Name: structural studies of macromolecules in solution using small angle x-ray scattering
Uploaded: 2018-11-05T13:00:00
Duration: 7 min 19 s
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Este proyecto ha sido apoyado por NSERC RGPIN-2018-04994, programa de innovación Campus Alberta (RCP-12-002 C) e Instituto de investigación de Alberta del prión / becas de Alberta Innova Bio Solutions (201600018) concedidos a M.O. TRP es una Cátedra de investigación de Canadá en el ARN y Biofísica de proteínas (201704) y reconoce la concesión del descubrimiento de NSERC (RGPIN-2017-04003). TM está financiado por la beca NSERC descubrimiento a TRP.

1. SAXS de la muestra preparación y adquisición de datos
<ol><li>Preparación de la muestra:<ol>
<li>Experimentos SAXS requieren muestras homogéneas, estables y no agregación de la proteína; observar la estabilidad y el estado oligomérico con Cromatografía por exclusión de tamaño (S), DLS o AUC antes de la recogida de datos.</li>
		<li>Someter las muestras (nidogen-1 y laminina γ-1 en este caso) al análisis DLS y Tricina SDS-PAGE para visualizar muestra pureza10. Nota: Las muestras pueden cubrir una gama de concentraciones (1-4 mg/mL) según su tamaño, su comportamiento de solución tales como la asociación y agregación y estabilidad; aquí, cinco concentraciones de nidogen-1, (139 kDa), tres de laminina γ-1 (109 kDa) y cuatro del complejo equimolar purificado de S se prepararon como se describió anteriormente10.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Recolección de datos:<ol>
<li>Recopilar datos SAXS utilizando un sistema interno o sincrotrón, según las pautas del fabricante o centro. Nota: Los datos utilizados en este trabajo se recopilaron utilizando un sistema interno (véase Tabla de materiales) que contiene una cámara de agujero de alfiler 3 equipada con + 002 microfocus tubo sellado (radiación de Cu Kα en 1,54 Å) y la óptica Confocal máximo flujo (CMF) operando a 40 w. El sistema también está equipado con un detector 2D de varios hilos de nm 200 para recolección de datos. Sin embargo, con la disponibilidad de sincrotrones modernos en Francia, Alemania, Reino Unido, Estados Unidos y otros países, que proporciona acceso a una instalación de SAXS S que facilita la separación de una preparación de la generación de posible agregación o degradación, ahora rutinariamente recoger datos en las instalaciones de sincrotrón. Un artículo recientemente publicado en un DNA G-quadruplex11 es un ejemplo de una estrategia de recolección de datos S-SAXS. En este caso, los datos SAXS se recolectaron en el rango de 0.08 ≤ q ≤ 0.26 Å durante 3 horas para nidogen-1 (2.0, 2.5, 3.0, 3.5 y 4,0 mg/mL); el γ de la laminina-1 (1.5, 2.0 y 2.5 mg/mL) y su complejo (0.8, 1.0, 1.25 y 1.5 mg/mL).</li>
		<li>Reducir los datos de búfer y las muestras utilizando el software de procesamiento específico al sistema. Restar la contribución de búfer de datos de la proteína usando un programa como PRIMUS/qt12 (figura 2A).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Análisis de datos
Nota: Actualmente, hay algunos paquetes de software que son útiles para el análisis de los datos SAXS: ScÅtter43 (descarga disponible en www.bioisis.net), bioXtas RAW44y el ATSAS suite13. Esta sección proporciona un resumen de los pasos generales a ser tomada analizando SAXS crudos datos usando el ATSAS programa suite y pasos específicos se toman de la ATSAS 2.8.1 descargar. Otros programas se pueden utilizar y se discuten brevemente más adelante.
<ol><li>Resta de búfer Nota: Estos pasos son relevantes para sólo muestras estáticas de SAXS.<ol>
<li>Seleccione la opción de menú "Abrir" en PRIMUS/qt y seleccione los archivos de datos de interés. Tenga en cuenta que los archivos de datos deben estar en formato ASCII, en el que la primera columna es el eje vector de s y la segunda columna es la intensidad. Repita este paso para los datos recogidos para el búfer sí mismo introduciendo estos datos en el mismo menú.</li>
		<li>Seleccione "Restar" en la ventana de procesamiento de datos, lo que generará una curva de dispersión resta representación solamente dispersión de macromoléculas de interés. Repita este paso para cada concentración.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Análisis de Guinier<ol>
<li>Para realizar el análisis de Guinier, cargar una curva de dispersión del almacenador intermediario restado en PRIMUS/qt según se describió anteriormente en el paso 2.1.1.</li>
