Name: morphology-based distinction between healthy and pathological cells utilizing fourier transforms and self-organizing maps
Uploaded: 2018-10-28T14:00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Morphology-Based Distinction Between Healthy and Pathological Cells Utilizing Fourier Transforms and Self-Organizing Maps at JoVE.com

作者感谢本杰明. 克劳斯的卓有成效的讨论和他的支持。作者还感谢罗伯特 Günther 对活体细胞显微术的帮助。
这项工作得到了注册护士和陈竺的金融支持 NI1167/3-1 (吉米) 的支持, 金融支持 CRC 1278 PolyTarget 项目 Z01 陈竺, C01 在 TRR130 注册护士和 SFB633, TRR130, Exc257 A.E.H. 和 J.B.S。BfR 为卡斯特乔治四叶查尔斯 K 和 A.L. 提供了校内支持 SFP1322-642

1. 协议要求
<ol><li>获得高分辨率 deconvolved 三维 (3D) 显微镜数据 deconvolved 符合奈奎斯特标准, 采样间隔至少两次, 标本的最高空间频率, 以获得高分辨率图像。</li>
	<li>使用3D 渲染软件进行表面重建和导出。</li>
	<li>使用能够运行 python 脚本的3D 动画软件 (python 脚本可以从 github 存储库下载: https://github.com/zcseresn/ShapeAnalysis) 以创建2D 投影。</li>
	<li>使用斐济13分析2D 投影并提取 DFT 元件。<ol>
<li>使用当前斐济分销。如果已经存在已安装的斐济版本, 请确保已安装的版本是最新的。这可以通过运行帮助轻松实现 |更新选项。</li>
		<li>使用活动轮廓插件15, 可以从 http://imagejdocu.tudor.lu/doku.php？id=plugin:segmentation:active_contour:start 下载, 并应复制到插件文件夹。</li>
		<li>从 github 存储库下载 "斐济树荫" 插件并复制到插件文件夹中。</li>
	</ol>
</li>
	<li>使用计算数学软件能够计算自组织映射。</li>
</ol>2. 重建3D 图像。
注意: 出于测试目的, github 存储库中提供了一个示例数据集 (参见上文)。
<ol><li>启动3D 重建软件并打开3D 图像数据。</li>
	<li>创建 (all) 对象的3D 表面。<ol>
<li>选择3D 视图选项, 然后单击曲面。单击 "下一步" 按钮 (带有白色三角形的蓝色圆圈) 以继续执行曲面创建向导。</li>
		<li>选择用于曲面重建的图像通道。</li>
		<li>应用平滑功能以避免多孔曲面。<ol>
<li>选择不隐藏曲面细节但避免多孔曲面的平滑值。</li>
		</ol>
</li>
		<li>选择阈值方法以查找曲面。<ol>
<li>当对象与背景良好分离并具有近似均匀的亮度级别时, 请使用绝对强度阈值。</li>
			<li>当对象的强度变化时应用局部对比度阈值, 但仍可与本地背景和周围的其他对象分离。根据重建对象的预期直径值设置局部阈值搜索区域。</li>
		</ol>
</li>
		<li>根据感兴趣的形态参数 (如体积、球形度、体积比等) 对重建后的表面进行过滤, 完成表面重建。</li>
	</ol>
</li>
	<li>以与将在下一步骤中使用的3D 动画软件兼容的格式保存和导出生成的曲面。</li>
</ol>3. 将3D 重建曲面转换为2D 投影
<ol><li>启动搅拌器并转到右侧窗口中的输出选项卡。从下拉菜单中选择 TIFF 格式, 并将颜色深度设置为8位 RGBA。</li>
	<li>切换到脚本模式, 并从提供此工作的存储库中打开提供的脚本文件 "GUI_AutoRotate" (https://github.com/zcseresn/ShapeAnalysis)。</li>
	<li>单击运行脚本。当提示输入时, 请选择 wrl 文件的文件夹。</li>
	<li>如果需要, 在处理更复杂的曲面时创建更多旋转: 转到GUI并将框旋转设置为大于6的值。 注: 6 个不同角度的旋转可以充分区分不同的细胞种群。由于潜在的信息丢失, 建议不要在每个曲面上创建小于六的旋转。</li>
	<li>通过单击 GUI 中的 "旋转" 按钮来运行脚本。将单个曲面的投影保存在用作输入文件夹的同一文件夹中 (步骤 2.3)。默认情况下, 图像以8位 Tiff 格式保存 (请参阅步骤 2.1), 这是斐济插件阴影所需的格式。</li>
</ol>4. 查找周边并使用斐济计算傅里叶分量。
<ol><li>打开斐济并在插件菜单中选择阴影。从默认值开始, 稍后微调参数。准备好运行程序时, 请单击"确定" 。<ol>
