidade pode ser verificada como Difusão dinâmica da luz (DLS) e/ou análise analítica se (AUC) para obter alta qualidade SAXS dados2 , 3. aqui nós fornecemos uma descrição prática de SAXS, os princípios por trás de seu uso, benefícios, limitações e preparação da amostra e coleta de dados fortemente no foco e análise, junto com tocar brevemente no ab initio modelagem usando o proteínas de matriz extracelular nidogen-1 e laminina γ-1 como um exemplo experimental.
Princípios, benefícios e limitações de SAXS:
O guia principle(s) para trás SAXS é relativamente simples: uma solução da preparação monodispersas de macromolecule(s) de interesse é colocada dentro de um capilar e é exposta a um feixe de raios-x monocromático de alta energia. Os fótons causam elétrons do shell atômico para começar a oscilar, resultando em uma onda esférica, sendo emitida da mesma energia e comprimento de onda. Desde que cada elétron irá oscilar, se alcançará um fundo constante, e a densidade de elétrons resultante da macromolécula é contrastada com o plano de fundo. A intensidade de espalhamento resultante é coletada em função do ângulo de espalhamento, 2Θ (Figura 1).
Enquanto outras técnicas tais como XRC, NMR e CEM fornecem informações estruturais ao nível atómico, existem vários benefícios para SAXS que outras técnicas não podem fornecer. SAXS pode ser executada em quase qualquer buffer e não requer qualquer preparação especial da amostra. Isto é particularmente importante no estudo do comportamento e estrutura das macromoléculas sob condições variáveis, tais como a presença ou ausência de mono - ou cátions divalentes ou alterações no pH4,5. SAXS tem a capacidade de fornecer informações sobre regiões flexíveis de uma macromolécula6, as outras técnicas listadas podem lutar com alguma coisa. Portanto, SAXS pode ser usado como uma técnica de cortesia forte, com as porções estáveis de uma macromolécula sendo estudada com XRC, NRM ou CEM e a toda macromolécula ou complexa analisados em baixa resolução com SAXS e combinados usando várias ferramentas de análise de tais como FoXSDock7 ou CRYSOL8. Desde SAXS é uma técnica de solução, muitas vezes é usado para confirmar se a estáticas estruturas tais como os obtidos por XRC são consistentes em solução6. SAXS também tem a vantagem de ser uma técnica que requer uma quantidade relativamente pequena de investimento de amostra (normalmente de 50 a 100 µ l) e uma quantidade relativamente pequena de tempo de experiência (30 min - 1 h).
A maior limitação de SAXS é a vulnerabilidade a agregação de amostra e/ou degradação, que pode levar a previsões estruturais incorretas. Uma agregação, nem tão baixa quanto 5%, pode espalhar a luz em quantidades muito elevadas, levando a uma superestimação da dimensão máxima da partícula (Dmáx) e raio de rotação (Rg). Por outro lado, a degradação da amostra pode levar a uma subestimativa de propriedades moleculares. Esta vulnerabilidade surge de SAXS, sendo uma técnica de cálculo da média, o que significa que a homogeneidade da amostra é fundamental para alcançar resultados confiáveis e reprodutíveis. Qualquer amostra que deve ser analisado por SAXS deve, portanto, se submeter a vários métodos de purificação e verificações de homogeneidade, como eletroforese em gel de desnaturação e nativo, cromatografia de exclusão, luz dinâmica espalhamento e analítico ultracentrifugação. Muitas vezes, SAXS beamlines irá executar amostras através de cromatografia líquida de alta performance como um controle de qualidade final passo antes SAXS (S-SAXS)3,9. SAXS dados devem ser coletados em várias concentrações e o Rg de cada conjunto de dados devem ser comparados, assegurando uma estreita semelhança para evitar interações interpartícula e agregação, o que resulta em uma superestimação da partícula dimensões, levando à análise de dados imprecisos e modelagem. Desde que a dispersão depende da concentração e o tamanho, macromoléculas menores podem exigir uma otimização mais específica do intervalo de concentração. Isto é devido o Teorema da reciprocidade, onde grandes tamanhos dispersam para pequenos ângulos e tamanhos pequenos para grandes ângulos. Isto manifesta-se na coleta de dados, onde euO é proporcional a R6, onde R é o raio da partícula. Uma limitação final de SAXS é o potencial para danos de radiação para a amostra durante a exposição, que pode levar à distorção dos dados. É boa prática para comparar a qualidade da amostra antes e após a exposição de amostra SAXS para garantir que isto não está ocorrendo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>HEK 293 EBNA Cell Line</td>
			<td>In-Lab availability</td>
			<td>-</td>
			<td>Cell line used to overexpress protein(s)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni Sepharose High Performance histidine-tagged protein purification resin</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17524801</td>
			<td>Affinity protein purification resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 Increase 10/300</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28990944</td>
			<td>SEC Column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;KTA Pure FPLC</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>-</td>
			<td>FPLC System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>-</td>
			<td>Spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic Reagents (NaCl, Tris-HCl etc.)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S-MAX3000</td>
			<td>Rigaku</td>
			<td>-</td>
			<td>SAXS Pinhole Camera System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer Nano-S</td>
			<td>Malvern Instruments Ltd</td>
			<td>-</td>
			<td>Dynamic Light Scattering instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1&#181;m Filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>JVWP04700</td>
			<td>Used to Concentrate Sample Prior to DLS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin cleavage kit</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab207000</td>
			<td>Thrombin cleavage to remove His tag</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strep-Tactin Sepharose Column</td>
			<td>IBA</td>
			<td>2-1201-010</td>
			<td>Strep-Tag Affinity Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-desthiobiotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>533-48-2</td>
			<td>Elution of Strep Tag Protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAXGUI</td>
			<td>Rigaku</td>
			<td>-</td>
			<td>Data Collection for SAXS and data reduction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATSAS Suit</td>
			<td>Franke et al., 2017</td>
			<td>-</td>
			<td>SAXS Data Analysis Software program suite</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRIMUS</td>
			<td>Konarev et al., 2003</td>
			<td>-</td>
			<td>Buffer Subtraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GNOM</td>
			<td>Svergun, 1992</td>
			<td>-</td>
			<td>Rg, Dmax and p(r) Calculation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAMMIF</td>
			<td>Franke and Svergun, 2009</td>
			<td>-</td>
			<td>Ab initio model calculation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAMAVER</td>
			<td>Volkov and Svergun, 2003</td>
			<td>-</td>
			<td>Averaged Solution Conformation calculations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MONSA</td>
			<td>Svergun, 1999</td>
			<td>-</td>
			<td>Simultaneous model fitting for the complex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GASBOR</td>
			<td>Svergun et al., 2001</td>
			<td>-</td>
			<td>Alternative Ab initio model calculations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTS Software V6.20</td>
			<td>Malvern Instruments Ltd</td>
			<td>-</td>
			<td>DLS supplied instrument software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyMOL</td>
			<td>Schrodinger, LLC.</td>
			<td>-</td>
			<td>The PyMOL Molecular Graphics System V2.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Protein Data Bank</td>
			<td>Berman et al., 2000</td>
			<td>-</td>
			<td>PDB ID: 1NPE</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