		<li>Haga clic en "Radio de giro", que se procederá a abrir el Asistente de Guinier Primus; se mostrará un diagrama del ln(I) vs q2 .</li>
		<li>Para obtener un preliminar Rg utilizar la función "AUTORG", que es un módulo externo construido en PRIMUS/QT encontrar el botón de "Autorg" y haga clic en él.</li>
		<li>Entrada de varios archivos a la vez destacando todos ellos e insertándolos en el menú de la derecha, muy similar a la 2.1.1.</li>
		<li>Utilizar la trama de Guinier creada antes para evaluar la calidad de los datos; la línea verde en la parcela de Guinier muestra la representación gráfica de residuos que representan una linealidad del ajuste. Tenga en cuenta que no linealidad en el análisis de Guinier podría ser un signo de agregación de la muestra y posterior análisis no debe realizarse en este caso. Nota: Un ajuste linear de Guinier da un Rg con un error pequeño (< 5%) y sugiere una muestra de alta calidad.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kratky análisis<ol>
<li>Cargar los datos a visualizar de una manera similar como se describió anteriormente.</li>
		<li>Haga clic en el "cuadro Seleccione" junto al nombre del archivo de datos. Esta trama de los datos en una ventana independiente.</li>
		<li>Haga clic en el botón de "Conjura" seguido por "Argumento Kartky" selección en el menú desplegable.</li>
		<li>Esto diagrama los datos como "q2 x L(q) vs q". Tenga en cuenta que las proteínas globulares muestran un pico gaussiano, mientras que las proteínas desdobladas mostrará una meseta en lugar de un pico y se asemejan a un diagrama hiperbólico17.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fusión de datos<ol>
<li>Tampón de carga resta datos para cada concentración en PRIMUS/cuarto de galón una vez más, como en el paso 2.1.1.</li>
		<li>Para combinar los datos, haga clic en el botón "Fusionar" en la ventana de procesamiento.</li>
		<li>Inspeccione cada curva y el número de la escala, que se corresponde con las diluciones de la muestra original. Nota: Las muestras de mayor concentración de mostrarán menos ruido en la región de la cola de las curvas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Distribución de reinicio<ol>
<li>Para generar la trama de reinicio, cargar las curvas de datos combinados en PRIMUS/qt como se describió anteriormente.</li>
		<li>Haga clic en el botón de "Distribución de la distancia" para abrir una nueva ventana que presenta los datos combinados de la intensidad dispersada luz vs q y distancia par distribución función parcela a la derecha. Nota: La información en el lado derecho presenta la calidad general de los cálculos de la función de distribución de par-distancia.</li>
		<li>Ajustar el rango de datos de los datos combinados para evitar cualquier ruido significativo al final de los datos en bruto.</li>
		<li>Omitir los puntos de datos cerca de la parada de la viga en la región de q bajo.</li>
		<li>Para determinar el comienzo Dmax, con un rango de aproximadamente 5 veces la Rg obtenida a partir del análisis de Guinier. Gradualmente disminuir este valor hasta que la reinicio no cae bruscamente a cero en el eje y y no tiene una larga cola antes de acercarse a cero.</li>
		<li>Compruebe que el Experimental Rg/I0 (derivado de Guinier aproximación) y P(r) Rg/I0números son similares. Nota: En algunos casos, más manipulación en el rango de datos puntos de datos y alfa (un parámetro de regularización que indica al programa la relación de cuánta atención se presta a la suavidad de la distribución en comparación con el montaje de los datos experimentales) es también requiere21 para obtener una parcela de P(r) de buena calidad.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. un granob initio modelado y con un promedio de
<ol><li>Una vez que se combinan los datos recogidos en varias concentraciones, o los datos recogidos utilizando S-SAXS se reduce al mínimo, y la trama Kratky, parcela de P(r) y análisis de Guinier han sido verificados, calcular estructuras de baja resolución de macromoléculas y sus complejos. Esta tubería se puede utilizar para el estudio de las estructuras de solución e interacciones de ácidos nucleicos, proteínas y ácidos nucleicos y proteínas o proteínas complejos10,11,21,22,23 ,24,25,26,27,28,29,30,31,32 ,33,34. Uno de los programas más populares es DAMMIN, desarrollado por Svergun35 y una parte de la ATSAS paquete13, que emplea los protocolos recocidos simulados con información preliminar de entrada de Rg y Dmax . Los principios y enfoques de modelado ab initio se describen en detalle en otra parte18,36.</li>
</ol>

