Name: plant growth and agrobacterium-mediated floral-dip transformation of the extremophyte schrenkiella parvula
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Plant Growth and Agrobacterium-mediated Floral-dip Transformation of the Extremophyte Schrenkiella parvula at JoVE.com

وأيد هذا العمل على جائزة مؤسسة العلوم الوطنية 1616827 المجلس.

1. نمو النبات
<ol><li>
تعقيم البذور (اختياري)
	<ol>
<li>يعد التبييض 50% في الماء المقطر مزدوجة (ddH2س) مع 1 أو 2 قطرات من المنظفات غير الأيونية (انظر الجدول للمواد) في أنبوب 50 مل. عكس الأنبوبة عدة مرات لخلط الحل. ملاحظة: فمن الأفضل إجراء تعقيم البذور في تدفق الصفحي مجلس ا...

<ol>
	<li>Dassanayake, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+of+the+extremophile+crucifer+Thellungiella+parvula.">The genome of the extremophile crucifer Thellungiella parvula.</a> Nature Genetics. 43 (9), 913-918 (2011).</li><li>Oh, D. -. H., Dassanayake, M., Bohnert, H. J., Cheeseman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+at+the+extreme:+lessons+from+the+genome.">Life at the extreme: lessons from the genome.</a> Genome Biology. 13 (3), 241 (2012).</li><li>Whited, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Next+Top+Models.">The Next Top Models.</a> Cell. 163 (1), 18-20 (2015).</li><li>Dassanayake, M., Yun, D. O. D., Bressan, R. A., Cheeseman, J. M., Bohnert, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+scope+of+things+to+come:+New+paradigms+in+biotechnology.">The scope of things to come: New paradigms in biotechnology.</a> Plant Biotechnology and Agriculture: Prospects for the 21st Century. , 19-34 (2009).</li><li>Dittami, S. M., Tonon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomes+of+extremophile+crucifers:+New+platforms+for+comparative+genomics+and+beyond.">Genomes of extremophile crucifers: New platforms for comparative genomics and beyond.</a> Genome Biology. 13 (8), 166 (2012).</li><li>Amtmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Learning+from+evolution:+Thellungiella+generates+new+knowledge+on+essential+and+critical+components+of+abiotic+stress+tolerance+in+plants.">Learning from evolution: Thellungiella generates new knowledge on essential and critical components of abiotic stress tolerance in plants.</a> Molecular Plant. 2 (1), 3-12 (2009).</li><li>Oh, D. -. H., Hong, H., Lee, S. Y., Yun, D. -. J., Bohnert, H. J., Dassanayake, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+structures+and+transcriptomes+signify+niche+adaptation+for+the+multiple-ion-tolerant+extremophyte+Schrenkiella+parvula.">Genome structures and transcriptomes signify niche adaptation for the multiple-ion-tolerant extremophyte Schrenkiella parvula.</a> Plant Physiology. 164 (4), 2123-2138 (2014).</li><li>Orsini, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+salt+tolerance+parameters+in+11+wild+relatives+of+Arabidopsis+thaliana.">A comparative study of salt tolerance parameters in 11 wild relatives of Arabidopsis thaliana.</a> Journal of Experimental Botany. 61 (13), 3787-3798 (2010).</li><li>Uzilday, B., Ozgur, R., Sekmen, A. H., Yildiztugay, E., Turkan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+alternative+electron+sinks+and+antioxidant+defence+in+chloroplasts+of+the+extreme+halophyte+Eutrema+parvulum+(Thellungiella+parvula)+under+salinity.">Changes in the alternative electron sinks and antioxidant defence in chloroplasts of the extreme halophyte Eutrema parvulum (Thellungiella parvula) under salinity.</a> Annals of Botany. 115 (3), 449-463 (2015).</li><li>Teusink, R. S., Rahman, M., Bressan, R. A., Jenks, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cuticular+waxes+on+Arabidopsis+thaliana+close+relatives+Thellungiella+halophila+and+Thellungiella+parvula.">Cuticular waxes on Arabidopsis thaliana close relatives Thellungiella halophila and Thellungiella parvula.