structural studies of macromolecules in solution using small angle x-ray scattering

Interações da proteína-proteína envolvendo proteínas com vários domínios globulares apresentam desafios técnicos para determinar a forma como tais complexos e como os domínios são orientados/posicionado. Aqui, um protocolo com o potencial para elucidar quais interações mediato domínios específicos no sistema multicomponente através de modelagem ab initio é descrito. Um método para o cálculo de estruturas de solução de macromoléculas e seus módulos (assemblies) é fornecido que envolve a integração de dados de espalhamento de raios-x de pequeno ângulo (SAXS), cromatografia e estruturas de resolução atômica juntos em uma abordagem híbrida. Um exemplo específico é o complexo de completos nidogen-1, que reúne proteínas da matriz extracelular e forma um nanostructure estendida, curvo. Um dos seus domínios globulares anexa para laminina γ-1, que estruturas da membrana basal. Isto fornece uma base para a determinação exatas estruturas de complexos de proteínas de vários domínios flexível e é ativado por fontes de síncrotron juntamente com sistemas automação cromatografia de exclusão robótica e tamanho. Esta combinação permite análise rápida, em que vários Estados oligoméricos são separados apenas antes da coleta de dados SAXS. A análise produz informações sobre o raio de giração, dimensão das partículas, forma molecular e emparelhamento entre domínios. O protocolo para gerar modelos 3D complexos por encaixe de alta resolução de estruturas de proteínas o componente também é dada.