Los autores no tienen ninguna revelación para declarar.

Los pasos críticos del análisis de los datos SAXS descritos en la sección de protocolo de este papel incluyen buffer de la substracción, análisis de Guinier, Kratky análisis, fusión de datos y distribución de reinicio. El modelamiento ab initio del grano es demasiado extenso para ser cubierto aquí en detalle y por lo tanto se cubre sólo brevemente.
En sincrotrones (e.g. DESY en Alemania, diamante en el Reino Unido y ESRF en Francia), es posible recoger datos SAXS para una fracción muy pequeña (~ pocos μL) de cada muestra como las fracciones son ser eluida de la columna s es conectado en línea (ver figura 1 de ). Los datos SAXS elásticamente dispersos radialmente es un promedio utilizando los paquetes proporcionados por el fabricante del instrumento o por el sincrotrón antes resta de buffer puede ocurrir. Los datos resultantes de 1D representan la cantidad de luz dispersada (en (q)) en Y-eje y ángulo de dispersión (q= 4πsinθ/λ, donde λ es la longitud de onda incidente X-rayos) y se describe en la figura 1. El programa PRIMUS/qt12 se utiliza para restar directamente cualquier fondo debido a la amortiguación y se describe en el punto 1.1. Otros programas tales como; ScÅtter43 (descarga disponible en www.bioisis.net) con un tutorial disponible en https://www.youtube.com/channel/UCvFatdC5HcZOLv6OSjblfeAy bioXtas crudo44 (disponible en https:// bioxtas-raw.readthedocs.io/en/Latest/index.html) puede ser utilizada como una alternativa al paquete ATSAS.
El análisis de Guinier proporciona información sobre la agregación de la muestra y homogeneidad así el radio de giro (Rg) para la macromolécula de interés basándose en los datos SAXS de la región de baja s 14. Una parcela se construye con PRIMUS/qt para datos SAXS obtenidos en cada concentración, seguida por la curva con el rango máximo de hasta 1.30 para q x Rg. Preparación de la muestra de una generación debería proporcionar una parcela de Guinier lineal en esta región (Figura 2D), mientras que el resultado de la agregación en un no lineal Guinier parcela15,16. Si el análisis de Guinier es lineal, puede observarse el grado de "unfoldedness" de una macromolécula de interés con la trama Kratky, que es útil al decidir si realizar modelado de cuerpo rígido o construir conjuntos de modelos de baja resolución. Una proteína globular aparecerá en un Kratky parcela tener una curva en forma de campana, mientras que amplió las moléculas o péptidos desplegadas aparecerán a la meseta o incluso aumento de la gama más grande de q y carecen de la forma de campana (figura 2).
Obtener el Rg de Guinier análisis considera solamente los puntos de datos de la región de bajo q de la parcela 1D de dispersión (Figura 2D), sin embargo, es posible utilizar casi todo conjunto de datos para realizar una transformación de Fourier indirecta para convertir la información de espacio recíproco de ln (I (q)) vs (q) en una función de distribución del distancia espacio real (P(r)) que proporciona información sobre max D y Rg (Figura 2B) La forma de la parcela P(r) representa la conformación de solución bruta de la macromolécula de interés18,19. la conversión de datos de espacio recíproco a los datos del espacio real es un paso fundamental pero no es una descripción detallada dentro del alcance de este documento. Por lo tanto, hacer referencia a un artículo Svergun20 entender cada parámetro.
Una vez que resta el búfer de datos en concentraciones individuales se procesan a través de Guinier análisis con un valor constante de Rg, seguido por investigar su patrón plegable usando análisis Kratky, pueden combinar estos datos. Los datos combinados para nidogen-1, laminin γ-1 y su complejo se procesaron como se describió anteriormente y el consiguiente reinicio parcelas se presentan en la figura 2B. Idealmente, se debe calcular también la función de distribución de par-distancia reinicio para cada concentración para determinar si datos SAXS obtenidos para cada concentración proporcionan similares Rg y valores Dmax . Si la Rg y Dmax permanecen similares en una amplia gama de concentraciones, el usuario debe proceder. Cabe señalar que dependiendo de la señal, los datos pueden truncarse antes de la fusión de datos. Esto a menudo es el caso si la concentración o peso molecular de las macromoléculas bajo investigación es baja.
Análisis de la forma de baja resolución usando DAMMIN puede realizarse de varios modos (por ejemplo, rápida, lenta, modos de expertos, etc.). El modo rápido es un primer paso ideal para evaluar si la trama de reinicio ofrece modelos de buena calidad. Por lo general, deben obtenerse al menos 10 modelos para que cada parcela de reinicio comprobar si se obtienen resultados reproducibles, en cuanto a la estructura de baja resolución, con una baja de bondad de ajuste parámetro χ (un valor de 0.5-1.0 se considera buena basado en nuestra amplia labor ), un valor que describe un acuerdo entre datos SAXS experimentalmente y datos derivados de la modelo. Para propósito de la publicación, normalmente uso modo lento o experto y calcular por lo menos 15 modelos. Además DAMMIN, una versión más rápida de él, DAMMIF37, así como GASBOR38 también son alternativas. Además, para estudiar proteínas o complejos de ácidos nucleicos proteínas, es posible utilizar la MONSA programa35, que facilita la colocación simultánea de los datos SAXS individuales para macromoléculas, así como su complejo. Para más detalles sobre los cálculos modelo de alta resolución, así como para estudios de interacciones RNA-proteína, referencia a un artículo reciente por Patel et al3.
SAXS es teóricamente simple, pero, sin duda, un método altamente complementario con otras herramientas de la biología estructural y resultados en baja resolución datos estructurales que pueden utilizarse por sí sola o en conjunción con técnicas de alta resolución para aclarar información sobre la estructura macromolecular y dinámica. Como se puede obtener una preparación de generación de macromoléculas y sus complejos, SAXS puede ser utilizada para estudiar la estructura en solución y las interacciones de cualquier tipo de macromolécula biológica. En el caso del complejo aquí, cabe destacar que menos del 10% de la superficie total accesible de nitrógeno-1 y laminina 1 γ está enterrado en este complejo, mientras que el resto de los dominios de ambas proteínas son libremente accesibles para interactuar con otros proteínas en la matriz extracelular para mantener su rigidez estructural (figura 3). Obtención de dicha información para un complejo con ~ 240kDa sería muy difícil utilizar otras técnicas de biología estructural, tales como Cristalografía de rayos x, RMN y microscopia del Cryo-EM.
Descubrir estructura de las proteínas mediante Cristalografía de rayos x o NMR es un proceso inherentemente lento. Este cuello de botella en la determinación de la estructura es un área donde SAXS muestra su fuerza como una técnica estructural; adquisición de datos para un experimento único de SAXS puede tomar menos de una hora y con la ayuda de software de Análisis aerodinámico, puede realizar un análisis rápido y eficiente. SAXS tiene el potencial para aumentar rendimiento de estudios estructurales como una técnica autónoma, porque ofrece un modelo de baja resolución de la estructura macromolecular antes de datos de alta resolución están disponibles. Una barrera a otras técnicas estructurales es el requisito para una muestra muy pura, concentrada para adquisición de datos, que exige un alto nivel de expresión de la proteína y la estabilidad durante un largo período de tiempo. Mientras SAXS muestras también deben ser puros y concentrados, los volúmenes de la muestra están aproximadamente 100 μl haciendo SAXS un método relativamente barato de análisis en comparación con otras técnicas estructurales. Por otra parte, SAXS acoplada con Cromatografía por exclusión de tamaño se está volviendo cada vez más común que proporciona un paso adicional de control de calidad. Recientemente ha habido avances fuertes en la combinación de datos NMR y SAXS utilizando el método de optimización de conjunto (MOE)45,46 aclarar sistemas flexibles. En un reciente artículo de Mertens y Svergun47, los autores describen varios ejemplos recientes de SAXS EOM en combinación con RMN, junto con muchos otros ejemplos de los datos SAXS se utiliza en conjunción con NMR. Continuamente se hacen avances en el campo de SAXS, y nuevas técnicas están siendo desarrollados por SAXS ser utilizado en conjunción con, no sólo complementario a otras técnicas estructurales. En consecuencia, creemos que la demanda de SAXS sólo aumentará con el tiempo, especialmente en conjunción con NMR para caracterizar sistemas dinámicos donde las funciones se definen por la flexibilidad.