<li>为输入图像的阈值选择一个渐变色值。</li>
		<li>选择迭代次数。迭代值越大, 外围的重建越精确。对于更简单的形状, 较低的数字通常是足够的。</li>
		<li>使用扩张参数的数量来确定起始掩码与实际单元格相比要大多少。通常更复杂的形状需要更多的扩张步骤才能找到合适的外围。</li>
		<li>如果投影的形状比背景亮, 请选中 "深色背景" 复选框。</li>
		<li>仅当使用小型测试数据集确定阴影性能时, 才激活 "显示中间结果" 复选框。对于较大的数据集启用此选项可降低计算效率, 并可能会停止具有低视频内存的系统。</li>
		<li>选中 "保存结果表" 复选框以将阴影结果用作步骤5的输入。如果选中该复选框, 则所有结果都将保存在单个 csv 文件中。输出数据的摘要始终在名为 "Result_collection_of_all_DFT_calculations" 的文件中生成。</li>
	</ol>
</li>
	<li>选择包含在步骤3中创建的 TIFF 文件的输入数据文件夹。</li>
	<li>提供输出数据文件夹。</li>
	<li>单击"确定" 启动插件。</li>
</ol>5. 自组织地图
注: SOM 网络仅在对包含所有预期单元类型和条件的输入的大型数据集进行培训时才能够对数据进行分类。出于演示目的, 提供了此类数据集, 并可在我们的存储库 ("AllCells_summary_normalised" 从 https://github.com/zcseresn/ShapeAnalysis 中找到)
<ol><li>如果尚未为输入数据提供经过培训的 SOM, 请遵循以下准则:否则继续执行步骤5.2。<ol>
<li>启动一个能够执行神经网络分类的计算数学软件。</li>
		<li>选择用于培训 SOM 网络的数据文件。该数据集应包含所有实验条件, 以训练 SOM 对特定的细胞类型和实验条件。 注意: 也可以使用提供的 AllCells_summary_normalised 来测试系统。</li>
		<li>开始培训, 等待培训完成, 然后再继续。默认情况下, 脚本设置为运行2000次迭代 ("纪元")。 注意: 迭代次数取决于 SOM 的学习速率。根据输入数据, 最好同时测试更高和更低的纪元数, 并观察 SOM 模式的稳定性。使用提供的脚本时, 可以在32行下更改迭代次数。网络大小可以在34行更改 (默认情况下, 它设置为12到 12)。</li>
		<li>训练完成后, 检查网络的拓扑 (相邻距离、输入平面、采样命中等)。网络现在已经过培训, 可以保存以供将来使用。</li>
	</ol>
</li>
	<li>在 SOM 中, 在使用已训练的地图时加载 (这可以来自步骤5.1 或来自其他来源), 以便对数据集进行群集。<ol>
<li>导入要使用预装训练的 SOM 测试的 csv 文件。使用由阴影插件准备的数据时, 从步骤4中选择阴影插件的 csv 输出。 注意: 也可以使用通过github 提供的示例数据文件 "InteractingCells_summary_normalised"、"MobileCells_summary_normalised" 或 "PhagocytosingCells_summary_normalised. csv"。</li>
		<li>分类完成后, 将 SOM 的结果评估为步骤5.1.5。<ol>
<li>检查从 csv 文件生成的 hitmap。地图的每个单元格显示数据集 "命中" 经过训练的 SOM 的特定单元格的次数。当一组单元格聚集在此地图的一个小区域中时, 这表明数据集是相当均匀的。多个群集将指示子组可能存在于数据集中。</li>
			<li>检查邻域重量距离。与 SOM 的观点不同的是, 这张地图的区域与对象组的区别很大。使用 DFT 组件作为输入数据, 这意味着这些单元格组的相应3D 曲面具有非常不同的形状。</li>
			<li>检查权重平面以了解要素向量中每个元素的贡献信息。如前所述, 如果使用 20 DFT 组件, 将在此处显示19个地图。当使用提供的示例数据集时, 前5或6个权重平面将不同, 但它们的其余部分将显示相当相似。在这种情况下, 可以得出结论, 这将是足够使用大约 7 DFT 组件。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Masedunskas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy:+a+practical+guide+on+imaging+intracellular+structures+in+live+animals.">Intravital microscopy: a practical guide on imaging intracellular structures in live animals.</a> Bioarchitecture. 2 (5), 143-157 (2012).</li><li>Niesner, R. A., Hauser, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+dynamic+intravital+multi-photon+microscopy.">Recent advances in dynamic intravital multi-photon microscopy.