A abordagem de análise de dados descrita acima foi utilizada para calcular o Rg e Dmax nidogen-1, laminina γ-1 e seu complexo usando a função P(r). Obtivemos valores Rg de 7.20 nm (±0.10), 8,10 nm (±0.20) e 10.9 nm (±0.4) para nidogen-1, laminina γ-1 e seu complexo, respectivamente (Fig. 2A-B). Além disso, valores Dmáximo de 24 nm, 26 nm e 35 nm para nidogen-1, laminina γ-1 e seu complexo respectivamente (Figura 2)10 foram obtidos. O programa DAMMIF foi usado para obter estruturas de baixa resolução de nidogen-1 e laminina γ-1, que sugeriu que as duas proteínas adotam uma forma estendida na solução. Os valores de X e NSD para nidogen-1 (~ 1 e 0,8) e laminina γ-1 (~0.9 e 0,8 respectivamente) foram também no intervalo aceitável. O alinhamento das estruturas de alta resolução, dois domínios de nidogen-1 e dois da laminina γ-1, em suas estruturas de baixa resolução obtidos utilizando SAXS permitiram a identificação de suas regiões de N - e C-terminal10.
Nidogen-1 foi identificado como um parceiro de interação da laminina γ-139,40 e o site de interação foi mapeado usando cristalografia de raios x para o C-terminal domínios41. Entretanto, estruturas de alta resolução só envolveram domínios interagindo e não o nidogen Full-Length-1 ou o braço de γ-1 inteiro laminina. Portanto, nós purificado um complexo contendo nidogen-1 (comprimento total) e o laminina γ-1 braço para identificar as regiões de interação, bem como para estudar a orientação relativa dos domínios de N-terminal de ambas as proteínas. Os dados SAXS para o complexo renderam um Rg de 10.9 nm (±0.4) e um Dmáximo de 35 nm. Utilizamos o MONSA para obter a estrutura baixa resolução de todo o complexo, que sugeriu que na verdade, apenas a região C-terminal de ambas as proteínas participar na mediação de interações, Considerando que o resto dos domínios estão muito afastados uns dos outros ( Figura 3, vídeo 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58538/58538fig1.jpg"> Figura 1. Esquemas de configuração de SAXS. Uma preparação monodispersas de biomoléculas ou seus complexos é preparada, seguido de exposição com raios x de alta energia. Dependendo da fonte (por exemplo, in-house vs síncrotron), a energia de raios-x e a amostra a distância da fonte pode variar. Padrão de dispersão dos raios-x (que depende do tamanho e forma das biomoléculas) é gravado e radialmente em média para obter um lote 1-dimensional (1D) que contém informações sobre a intensidade da luz espalhada em relação ao ângulo de dispersão. Como moléculas de reserva também dispersam a luz, as contribuições destas moléculas são subtraídas para obter um padrão de dispersão das biomoléculas de interesse. No Síncrotron, anteriores à coleta de dados SAXS, uma etapa de purificação adicional usando cromatografia de exclusão/alto desempenho em linha também geralmente é executada (vista superior). Esta etapa é fundamental para remover qualquer produto agregado e/ou degradado, bem como para remover qualquer biomoléculas desacopladas do complexo. O enredo de dispersão 1D é convertido para a par de elétrons-distância distribuição conspiração (P(r)), que fornece o raio de rotação e a dimensão máxima das partículas de biomoléculas. Este lote é usado como o arquivo de entrada para o ab initio modelagem pacotes (i.e., DAMMIN/DAMMIF) para obter estruturas de baixa resolução de biomoléculas, ou outros pacotes (i.e., SASREF/CORAL) se a estrutura de alta resolução de partes do as biomoléculas ou biomoléculas individuais do complexo são conhecidas.  <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58538/58538fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58538/58538fig2.jpg"> Figura 2. (A) um lote de uma intensidade de dispersas luz vs. ângulo de dispersão (q = 4πsinθ/λ, nm-1) sugerindo que a qualidade das biomoléculas (região baixa) e forma (região alta) de biomoléculas. (B) a distribuição de par de elétrons-distância P(r) determinado a partir dos dados de dispersão sugere uma forma alongada de biomoléculas sob investigação (laminina γ-1, nidogen-1 e seu complexo). (C) Kratky trama sugerindo que nidogen-1 e laminina γ-1 de proteínas não são desdobradas. (D) Guinier trama para laminina γ de nidogen-1,-1 e seu complexo, indicando a região linear para determinação do raio de giração usando dados em ângulo de baixa dispersão. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58538/58538fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58538/58538fig3.jpg"> Figura 3. Estrutura de baixa resolução do complexo de nidogen-1 e laminina γ-1 obtidos pela análise mesclados de conjuntos de dados usando o programa MONSA. O esquema de cores é o mesmo que Figura 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58538/58538fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Movie 1" src="/files/ftp_upload/58538/58538movie1.jpg"> Vídeo 1. A estrutura de baixa resolução do nidogen-1 e laminina γ-1 complexo. Este filme foi preparado usando PYMOL Visualizar várias características estruturais do complexo. A estrutura cristalina do complexo laminina-nidogen (PDB ID: 1NPE) é mostrado como desenhos animados da faixa de opções, destacar o interagindo sites para este complexo. O esquema de cores é o mesmo que Figura 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58538/complex_movie.mpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)</a>