Las células contienen intrincadas redes de proteínas que actúan como máquinas moleculares para llevar a cabo las funciones celulares tales como cascadas de señalización y mantenimiento de la integridad estructural. Las formas en que estos diferentes componentes moverán e interactuan en un espacio tridimensional da lugar a las funciones específicas de las macromoléculas. La importancia de la estructura de las proteínas, dinámica e interacciones en la determinación de la función ha proporcionado la necesidad de continuamente cambiantes, complejas técnicas medir estas propiedades. De estos, resonancia magnética Nuclear (RMN), Cristalografía de rayos x (XRC) y más recientemente, microscopia del Cryo-electrón (CEM) proporciona información estructural de alta resolución. Sin embargo, XRC CEM producen estructuras de uno de los muchos Estados biomolecular y carecen de información sobre la dinámica de la estructura de la proteína, mientras que la determinación de la estructura 3D por RMN es típicamente limitada a pequeñas proteínas globulares. Una manera de superar estas limitaciones es utilizar la dispersión de rayos-x de ángulo pequeño (SAXS) para generar sobres moleculares de sistemas grandes, multidominio o complejados y combinar las estructuras macromoleculares rígidas alta resolución para dilucidar el mundial arquitectura y características dinámicas.
SAXS produce baja resolución sobres de complejos macromoleculares con una resolución de aproximadamente 10-20 Å 1, dando la penetración no sólo en la estructura sino también las características dinámicas que muestra el complejo. Aunque SAXS utiliza rayos x para descubrir la estructura molecular, es a diferencia de XRC que la orientación isotrópica al azar de las partículas en solución no conduce a la difracción, sino a la dispersión, que no puede ceder a resolución atómica. En cambio, se genera un electrón "envolvente" de la macromolécula que representa un promedio de las conformaciones que muestra de la macromolécula. Esta información puede utilizarse en conexión directa de las estructuras previamente solucionadas resolución atómica para inferir las regiones de flexibilidad en una sola proteína o subunidad organización y dinámica en un complejo más grande, Multi-proteína. Se recogen datos SAXS en sincrotrones con alta energía rayos x monocromáticos o de fuentes internas, que ofrecen una fuente de rayos x más débil que requieren horas en lugar de segundos de tiempo de exposición de la muestra (figura 1). Datos SAXS se recogen a menudo de varias muestras con una sola instalación experimental y buffer, que requieren un período de tiempo para recopilar una serie de datos útiles en un sistema. Las muestras deben, por lo tanto, ser estable y no agregando durante al menos unas horas basadas en métodos de control de calidad verificables tales como dispersión ligera dinámica (DLS) o análisis de la ultracentrífuga analítica (AUC) para obtener datos de saxos de alta calidad2 , 3. aquí proporcionamos una descripción práctica de SAXS, los principios detrás de su uso, beneficios, limitaciones y preparación de la muestra y recolección de datos fuertemente en objetivo y análisis, junto con tocar brevemente en ab initio modelando con la matriz extracelular proteínas nidogen-1 y laminina γ-1 como ejemplo experimental.
Principios, ventajas y limitaciones de saxos:
La guía principle(s) detrás de SAXS es relativamente simple: una solución de la preparación de la generación de macromolecule(s) de interés se coloca dentro de un tubo capilar y se expone a un haz de rayos x monocromático de alta energía. Los fotones provocan electrones de la cáscara atómica para comenzar oscilante, dando por resultado una onda esférica se emite la misma energía y longitud de onda. Puesto que cada electrón oscilará, se logrará un fondo constante y la densidad del electrón que resulta de la macromolécula se contrapone a un segundo plano. La intensidad de dispersión resultante se recoge en función de la dispersión de ángulo, 2Θ (figura 1).
Mientras que otras técnicas como XRC, RMN y CEM proporcionan información estructural a nivel atómico, hay múltiples beneficios a saxos que otras técnicas no pueden ofrecer. SAXS puede realizarse en casi cualquier tampón y no requiere ninguna preparación especial. Esto es particularmente importante en el estudio de la conducta y la estructura de macromoléculas bajo condiciones variables, como la presencia o ausencia de mono - o cationes divalentes o cambios en el pH4,5. SAXS tiene la capacidad para proporcionar información sobre las regiones flexibles de una macromolécula6, algo las otras técnicas mencionadas pueden luchar con. Por lo tanto, SAXS puede ser utilizado como una técnica conexión fuerte con la parte estable de una macromolécula que estudió con XRC, MRN o CEM y la macromolécula entera o complejo analizado en baja resolución con saxos y combinado utilizando diversas herramientas de análisis tales FoXSDock7 o8de CRYSOL. Como SAXS es una técnica de solución, a menudo se utiliza para confirmar si estructuras estáticas como los obtenidos de XRC son constantes en la solución6. SAXS también tiene la ventaja de ser una técnica que requiere una cantidad relativamente pequeña de la inversión (típicamente 50-100 μL) de muestra y una cantidad relativamente pequeña de tiempo del experimento (30 min - 1 h).