</a> International Journal of Plant Sciences. 163 (2), 309-315 (2002).</li><li>Jarvis, D. E., Ryu, C. H., Beilstein, M. A., Schumaker, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+for+SOS1+in+the+convergent+evolution+of+salt+tolerance+in+Eutrema+salsugineum+and+Schrenkiella+parvula.">Distinct roles for SOS1 in the convergent evolution of salt tolerance in Eutrema salsugineum and Schrenkiella parvula.</a> Molecular Biology and Evolution. 31 (8), 2094-2107 (2014).</li><li>Clough, S. J., Bent, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Floral+dip:+A+simplified+method+for+Agrobacterium-mediated+transformation+of+Arabidopsis+thaliana.">Floral dip: A simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.</a> Plant Journal. 16 (6), 735-743 (1998).</li><li>Koornneef, M., Meinke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+Arabidopsis+as+a+model+plant.">The development of Arabidopsis as a model plant.</a> Plant Journal. 61 (6), 909-921 (2010).</li><li>Bai, J., Wu, F., Mao, Y., He, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+planta+transformation+of+Brassica+rapa+and+B.+napus+via+vernalization-infiltration+methods.">In planta transformation of Brassica rapa and B. napus via vernalization-infiltration methods.</a> Protocol Exchange. 10, 1028 (2013).</li><li>Sparrow, P. A. C., Goldsack, C. M. P., &#216;stergaard, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+technology+in+the+Brassicaceae.">Transformation technology in the Brassicaceae.</a> Genetics and Genomics of the Brassicaceae. , 505-525 (2011).</li><li>Hoagland, D. R., Arnon, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+water-culture+method+for+growing+plants+without+soil.">The water-culture method for growing plants without soil.</a> California Agricultural Experiment Station Circular. 347 (347), 1-32 (1950).</li><li>Saiki, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer-directed+enzymatic+amplification+of+DNA+with+a+thermostable+DNA+polymerase.">Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase.</a> Science. 239 (4839), 487-491 (1988).</li><li>Sun, Y., Sriramajayam, K., Luo, D., Liao, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Quick,+cost-free+method+of+purification+of+dna+fragments+from+agarose+gel.">A Quick, cost-free method of purification of dna fragments from agarose gel.</a> Journal of Cancer. 3, 93-95 (2012).</li><li>Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+sequencing+with+chain-terminating+inhibitors.">DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12), 5463-5467 (1977).</li><li>Bertani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+Lysogenesis+I.+The+mode+of+phage+liberation+by+lysogenic+Eschericia+coli.">Studies on Lysogenesis I. The mode of phage liberation by lysogenic Eschericia coli.</a> Journal of Bacteriolgy. 62 (3), 293-300 (1951).</li><li>Koncz, C., Martini, N., Szabados, L., Hrouda, M., Bachmair, A., Schell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specialized+vectors+for+gene+tagging+and+expression+studies.">Specialized vectors for gene tagging and expression studies.</a> Plant Molecular Biology Manual. , 53-74 (1994).</li><li>Weigel, D., Glazebrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+Agrobacterium+using+electroporation.">Transformation of Agrobacterium using electroporation.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (30), (2006).</li><li>Murray, M. G., Thompson, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+high+molecular+weight+plant+DNA.">Rapid isolation of high molecular weight plant DNA.</a> Nucleic Acids Research. 8 (19), 4321-4326 (1980).</li><li>Inan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salt+cress.