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Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering

Aqui, apresentamos como espalhamento de raio-x do pequeno ângulo (SAXS) pode ser utilizada para obter informações sobre envelopes de baixa resolução que representa as estruturas macromoleculares. Quando usado em conjunto com técnicas estruturais de alta resolução como a cristalografia de raio-x e ressonância magnética Nuclear, SAXS pode fornecer insights detalhadas em vários domínios de proteínas e complexos macromoleculares em solução.

Estudos estruturais de macromoléculas em solução usando o pequeno ângulo de espalhamento de raios-x

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and ...

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da bioquímica, como tamanho, forma e alterações conformais de biomoléculas e seus complexos. A principal vantagem dessa técnica é que os experimentos podem ser realizados sob condições fisiologicamente relevantes de tampão em um ambiente onde as biomoléculas são estáveis. O SAXS é uma técnica complementar para muitos outros métodos biofísicos e estruturais de biologia.A combinação do SAXS com esses métodos pode nos ajudar no desenvolvimento de terapêuticas baseadas em estruturas. Embora este método possa fornecer insights sobre complexos biomoleculares, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como estudar nanoparticals e versículos de entrega de drogas. Geralmente, indivíduos novos nesse método lutarão porque ele aparece como um processo avassalador e complicado, para passar de dados de dispersão bruta para estruturas de baixa resolução.A demonstração visual desse método é fundamental, pois o pipeline de análise de dados para obter modelos estruturais a partir de dados brutos é difícil de aprender porque envolve o uso de muitos pacotes diferentes de software. Existem alguns pacotes de software que são úteis para a análise de dados SAXS. Estes incluem SCATTER, BioXTAS RAW e a suíte ATSAS.Neste vídeo, forneceremos uma visão geral das etapas gerais a serem tomadas ao analisar dados brutos do SAXS, usando o conjunto de programas ATSAS. Para começar, instale e carregue o conjunto de programas ATSAS. Abra o programa PRIMUS/Qt e vá para a opção Menu Aberto.Aqui, selecione até 13 arquivos de dados de interesse. Os arquivos de dados devem estar no formato ASCII, no qual a primeira coluna é o eixo s-vetor e a segunda coluna é a intensidade. Repita esta etapa para os dados apenas do buffer, inserindo esses dados em um segundo menu Ferramentas.Em seguida, navegue até a janela Processamento de dados e selecione Subtrair. Isso gerará uma curva de dispersão subtraída, representando apenas a dispersão da macromolécula de interesse. Para realizar a análise de Guinier, comece com uma curva de dispersão subtraída de buffer carregada em PRIMUS/Qt.Próximo clique em Raio de Gyration, que abrirá o Assistente Primus Guinier. Neste ponto, será exibido um gráfico mostrando o registro natural da intensidade versus ângulos de dispersão ao quadrado. Para obter um raio preliminar de giro, encontre a janela Prompt de Comando e use a função Autorg.Depois de empurrar Autorg, clique no limite superior para cima um e, em seguida, para baixo um para forçar o programa a atualizar as medidas estatísticas. Alternativamente, insira vários arquivos ao mesmo tempo clicando no mesmo prompt aberto e selecionando vários nomes de arquivos de dados, destacando-os da mesma maneira descrita anteriormente. Para iniciar a análise de Kratky, clique para selecionar o nome do arquivo de dados.Isso irá traçar os dados na janela. E, em seguida, selecione Plot. Em seguida, abaixo do botão Plot, clique em Kratky Plot.Como resultado, as proteínas globulares exibem um pico GALC-ean enquanto proteínas desdobradas exibirão um platô em vez de um pico e se assemelham a uma trama hiperbólica como a mostrada aqui. Buffer de carga subtraído dados para cada concentração em PRIMUS/Qt mais uma vez. E sob a guia Processamento, clique em Dimensionar e inspecionar cada curva e o número de escala i, que se correlaciona com as diluições feitas a partir da amostra original.Após a inspeção, mescle os dados clicando no botão Mesclar na janela Processamento. Para gerar o gráfico de distribuição de distância, carregue as curvas de dados mescladas em PRIMUS/Qt e, em seguida, clique em Distribuição de Distância na guia Análise. Ajuste a faixa de dados dos dados mesclados para evitar qualquer ruído significativo na extremidade traseira dos dados brutos.Além disso, omitir pontos de dados próximos ao beamstop na região de baixo q, selecionando o valor de faixa mais baixa e aumentando o número. Para determinar o Dmax, comece com um intervalo de cinco vezes o raio de giro obtido a partir da análise de Guinier. Em seguida, diminua gradualmente esse valor até que o gráfico de distribuição de distância não caia abruptamente para zero no eixo y e não tenha uma cauda longa antes de se aproximar do zero.Verifique se o raio experimental de giro versus intensidade, que é derivado da aproximação de Guinier e do raio de distribuição de distância dos números de giro versus intensidade são semelhantes. Aqui, a intensidade da luz dispersa é mostrada plotada contra o ângulo de dispersão, sugerindo tanto a qualidade das biomoléculas nidogen-1, laminina gama-1 e seu complexo, bem como sua forma. A distribuição de distância do par de elétrons determinada a partir dos dados de dispersão sugere que as biomoléculas têm uma forma alongada e o enredo kratky sugere que as proteínas estão em um estado dobrado, pois os dados tendem a planar, ou mesmo aumentar na faixa q maior e não ter uma forma de curva de sino.Além disso, as parcelas de Guinier, que utilizam dados em ângulo de baixa dispersão, indicam a região linear para determinação do raio de giro, que é mostrado aqui para nidogen-1, laminin gamma-1 e seu complexo. Para estudar complexos proteicos-proteínas, o MONSA foi utilizado para obter a estrutura de baixa resolução de todo o complexo nidogen-1 laminin gamma-1, sugerindo que apenas a região terminal C de ambas as proteínas participam de interações mediadoras, enquanto o resto dos domínios estão distantes entre si. Não se esqueça que trabalhar com radiação síncrotron pode ser extremamente perigoso e as precauções e a segurança descritas por cada linha de feixe diferente devem ser sempre tomadas durante a realização da coleta inicial de dados.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