La limitación más grande de SAXS es la vulnerabilidad a la agregación de muestra o degradación, que puede conducir a predicciones estructurales incorrectas. Una agregación, incluso tan baja como 5%, puede dispersar la luz en cantidades muy altas, conduce a una sobreestimación de la dimensión de partícula máxima (Dmax) y el radio de giro (Rg). Por otro lado, la degradación de la muestra puede conducir a una subestimación de propiedades moleculares. Esta vulnerabilidad surge de SAXS siendo una técnica promedio, lo que significa que la homogeneidad de la muestra es fundamental para lograr resultados confiables y reproducibles. Cualquier muestra que debe ser analizado por SAXS debe, por lo tanto, experimentar varios métodos de purificación y control de homogeneidad, como nativa y desnaturalización electroforesis en gel, cromatografía por exclusión de tamaño, luz dinámica, dispersión, análisis ultracentrifugación. A menudo, líneas de SAXS se ejecutarán paso a través de cromatografía líquida de alto rendimiento como un control de calidad final antes de SAXS (S-SAXS)3,9. Deben recogerse datos SAXS en múltiples concentraciones y deben compararse los Rg de cada conjunto de datos, asegurando una semejanza cercana para evitar interacciones entre partículas y agregación, que resulta en una sobreestimación de la partícula dimensiones, lleva al análisis de los datos inexactos y modelado. Puesto que la dispersión depende de la concentración y tamaño, macromoléculas más pequeñas pueden requerir una optimización más específica de la gama de concentración. Esto es debido a Teorema de la reciprocidad, donde grandes tamaños dispersión hacia ángulos pequeños y tamaños pequeños a grandes ángulos. Esto se manifiesta en la recogida de datos, dondeO es proporcional a R6, donde R es el radio de la partícula. Una limitación final de SAXS es el potencial de daño por radiación a la muestra durante la exposición, que puede conducir a la distorsión de los datos. Es una buena práctica para comparar la calidad de la muestra antes y después de la exposición de muestra SAXS para que esto no está ocurriendo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>HEK 293 EBNA Cell Line</td>
			<td>In-Lab availability</td>
			<td>-</td>
			<td>Cell line used to overexpress protein(s)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni Sepharose High Performance histidine-tagged protein purification resin</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17524801</td>
			<td>Affinity protein purification resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 Increase 10/300</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28990944</td>
			<td>SEC Column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;KTA Pure FPLC</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>-</td>
			<td>FPLC System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>-</td>
			<td>Spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic Reagents (NaCl, Tris-HCl etc.)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S-MAX3000</td>
			<td>Rigaku</td>
			<td>-</td>
			<td>SAXS Pinhole Camera System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer Nano-S</td>
			<td>Malvern Instruments Ltd</td>
			<td>-</td>
			<td>Dynamic Light Scattering instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1&#181;m Filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>JVWP04700</td>
			<td>Used to Concentrate Sample Prior to DLS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin cleavage kit</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab207000</td>
			<td>Thrombin cleavage to remove His tag</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strep-Tactin Sepharose Column</td>
			<td>IBA</td>
			<td>2-1201-010</td>
			<td>Strep-Tag Affinity Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-desthiobiotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>533-48-2</td>
			<td>Elution of Strep Tag Protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAXGUI</td>
			<td>Rigaku</td>
			<td>-</td>
			<td>Data Collection for SAXS and data reduction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATSAS Suit</td>
			<td>Franke et al., 2017</td>
			<td>-</td>
			<td>SAXS Data Analysis Software program suite</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRIMUS</td>
			<td>Konarev et al., 2003</td>
			<td>-</td>
			<td>Buffer Subtraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GNOM</td>
			<td>Svergun, 1992</td>
			<td>-</td>
			<td>Rg, Dmax and p(r) Calculation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAMMIF</td>
			<td>Franke and Svergun, 2009</td>
			<td>-</td>
			<td>Ab initio model calculation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAMAVER</td>
			<td>Volkov and Svergun, 2003</td>
			<td>-</td>
			<td>Averaged Solution Conformation calculations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MONSA</td>
			<td>Svergun, 1999</td>
			<td>-</td>
			<td>Simultaneous model fitting for the complex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GASBOR</td>
			<td>Svergun et al., 2001</td>
			<td>-</td>
			<td>Alternative Ab initio model calculations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTS Software V6.20</td>
			<td>Malvern Instruments Ltd</td>
			<td>-</td>
			<td>DLS supplied instrument software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyMOL</td>
			<td>Schrodinger, LLC.</td>
			<td>-</td>
			<td>The PyMOL Molecular Graphics System V2.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Protein Data Bank</td>
			<td>Berman et al., 2000</td>
			<td>-</td>
			<td>PDB ID: 1NPE</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