</a> Cytometry A. 79 (10), 789-798 (2011).</li><li>Ho, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NeurphologyJ:+an+automatic+neuronal+morphology+quantification+method+and+its+application+in+pharmacological+discovery.">NeurphologyJ: an automatic neuronal morphology quantification method and its application in pharmacological discovery.</a> BMC Bioinformatics. 12, 230 (2011).</li><li>Yin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+screen+for+morphological+complexity+identifies+regulators+of+switch-like+transitions+between+discrete+cell+shapes.">A screen for morphological complexity identifies regulators of switch-like transitions between discrete cell shapes.</a> Nature Cell Biology. 15 (7), 860 (2013).</li><li>Yu, H. Y., Lim, K. P., Xiong, S. J., Tan, L. 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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+lapse+in+vivo+microscopy+reveals+distinct+dynamics+of+microglia-tumor+environment+interactions-a+new+role+for+the+tumor+perivascular+space+as+highway+for+trafficking+microglia.">Time lapse in vivo microscopy reveals distinct dynamics of microglia-tumor environment interactions-a new role for the tumor perivascular space as highway for trafficking microglia.</a> Glia. 64 (7), 1210-1226 (2016).</li></ol>

作者声明他们没有竞争的经济利益。

使用小而完整的组织样本鉴定潜在的病理条件是非常重要的。这种技术将确保及时应对传染性疾病和积极类型的癌症。各种免疫细胞的动力学和形态学反应,如小胶质和巨噬细胞, 是机体免疫反应的特征。虽然在大多数情况下, 它是不实际的或甚至可能监测这些细胞的动力学行为, 它是相当简单的获取3维图像来检索它们的形状。通常, 免疫细胞在健康组织中具有复杂的形状, 并且在发炎或癌变条件下更简单的形式18。虽然这种形状变化的时间依赖性特征会增加我们对免疫反应发展的理解, 但仅使用具有代表性的细胞组的3D 形状也足以确定健康或病理性质的组织。
表征单元格的3维表面不是一个简单的任务。球面谐波的应用是一种表示3D 表面的方法, 其元件数量 (50-70) 相对较大 (11、12)。此外, 确定球面谐波是计算昂贵的;将非常复杂的形状投射到单位球体上是不可能或非常困难的, 因为需要在单位球体上应用各种细度的多个网格;最后, 对球面谐波分量的谱进行有意义的解释远非微不足道。
在我们这里介绍的工作中, 我们用更简单的方法来替代直接3D 表面分析的困难任务, 使用原始表面的2D 投影来获得足够的形态学信息来识别病理条件。我们通过使用髓细胞的3D 显微数据来演示这个工作流程的每一步, 同时清楚地指出所有步骤都是简单完成的, 而生成的2维地图很容易解释。
自然地, 3 d 至 2 d 投影将导致表面结构的信息丢失。在我们的示例小胶质细胞的数据集在鼠标皮质肿瘤模型, 这是足够使用六角度, 当创建2D 投影。但是, 更复杂的形状或不太明显的形态学变化可能要求创建更多的投影, 以便能够可靠地识别与 SOM 的单元子组。因此, 我们的方法旨在能够生成和分析任意数量的预测。只需为更复杂的形状选择更高的投影数, 就可以将信息损失扩展到可容忍的最小值。例如,图 4a和4b中的交互单元格类型需要较大数量的投影才能正确表示复杂曲面。