+a+halophyte+and+cryophyte+Arabidopsis+relative+model+system+and+its+applicability+to+molecular+genetic+analyses+of+growth+and+development+of+extremophiles.">Salt cress. a halophyte and cryophyte Arabidopsis relative model system and its applicability to molecular genetic analyses of growth and development of extremophiles.</a> Plant Physiol. 135 (3), 1718-1737 (2004).</li><li>Ghedira, R., De Buck, S., Nolf, J., Depicker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+efficiency+of+Arabidopsis+thaliana+floral+dip+transformation+is+determined+not+only+by+the+Agrobacterium+strain+used+but+also+by+the+physiology+and+the+ecotype+of+the+dipped+plant.">The efficiency of Arabidopsis thaliana floral dip transformation is determined not only by the Agrobacterium strain used but also by the physiology and the ecotype of the dipped plant.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 26 (7), 823-832 (2013).</li><li>Shaohong, F. U., Xianya, W. E. I., Yingze, N. I. U., Shixing, G. U. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+Brassica+napus+with+the+method+of+floral-dip.">Transformation of Brassica napus with the method of floral-dip.</a> Biotechnology: Genomics and Its Applications. , 45-49 (2005).</li><li>Li, J., Tan, X., Zhu, F., Guo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+simple+method+for+Brassica+napus+floral-dip+transformation+and+selection+of+transgenic+plantlets.">A rapid and simple method for Brassica napus floral-dip transformation and selection of transgenic plantlets.</a> International Journal of Biology. 2 (1), 127 (2010).</li><li>Li, H. Q., Xu, J., Chen, L., Li, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+an+efficient+Agrobacterium+tumefaciens-mediated+leaf+disc+transformation+of+Thellungiella+halophila.">Establishment of an efficient Agrobacterium tumefaciens-mediated leaf disc transformation of Thellungiella halophila.</a> Plant Cell Reports. 26 (10), 1785-1789 (2007).</li><li>Wu, G., Rossidivito, G., Hu, T., Berlyand, Y., Poethig, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traffic+lines:+New+tools+for+genetic+analysis+in+Arabidopsis+thaliana.">Traffic lines: New tools for genetic analysis in Arabidopsis thaliana.</a> Genetics. 200 (1), 35-45 (2015).</li></ol>

الدولة الفسيولوجية للنبات يؤثر إلى حد كبير كفاءة التحويل25. استخدام النباتات صحية ونشطة للتحول شرط رئيسي لنجاح عملية التحول في بارفولا س. وسيكون الماء أو النباتات وأكد الخفيفة الزهور أقل مقارنة بالنباتات صحية مثالية للتحول (الشكل 1، مركز لوحة). س. بارفول...

في هذا البروتوكول، يصف لنا النمو وإنشاء خطوط المعدلة وراثيا مستقرة لنموذج اكستريموفيتي بارفولا شرينكيلا. توافر نظام التحويل الفعال السمة مميزة لأي نموذج الوراثية تنوعاً. النباتات التي تزدهر في البيئات المتطرفة، المشار إليها اكستريموفيتيس، توفر موردا بالغ الأهمية لفهم التعديلات النبات للضغوط البيئية. بارفولا شرينكيلا (سابقا بارفولا ثيلونجيلا وبارفولوم يوتريما) نموذج اكستريموفيتي واحد مثل هذا، مع توسيع نطاق الموارد المجينية1،2،3،،من45. ومع ذلك، بروتوكولات التحول لم بعد تم تبلغ عن س. بارفولا في الدراسات المنشورة.
جينوم بارفولا س. الجينوم اكستريموفيتي المنشورة الأولى في الفصيلة الكرنبيه (الخردل-الملفوف الأسرة) ويظهر سينتيني جينوم شاملة واسعة النطاق مع النموذج غير اكستريموفيتي، أعطيت التمويل1. وهكذا، دراسات مقارنة بين التمويل أ وس. بارفولا يمكن أن تستفيد من ثروة الدراسات الجينية التي أجريت على التمويل (أ) جعل الفرضيات الزاخر بالمعلومات عن كيفية تطور الجينوم س. بارفولا وينظم بطريقة مختلفة للتعامل مع تشدد المتطرفة البيئية5،،من67. س. بارفولا واحد من الملوحة أكثر الأنواع (استناداً إلى التربة كلوريد الصوديوم LD50) بين الأقارب البرية المعروفة التمويل (أ)8. وبالإضافة إلى التسامح كلوريد الصوديوم، بارفولا س. على قيد الحياة، ويكمل دورة حياته حضور عدة أيونات الملح في تركيزات عالية السمية لمعظم النباتات7. استجابة للضغوط اللاأحيائية السائدة في بيئتها الطبيعية، قد تطورت سمات مختلفة، ومنها عدة وقد درست في الكيمياء الحيوية أو الفسيولوجية المستوى 8،9،10، 11.