structural studies of macromolecules in solution using small angle x-ray scattering

Interacciones de proteínas con proteínas con dominios globulares múltiples presentan desafíos técnicos para determinar cómo forman complejos y cómo los dominios posicionado/orientado. Aquí, se describe un protocolo con el potencial para la aclaración de que dominios específicos median interacciones sistema multicomponente mediante modelado ab initio . Un método para el cálculo de las estructuras de solución de macromoléculas y sus asambleas es condición implica la integración de datos de dispersión de rayos-x de pequeño ángulo (SAXS), cromatografía y estructuras de resolución atómica en un enfoque híbrido. Un ejemplo concreto es el del complejo de larga duración nidogen-1, que reúne a las proteínas de matriz extracelular y forma una nanoestructura extendido, curvado. Uno de sus dominios globulares une a laminina γ-1, que las estructuras de la membrana basal. Esto proporciona una base para la determinación de estructuras precisas de complejos de proteína del multidomain flexible y está habilitado por sincrotrón fuentes juntadas con sistemas de cromatografía de automatización robótica y tamaño de exclusión. Esta combinación permite un análisis rápido en el que varios Estados oligoméricos se separan justo antes de la recolección de datos SAXS. El análisis obtiene información sobre el radio de giro, dimensión de partícula, forma molecular y del maridaje entre dominios. También se da el protocolo para la generación de modelos 3D de complejos por montaje de estructuras de alta resolución de las proteínas del componente.