作为任何近似方法, 特此建议的工作流程必须对照小胶质细胞18手动分类过程的结果进行测试。前面的结果证实了自动化工作流程的可靠性。此外, 与常规分析相比, 工作流更有时间效率。对小胶质细胞进行手动分类的医学专家需要大约4周的时间来分析数据集, 而我们的工作流程只需要大约1天。我们的方法的稳健性也清楚地证明了经过训练的 SOM 对属于同一单元类型但不用于训练 som 的数据子集的重现性, 如图 3c所示。
尽管我们的方法没有考虑动力学信息, 但我们研究了时序对基于 DFT 的形状分析的影响。在移动细胞种群中发现了与时间相关的行为的最典型的例子, 在这种情况下, 更高索引的 DFT 组件的贡献明显可见, 如图 4a所示。这就需要注意在处理可能以非常耗时的方式行为的像元类型时使用足够多的 DFT 分量的重要性。由于我们的软件工具具有自动化的特性和高的执行速度, 因此 DFT 组件和投影的数量增加将提高结果的精确度和可靠性, 同时它们不会显著地阻碍计算性能。

及时、简单、准确地测定生物组织的病理状态是生物医学研究的最高兴趣。鼠标模型提供了一种方法来研究一系列的病理条件, 如免疫反应或癌症发展, 结合复杂的3D 和 4D (3 空间维度和时间) 显微技术。显微学研究可以通过活体或切除组织2光子显微术, 光片显微镜, 并-到有限的组织深度约100µm-通过共聚焦显微镜。为了在生理或病理条件下对细胞的行为有时间相关的信息, 有必要在长时间内监测组织, 这通常需要活体成像1,2.自然, 这种技术的适用性仅限于动物模型, 因为它的侵袭性。非侵入性技术也可用于人类应用, 包括各种层析成像方法 (冷漠, CT等), 但这些方法都缺乏必要的空间, 通常是时间分辨率来研究细胞水平的行为。
通过在切除的组织样本上执行的各种3D 成像技术, 可以更轻松地获取有关细胞外观的静态信息。在这里, 细胞的动力学行为没有被测量, 因此有必要采用新的分析技术, 能够确定检测细胞的致病状态仅基于其形态学3。这种方法被用来连接细胞形状和组织纹理与病理行为4,5,6。
在这里描述的新技术中, 细胞被重建为3D 表面, 它们的形状通过3 维-2 维投影和连续傅里叶基外围形状分析7,8。通过将尺寸从3降低到 2, 简化了问题。也可以通过应用球面谐波分析来表征3D 的细胞表面, 因为它已经在医学图像9中完成了。然而, 球面谐波不能很好地处理锋利和崎岖的形状, 需要在单位球体上建立多尺度网格。此外, 必要的球面谐波分量的数量可以是大 (50-70), 与基础计算非常苛刻和结果难以解释10,11,12。
通过我们新提出的方法, 将任务简化为一系列2D 形状描述, 其中2D 投影的数量由分析人员决定, 可根据3D 形状的复杂性进行调整。投影是通过在3D 动画工具内运行的 Python 脚本自动生成的。2D 投影由其周边的离散傅里叶变换 (DFT) 分量描述, 由斐济13插件计算, 该组件作为我们软件包的一部分提供。在这里应用 DFT, 以便将细胞的复杂轮廓分解成一系列的罪和 cos 函数。通过这种方式, 我们可以用相对较少的 DFT 分量来描述轮廓, 从而减少问题的复杂性 (有关详细信息, 请参阅方程式部分)。DFT 组件被放入经过训练的自组织映射 (SOM14) 中, 其中形状簇的存在可以客观地测试8。SOMs 提供来自人工智能领域的竞争性和无监督学习工具。它们由一组相互连接的人工神经元组成,通过加权邻域距离函数相互通信。神经元系统响应输入数据集的第一个元素, 其响应最强的神经元 "分组" 接近彼此。随着神经系统接收到越来越多的输入, 重复响应的数据神经元在系统中形成了良好定义的集群。在以一组 DFT 组件形式包含2D 形状信息的大型数据集进行适当培训之后, 任何单个单元格的 dft 组件都可以放入经过训练的 SOM 中, 并显示该单元格是否可能属于健康或致病细胞组。我们期望这种工具成为科学和临床诊断方法的一个很好的补充。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Imaris 9.1.2, software</td>
			<td>Bitplane, Z&#252;rich, Switzerland</td>
			<td>v.9.1.2</td>
			<td>3D image reconstruction and surface generation; this was used by us!</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blender 2.75a, software</td>
			<td>https://www.blender.org/</td>
			<td>v.2.75a</td>
			<td>3D and 4D open source animation software; 2.75a is the required version for this Python</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji /ImageJ, software</td>
			<td>https://fiji.sc/</td>
			<td>ImageJ v.1.52b</td>
			<td>Open source multi-D image analysis toolkit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MathWorks, www.mathworks.com</td>