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Combinando a cristalografia de raios x com espalhamento de raios-x de pequeno ângulo para modelar regiões não-estruturadas de Nsa1 de S. Cerevisiae

Determination of the full-length structure of ribosome assembly factor Nsa1 from Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is challenging because of the ...

Bioquímica

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

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Crescimento de cristais de proteína com dimensões distintas usando automatizado cristalização juntamente com In Situ Difusão dinâmica da luz

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

Caracterização de Glicoproteínas com Dobra da Imunoglobulina por Cristalografia de Raios-X e Técnicas Biofísicas

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Contrast-Matching Detergent in Small-Angle Neutron Scattering Experiments for Membrane Protein Structural Analysis and Ab Initio Modeling

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Correspondência de contraste detergente em experimentos de espalhamento pequeno ângulo nêutrons para análise estrutural de proteínas de membrana e modelagem do Ab Initio

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Structure Solution of the Fluorescent Protein Cerulean Using MeshAndCollect

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Fully Autonomous Characterization and Data Collection from Crystals of Biological Macromolecules

Caracterização totalmente autónoma e coleta de dados de cristais de macromoléculas biológicas

High-brilliance X-ray beams coupled with automation have&#160;led to the use of synchrotron-based macromolecular X-ray crystallography (MX) beamlines for ...

Ion Exchange Chromatography (IEX) Coupled to Multi-angle Light Scattering (MALS) for Protein Separation and Characterization

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Cromatografia de troca iónica (IEX) acoplada ao multi-ângulo espalhamento de luz (MALS) para caracterização e separação de proteínas

Ion-exchange chromatography with multi-angle light scattering (IEX-MALS) is a powerful method for protein separation and characterization. The combination ...

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

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Caracterização de proteínas por cromatografia de exclusão de tamanho acoplada ao espalhamento de luz Multiangulares (SEC-MALS)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

Um suporte de amostra tudo-em-um para a cristalografia macromolecular do raio X com espalhamento mínimo do fundo

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