El enfoque de análisis de datos descrito anteriormente fue utilizado para calcular la Rg y Dmax de nidogen-1, laminin γ-1 y su complejo uso de la función P(r). Se obtuvieron valores de Rg de 7.20 (±0. 10) nm y nm (±0.20) 8.10 10.9 nm (±0, 4) para nidogen-1, laminin γ-1 y su complejo respectivamente (figura 2A-B). Además, los valores Dmáximo de 24 nm, 26 nm y 35 nm para nidogen-1, laminin γ-1 y su complejo respectivamente (figura 2)10 se obtuvieron. Se utilizó el programa DAMMIF para obtener estructuras de baja resolución de nidogen-1 y laminina γ-1, lo que sugiere que ambas proteínas adoptan una forma extendida en solución. Los valores de X y NSD nidogen-1 (~ 1 y 0,8) y γ de la laminina-1 (~0.9 y 0,8 respectivamente) estaban también en la gama aceptable. La alineación de estructuras de alta resolución, dos dominios de nidogen-1 y dos de laminina γ-1, en sus estructuras de baja resolución obtenidas usando SAXS permitieron la identificación de sus regiones N y C terminal del10.
Nidogen-1 fue identificado como un interacción socio de laminina γ 139,40 y el sitio de interacción fue trazado mediante Cristalografía de rayos x a los dominios c-terminal del41. Sin embargo, estructuras de alta resolución solo involucra dominios interactuantes y no el cuerpo entero nidogen-1 o el brazo de γ-1 todo laminina. Por lo tanto, nos purifica un complejo que contiene nidogen-1 (largo completo) y el laminina γ-1 brazo para identificar las regiones de interacción, así como para estudiar la orientación relativa de los dominios N-terminal de ambas proteínas. Los datos SAXS para el complejo rindieron un Rg 10.9 nm (±0, 4) y un máximo de D de 35 nm. Utilizamos MONSA para obtener la estructura baja de todo el complejo, lo que sugiere que de hecho, sólo la región c-terminal de ambas proteínas participan en la mediación de las interacciones, mientras que el resto de los dominios están lejos uno del otro ( Figura 3, Video 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58538/58538fig1.jpg"> Figura 1. Esquemas de instalación SAXS. Se prepara una preparación de la generación de biomoléculas o sus complejos, seguido por la exposición con rayos x de alta energía. Dependiendo de la fuente (p. ej., interno vs Sincrotrón), puede variar la energía de rayos x y la muestra a distancia de la fuente. Patrón de dispersión de los rayos x (que depende del tamaño y forma de biomoléculas) se graba y radialmente un promedio para obtener una parcela de 1 dimensión (1D) que contiene información sobre la intensidad de luz dispersada en relación con el ángulo de dispersión. Como moléculas de búfer también dispersión de luz, las contribuciones de estas moléculas se deducen para obtener un patrón de dispersión de las biomoléculas de interés. En el sincrotrón, antes de la recolección de datos SAXS, típicamente se realiza un paso adicional de purificación mediante cromatografía de exclusión/alto rendimiento de tamaño en línea (vista superior). Este paso es vital para eliminar cualquier producto agregado o degradado, así como a remover cualquier biomoléculas independiente del complejo. El diagrama de dispersión D 1 se convierte en la trama de distribución de par de electrones-distancia (parcelaP(r)), que proporciona el radio de giro y la dimensión máxima de la partícula de biomoléculas. Este terreno se utiliza como el archivo de entrada para el ab initio (es decir, DAMMIN/DAMMIF) los paquetes de modelado para obtener estructuras de baja resolución de biomoléculas u otros paquetes (es decir, la SASREF/CORAL) si la estructura de alta resolución de partes de las biomoléculas o biomoléculas individuales del complejo se conocen.  <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58538/58538fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58538/58538fig2.jpg"> Figura 2. (A) una parcela de una intensidad de dispersa luz vs ángulo de dispersión (q = 4πsinθ/λ, nm-1) lo que sugiere la calidad de las biomoléculas (región baja) y forma (región alta) de biomoléculas. (B) la distribución de la distancia del par de electrones P(r) determinado a partir de los datos de dispersión sugieren una forma alargada de biomoléculas bajo investigación (γ-1 de laminina, nidogen-1 y su complejo). (C) Kratky parcela sugiriendo que nidogen-1 y laminina γ-1 proteínas no son desplegadas. (D) Guinier parcela nidogen-1, laminin γ-1 y su complejo, indicando la región lineal para la determinación del radio de giro usando datos en dispersión de bajo ángulo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58538/58538fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58538/58538fig3.jpg"> Figura 3. Estructura de baja resolución del complejo de nidogen-1 y laminina γ-1 obtenida por el análisis combinados de conjuntos de datos usando el programa MONSA. El esquema de color es el mismo que figura 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58538/58538fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Movie 1" src="/files/ftp_upload/58538/58538movie1.jpg"> Video 1. La estructura baja del nidogen-1 y laminina complejo γ-1. Esta película se preparó con PYMOL visualizar varias características estructurales del complejo. La estructura cristalina del complejo laminin-nidogen (PDB ID: 1NPE) se muestra como dibujos animados de la cinta, destacando la interacción sitios para este complejo. El esquema de color es el mismo que figura 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58538/complex_movie.mpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver este video. (Clic derecho para descargar)</a>

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Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering

Aquí, presentamos cómo la dispersión de rayos-x en ángulo pequeño (SAXS) pueden ser utilizados para obtener información en sobres baja representación de las estructuras macromoleculares. Cuando se utiliza en conjunción con alta resolución estructurales técnicas como la cristalografía de rayos x y resonancia magnética Nuclear, SAXS puede proporcionar penetraciones detalladas en dominios múltiples proteínas y complejos macromoleculares en solución.

Estudios estructurales de las macromoléculas en solución mediante dispersión de rayos-x de ángulo pequeño