			<td>R2017b</td>
			<td>General computational mathematical software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB Machine Learning kit</td>
			<td>MathWorks, www.mathworks.com</td>
			<td>R2017b</td>
			<td>Can only be used together with MATLAB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji plugins: SHADE</td>
			<td>https://github.com/zcseresn/ShapeAnalysis</td>
			<td>v.1.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji plugins: ActiveContour</td>
			<td>http://imagejdocu.tudor.lu/doku.php?id=plugin:segmentation:active_contour:start</td>
			<td>absnake2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td>See Imaris instructions for minimum computer requirements</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

morphology-based distinction between healthy and pathological cells utilizing fourier transforms and self-organizing maps

免疫细胞的外观和运动由其环境驱动。作为对病原体侵袭的反应, 免疫细胞被招募到炎症部位, 并被激活以防止入侵的进一步传播。这也反映在行为的变化和免疫细胞的形态外观。在癌组织中, 小胶质细胞的行为中观察到类似的 morphokinetic 变化: 肿瘤内小胶质缺乏复杂的3维形状, 分枝细胞过程较少, 移动速度比健康组织。对此类 morphokinetic 特性的检验需要复杂的3D 显微技术, 这在纵向执行时非常有挑战性。因此, 一个细胞的静态3D 形状的记录是简单得多, 因为这不需要活体测量, 也可以在切除组织进行。然而, 必须拥有能够快速准确描述3D 形状的分析工具, 并允许基于静态、形状相关信息的健康和致病性组织样本的诊断分类。在这里, 我们提出了一个工具包,通过自组织地图分析3D 细胞表面的一组2D 投影的轮廓的离散傅里叶分量。人工智能方法的应用使我们的框架能够了解各种细胞形状, 因为它适用于越来越多的组织样本, 而工作流程仍然很简单。

我们应用 DFT 来计算与单元投影对应的形状的主要组件。通过将 DFT 算法应用于单元投影拟合外围的 xy 坐标对, 得到了傅里叶描述符, 作为工作流 AbSnake 部分的输出。这些 xycoordinate 对可以作为一个复杂值的2D 矢量 "g" 来处理: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58543/58543eq1.jpg">
从向量 "g", 我们使用 DFT 来计算复值傅里叶谱: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58543/58543eq2.jpg"> 基于离散傅里叶谱的已知公式, 并用 "g" 的复数标注作为: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/58543/58543eq3.jpg"> 我们得到: <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/58543/58543eq4.jpg">(1) 我们可以计算真实 ("A") 和假想 ("B") 组件<img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/58543/58543eq5.jpg"> </img>: <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/58543/58543eq6.jpg">(2) <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/58543/58543eq7.jpg">(3) 在这里, 第一个 DFT 组件 G0对应于 m = 0, 它提供: <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/58543/58543eq8.jpg">(4) <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/58543/58543eq9.jpg">(5) 因此, 此组件描述原始对象的几何中心。 DFT 正向频谱的第二个元素 G1对应于 m = 1: <img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/58543/58543eq10.jpg"> <img alt="Equation 11" src="/files/ftp_upload/58543/58543eq11.jpg">(6)
从 Eq 6 我们得出的结论是, 这些点形成一个半径<img alt="Equation 12" src="/files/ftp_upload/58543/58543eq12.jpg">和起始角<img alt="Equation 13" src="/files/ftp_upload/58543/58543eq13.jpg">的圆, 其中圆圈描述一个完整的革命, 而形状被跟踪一次。圆的中心位于原点 (0, 0), 半径是 |G1|起始点是:
<img alt="Equation 14" src="/files/ftp_upload/58543/58543eq14.jpg"><img alt="Equation 15" src="/files/ftp_upload/58543/58543eq15.jpg">(7)
通常, 对于单个傅立叶系数<img alt="Equation 16" src="/files/ftp_upload/58543/58543eq16.jpg"> </img>, 坐标被描述为:
<img alt="Equation 17" src="/files/ftp_upload/58543/58543eq17.jpg"> <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/58543/58543eq18.jpg">(8)
与 eq 6 类似, eq 8 也描述一个圆, 但半径为 Rm= |Gm|, 一个起始角度<img alt="Equation 19" src="/files/ftp_upload/58543/58543eq19.jpg">和<img alt="Equation 20" src="/files/ftp_upload/58543/58543eq20.jpg">起点, 在这里, 当圆穿过 "m" 完整轨道16,17时, 轮廓被追踪一次。
作为 SOM 输入的形状参数 如图 1所述, 工作流应用于 deconvolved (使用测量点扩展函数) 活体小胶质细胞的多光子显微数据集, 以表征其健康或癌皮质的形态学变化。组织18。为重建的3D 表面的每个2D 投影计算了二十个 DFT 分量, 并将结果用作 SOM 训练的输入。在生理条件下, 小胶质细胞呈现出相当复杂的形状, 具有多个高度分枝过程 (图 2a)。当放置在一个癌环境 (皮质肿瘤模型), 小胶质细胞变成一个更简单, 更像纺锤形形状 (图 2b)。
经过训练的 SOM 进行了测试, 以评估其区分健康和癌细胞的能力。健康细胞种群被投射到 SOM 的一个区域 (图 2c)。SOM 对具有哑铃形活动区域的癌小胶质细胞数据集作出反应 (图 2d)。由 SOM 将来自健康和癌变组的 DFT 形状组件组成的盲目混合输入数据集投射到两个不同的组中, 同时保持其单个轮廓的形状与分离组 (图 2e;与2c和2d比较)。可以得出结论, 混合数据集已成功地由 SOM 聚集。
我们测试了 SOM 的性能, 将其预测与由医学专家对相同数据的手动分析进行比较, 根据其时空行为对数据集进行分类。专家鉴定了四个不同的细胞组 (静止细胞、吞噬细胞、相互作用细胞和移动细胞18), 它们被重建并用于训练 12x12 SOM。经过训练的网络 (图 3a) 显示了高命中值人工神经元组, 特别是在 SOM 的左下角和中部区域。通过四个随机选择的子集 (不是训练数据集的一部分), 测试了由专家18识别出来的四不同组的图像, 并对训练后的网络进行了响应。这些图像子集导致 SOM 四定义明确的响应, 如图 3b所示。静止细胞表现出最复杂的形状, 在神经网络中显示出最高的分离水平 (图 3b "静止" 面板)。其他三标识的单元格类型共享 som 在左下角的公共区域, 但由 som 分隔。因此, 左下角 SOM 区域对应于较低索引的 DFT 值。
som 方法的健壮性是通过使用经过训练的 som 与相同静止单元格类型的三个随机子集 (不是训练数据集的一部分) 进行测试的。SOM 对此输入的响应表现出非常相似的响应 (图 3c, 子集 1-3), 证明了我们方法的稳健性。
与时间相关的细胞形状变化以 DFT 的精确特征 为了检查单元格形状对 DFT 分量的时间依赖性变化的影响, 每个子群的一个到三个单元格 (见图 3b) 被跟踪13到28时间点。图 4显示了移动单元的前十个 DFT 组件 (图 4a) 和一个相互作用的单元格 (图 4b), 它们被绘制成时间函数。移动单元显示一个永久改变的形状 (见补充视频4在8), 这是由粗糙的 DFT 表面反射。在交互单元格的时间过程的第一个第三次的 DFT 振幅的爆发重合与快速和巨大的细胞形状变化, 如补充视频5在8中所示。