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la bioquímica como el tamaño, la forma y los cambios conformacionales de las biomoléculas y sus complejos. La principal ventaja de esta técnica es que los experimentos se pueden realizar en condiciones de amortiguación fisiológicamente relevantes en un entorno donde las biomoléculas son estables. SAXS es una técnica complimentary para muchos otros métodos de biología biofísica y estructural.La combinación de SAXS con estos métodos puede ayudarnos a desarrollar terapias basadas en la estructura. Aunque este método puede proporcionar información sobre los complejos biomoleculares, también se puede aplicar a otros sistemas como el estudio de nanopartidistas y versículas de administración de fármacos. Generalmente, los individuos nuevos en este método tendrán problemas porque aparece como un proceso abrumador y complicado, para pasar de datos de dispersión sin procesar a estructuras de baja resolución.La demostración visual de este método es crítica ya que la canalización del análisis de datos para obtener modelos estructurales a partir de datos sin procesar es difícil de aprender porque implica el uso de muchos paquetes diferentes de software. Hay algunos paquetes de software que son útiles para el análisis de datos SAXS. Estos incluyen SCATTER, BioXTAS RAW y la suite ATSAS.En este vídeo, proporcionaremos una visión general de los pasos generales a seguir al analizar datos SAXS sin procesar, utilizando el conjunto de programas ATSAS. Para comenzar, instale y cargue el conjunto de programas ATSAS. Abra el programa PRIMUS/Qt y vaya a la opción Abrir menú.Aquí, seleccione hasta 13 archivos de datos de interés. Los archivos de datos deben estar en el formato ASCII, en el que la primera columna es el eje s-vector y la segunda columna es la intensidad. Repita este paso para los datos de solo búfer, insertando estos datos en un segundo menú Herramientas.A continuación, vaya a la ventana Procesamiento de datos y seleccione Restar. Esto generará una curva de dispersión restada, que representa sólo la dispersión de la macromolécula de interés. Para realizar el análisis de Guinier, comience con una curva de dispersión restada de búfer cargada en PRIMUS/Qt.A continuación, haga clic en Radio de giro, que abrirá el Mago Primus Guinier. En este punto, se mostrará un gráfico que muestra el registro natural de los ángulos de intensidad frente a los ángulos de dispersión al cuadrado. Para obtener un radio preliminar de giro, busque la ventana Símbolo del sistema y utilice la función Autorg.Después de presionar Autorg, haga clic en el límite superior hacia arriba uno, luego hacia abajo uno para forzar el programa a actualizar las mediciones estadísticas. Como alternativa, introduzca varios archivos a la vez haciendo clic en el mismo símbolo del sistema abierto y seleccionando varios nombres de archivos de datos resaltándolos de la misma manera que se describió anteriormente. Para comenzar el análisis Kratky, haga clic para seleccionar el nombre del archivo de datos.Esto trazará los datos en la ventana. Y luego, seleccione Trazar. A continuación, debajo del botón Trazar, haga clic en Gráfica Kratky.Como resultado, las proteínas globulares muestran un pico GALC-ean, mientras que las proteínas desplegadas mostrarán una meseta en lugar de un pico y se asemejarán a una gráfica hiperbólica como la que se muestra aquí. Cargar datos restados de búfer para cada concentración en PRIMUS/Qt una vez más. Y en la pestaña Procesamiento, haga clic en Escalar e inspeccionar cada curva y el número de escala i, que se correlaciona con las diluciones realizadas a partir de la muestra original.Después de la inspección, combine los datos haciendo clic en el botón Combinar de la ventana Procesamiento. Para generar el trazado de distribución de distancia, cargue las curvas de datos combinadas en PRIMUS/Qt y, a continuación, haga clic en Distribución de distancia en la ficha Análisis. Ajuste el rango de datos de los datos combinados para evitar cualquier ruido significativo en el extremo final de los datos sin procesar.Además, omita los puntos de datos cerca de la parada de haz en la región de baja q seleccionando el valor de rango inferior y aumentando el número. Para determinar el Dmax, comience con un rango de cinco veces el radio de giro obtenido del análisis guinier. A continuación, disminuya gradualmente este valor hasta que la gráfica de distribución de distancia no caiga abruptamente a cero en el eje Y y no tenga una cola larga antes de acercarse a cero.Compruebe que el radio experimental de giro frente a la gráfica de intensidad, que se deriva de la aproximación guinier y el radio de distribución de distancia de giro frente a números de intensidad son similares. Aquí, la intensidad de la luz dispersa se muestra trazada contra el ángulo de dispersión, sugiriendo tanto la calidad de las biomoléculas nidogen-1, laminin gamma-1 y su complejo, así como su forma. La distribución de la distancia del par de electrones determinada a partir de los datos de dispersión sugiere que las biomoléculas tienen una forma alargada y la gráfica Kratky sugiere que las proteínas están en un estado plegado, ya que los datos tienden a meseta, o incluso aumentan en el rango q más grande y carecen de una forma de curva de campana.Además, las gráficas guinier, que utilizan datos en ángulo de dispersión bajo, indican la región lineal para la determinación del radio de giro, que se muestra aquí para nidogen-1, laminin gamma-1 y su complejo. Para estudiar los complejos proteína-proteína, MONSA se utilizó para obtener la estructura de baja resolución de todo el complejo gamma-1 de lainina nidogen-1, lo que sugiere que sólo la región C-terminal de ambas proteínas participa en interacciones mediadoras, mientras que el resto de los dominios están muy separados entre sí. No olvide que trabajar con radiación sincrotrón puede ser extremadamente peligroso y las precauciones y la seguridad descritas por cada línea de haz diferente siempre deben tomarse mientras se realiza la recopilación de datos inicial.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

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La combinación de Cristalografía de rayos x con dispersión de rayos-x de ángulo pequeño para modelar regiones no estructuradas de Nsa1 de S. Cerevisiae

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Investigación

Bioquímica

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