在跟踪移动单元 (图 5a) 和相互作用的单元格 (图 5b) 期间, 所有 19 DFT 分量的时间过程也在三个单独的时间点上被描述为这两个单元格。垂直轴代表在此六旋转角度, 并表明所有投影对于表征两个像元类型的形状同样重要。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58543/58543fig1.jpg"> 图1。一步一步的数据处理工作流程, 根据细胞形状识别细胞聚类.在3D 中重建的表面用作自动3维至2维投影的搅拌器的输入。对每个投影的外围进行了分析, 计算了 DFT 分量。这些组件充当了 Matlab 中经过训练的 som 的输入, 或者用于训练新的 som。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58543/58543fig1large.jpg" target="_blank">请点击这里查看这个数字的更大版本.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58543/58543fig2.jpg"> 图2。在控制条件 (a) 和癌组织 (b) 重构小胶质细胞表面的截屏下, 典型地出现老鼠皮质的胶质干细胞。SOM 预测是从小鼠皮层的三组胶质样样本中创建的: 控制 (非肿瘤) 细胞 (c)、肿瘤细胞 (d) 和细胞混合种群 (e)。此图已使用权限8进行了修改。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58543/58543fig2large.jpg" target="_blank">请点击这里查看这个数字的更大版本.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58543/58543fig3.jpg"> 图 3.(左)由768个输入要素向量组成的小胶质细胞数据集的自组织映射。该数据集用于训练12x12 人工神经网络, 使用六边形邻域几何、随机初始化和2000纪元。(右)前10个 DFT 组件的相应 som 输入平面 (b) 在 (a) 中描述的 som 的响应, 到一个随机 VRML 文件子集, 每个从四个单元格类型 "移动"、"交互"、"休息" 和 "吞噬", 如图 5所示。Bayerl等。18. (c) 与 "静止细胞"-3D 曲面的整个数据集 (因此不是训练数据集的一部分) 的同一 SOM (a、左) 到三个随机子集的响应。三反应之间的相似性是值得注意的。此图已使用权限8进行了修改。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58543/58543fig3large.jpg" target="_blank">请点击这里查看这个数字的更大版本.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58543/58543fig4.jpg"> 图 4.(a) 小胶质细胞活体成像实验中前10个 DFT 分量的时间依赖性。此面板显示 "移动单元" 类型的单元格的数据。x 轴对应于六十年代时间分辨率的实验时间点, y 轴以任意单位 (美大) 显示 dft 分量的振幅, 而 z 轴对应于1到10之间的 dft 分量。(b) 如在 (a) 中, 但对于 "相互作用的细胞" 类型的细胞。此图已使用权限8进行了修改。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58543/58543fig4large.jpg" target="_blank">请点击这里查看这个数字的更大版本.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58543/58543fig5.jpg"> 图 5.(a) "移动细胞" 单元的所有 19 DFT 分量在实验的开始、中间和结束时的行为。x 轴上的数字对应于1到19之间的 DFT 组件 ID。y 轴以任意单位 (美大) 显示 DFT 分量振幅, 而 z 轴则标记六个随机旋转角度。(b) 与 (a) 相同, 但对于 "相互作用的细胞" 类型的细胞。此图已使用权限8进行了修改。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58543/58543fig5large.jpg" target="_blank">请点击这里查看这个数字的更大版本.</a>

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Morphology-Based Distinction Between Healthy and Pathological Cells Utilizing Fourier Transforms and Self-Organizing Maps

在这里, 我们提供了一个工作流, 可以根据其3维形状识别健康和病理细胞。我们描述了使用基于3D 表面的2D 投影轮廓的过程来训练自组织地图, 该图将提供调查的细胞种群的客观聚类。

利用傅里叶变换和自组织映射的形态学区分健康和病理细胞

The appearance and the movements of immune cells are driven by their environment. As a reaction to a pathogen invasion, the immune cells are recruited to ...

该方法有助于回答基础研究和临床应用的一些关键问题，如癌症研究和癌症治疗，但也有助于回答免疫学领域的关键问题。此方法的主要优点是，它是一种静态方法，易于使用。该技术能够根据病细胞的形状和运动特征自动识别其类型。该技术的影响延伸到癌症或炎症性疾病的诊断和治疗。这种方法可以提供免疫细胞和癌细胞之间行动的见解，但它也可以应用于任何需要三维显微镜数据的领域。这可能是个人新的这种方法将挣扎，因为他们的问题，以描述和验证三维显微镜数据。我们认为，这种方法的可视化演示至关重要，因为我们在这里使用的软件工具对许多科学家来说并不熟悉。首先，获取随附的文本协议中描述的高分辨率、去通信的三维显微镜数据集。将 3D 图像数据加载到重建软件中，并开始为每个对象创建 3D 曲面。为此，请选择"3D 视图"选项并单击"曲面"，然后单击"下一步"按钮以继续执行曲面创建向导。现在，选择用于曲面重建的图像通道。选择不隐藏表面细节但避免多孔表面的平滑值。通过单击"平滑选项"复选框并提供平滑半径来应用平滑功能。在创建显微镜数据的三维影像结构时，尤其要注意平滑系数和适当的阈值方法，以便不丢失任何细胞特征或形状。接下来，选择阈值方法以查找曲面。当对象（如此处所示的对象）与背景分离良好且亮度水平大致均匀时，请使用绝对强度阈值。当对象的强度不同但仍可以与本地背景和周围的其他对象分离时，请应用局部对比度阈值。根据重建对象的预期直径值设置本地阈值搜索区域。接下来，从选项列表中选择，根据感兴趣的形态参数筛选重建曲面。这包括体积、球面、表面体积比等。以 VRML 等格式保存和导出生成的曲面，该格式与下一步中使用的 3D 动画软件兼容。启动搅拌机，然后转到窗口右侧的"输出"选项卡。从下拉菜单中选择 TIFF 格式，将"颜色深度"设置为 8 位 RGBA。接下来，切换到脚本模式，并导航到提供的脚本文件标题：GUI_Autorotate。py，可从 github 存储库下载用于此工作。回到主窗口中，单击"运行脚本"，并在输入提示时选择 wrl 文件的文件夹。然后，转到默认菜单。此处，将旋转设置为 6 或高于 6 的值。单击"旋转"按钮运行脚本。六个不同角度的旋转通常足以区分不同的细胞群，但是，我们不建议使用少于六个旋转，以便不丢失任何有关形状或特征的信息。将用于输入的同一文件夹中的单个曲面的投影保存。默认情况下，图像以 8 位 TIFF 格式保存，这是 FIJI 插件"阴影"所需的格式。打开斐济，并在"插件"菜单中选择"阴影"。从默认值开始，稍后微调参数。单击"准备好运行程序时""确定"。接下来，选择包含上一节中创建的 TIFF 文件的源文件夹，然后单击"选择"。然后，提供输出数据文件夹。当出现第一个图像时，在单元格周围绘制一个矩形，然后单击"确定"开始。当插件运行时，您会看到图像在外围的预处理，查找由红线指示的单元格。发现边的坐标现在用于计算离散四位零部件。若要首次训练自组织地图，请从加载 MATLAB 开始。加载 TrainSOM MATLAP 脚本，然后选择"运行"以开始培训。如果需要，请确保正确路径文件。当它开始运行时，将弹出其他窗口以显示进度。等待培训完成，然后再继续。默认情况下，脚本设置为运行 2，000 次迭代，或者史诗。培训完成后，检查网络拓扑图。下面是相邻距离绘图、采样命中图和输入平面图的示例。自组织地图是发现数据集中隐藏关系的重要工具。它们客观地对您的数据进行聚类，并且它们的优势是不需要训练数据集，因为它们在无人监督的情况下学习。网络现已接受培训。右键单击工作区中的文件，然后将其保存以供将来使用。使用已训练的地图时，在自组织地图中加载，以便对数据集进行聚类。然后，导入要使用预加载的训练映射进行测试的 CSV 文件。在这里，我们将选择阴影插件的CSV输出。加载数据时，将输出类型更改为数字矩阵，然后选择"导入选择"。分类完成后，使用命令窗口计算各种绘图。这里的图像显示来自微胶质细胞的去进化内多光子显微镜数据集。在生理条件下，微胶质呈现了一个相当复杂的形状，具有多个高度分支的过程。当放置在癌变的环境中，如这种皮质肿瘤模型，微胶质更改为更简单，更主轴状的形状。其中 20 个形状更成形的描述组件用作输入，用于训练自组织映射。然后对训练有素的地图进行测试，以评估其区分健康细胞和癌细胞的能力。健康细胞群被投影到此处显示的单个区域，而癌性微胶质数据集则显示为哑铃形活动区域。地图也可以由医学专家训练，以识别不同的细胞组。在这里，休息细胞、吞噬细胞、相互作用细胞和移动细胞被识别、重建并用于训练12x12地图。此组合地图显示了高命中率的人工神经元组，尤其是在地图的左下角和中间区域。使用训练自组织映射测试映射方法的鲁棒性，该映射具有 3 个随机子集，这些随机子集不是训练数据集的一部分。S.O..M的响应表现出非常相似的响应，指示正确的单元格类型。在开发这种技术之后，现在我们有了一个工具包，我们可以简单地对细胞形状的变化进行分类。这些变化发生，例如，在癌症期间，或其他免疫系统反应，我们可以测量他们使用显微镜，使用整个动物，切除组织，甚至芯片上的器官。

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