منذ عام 2010، هناك ما يزيد على 400 الأقران-اطلعت المنشورات التي تستخدم بارفولا س. كأنواع مستهدفة أو استخدامه في مقارنة مع جينومات النباتات الأخرى. ومع ذلك، يمكن تحديد اختناق واضح مع إلقاء نظرة فاحصة لنوع ما من دراسات قد أجريت. غالبية هذه التقارير مناقشة إمكانية استخدام س. بارفولا في الدراسات المستقبلية أو استخدامه في مقارنة الجينوم أو الدراسات فيلوجينوميك. نظراً لعدم وجود بروتوكول التحول من مفهوم الإثبات المحددة س. بارفولا، فإنه لم يتم استخدامه في الدراسات الجينومية الوظيفية، على الرغم من وجود واحدة من أعلى نوعية النبات الجينوم المتاحة حتى الآن (> 5 ميغابايت contig N50) تجميع و المشروح في مستوى الكروموسوم بسيودوموليكوليس1.
وأصبحت الطريقة المتبعة بوساطة تحويل الأزهار تراجع الأسلوب الأكثر على نطاق واسع المستخدمة لإنشاء خطوط تراسنجينيك في التمويل (أ)، وتطوير نظام استنساخه من التحول كان عاملاً حاسما في نجاحها نموذج الوراثية12،13. ومع ذلك، تبين أن تتحول بنجاح باستخدام الأسلوب الأزهار تراجع المتقدمة التمويل (أ)ليست كل الفصيلة الكرنبيه الأنواع. خصيصا، والأنواع الثانية النسب الفصيلة الكرنبيه التي تتضمن بارفولا س. قد المعاندة للإزهار تراجع التحول يستند إلى أساليب14،15.
عادة النمو المزهرة غير محدد س. بارفولا، جنبا إلى جنب مع مورفولوجيا أوراق ضيقة، جعلت تحديا اعتماد الطريقة القياسية المتبعة بوساطة الأزهار تراجع التحول. في هذه الدراسة، ونحن تقرير البروتوكول المعدل وضعنا للتحول استنساخه من س. بارفولا.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1303px;" width="1302">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Agar</td>
			<td style="width:293px;">VWR International, Radnor, PA</td>
			<td style="width:127px;">90000-762</td>
			<td style="width:541px;">Bacto Agar Soldifying Agent, BD Diagnostics</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B5 vitamins</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>G1019</td>
			<td>Gamborg&#8217;s Vitamin Solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Desiccant</td>
			<td>W A Hammond Drierite, Xenia, OH</td>
			<td style="width:127px;">22005</td>
			<td>Indicating DRIERITE 6 mesh</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:341px;">Destination vector for plant transformation</td>
			<td>TAIR</td>
			<td style="width:127px;">Vector:6531113857</td>
			<td>pKGWFS7</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Electroporation cuvette</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>9104-5050</td>
			<td>Electroporation cuvette, round cap, 0.2 cm gap</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Electroporator</td>
			<td>BIO-RAD Laboratories, Hercules, CA</td>
			<td>1652100</td>
			<td>MicroPulser Electroporator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fertilizer beads</td>
			<td>Osmocote Garden, Marysville, OH</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Osmocote Smart-Release Plant Food&#160;Flower &#38; Vegetable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gel extraction kit</td>
			<td>iNtRON Biotechnology, Boston, MA</td>
			<td>17289</td>
			<td>MEGAquick-spin Total fragment DNA purification kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gentamicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>G1914-5G</td>
			<td>Gentamicin sulfate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Glufosinate-ammonium (11.3%) herbicide (BASTA)</td>
			<td>Bayer environmental science, Montvale, NJ</td>
			<td>N/A</td>
			<td>FINALE herbicide</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kanamycin</td>
			<td>VWR International, Radnor, PA</td>
			<td>200004-444</td>
			<td>Kanamycin monosulfate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MES</td>
			<td>Bioworld, Dublin, OH</td>
			<td>41320024-2</td>
			<td>MES, Free Acid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MS salt</td>
			<td>MP Biomedicals, Santa Anna, CA</td>
			<td>092621822</td>
			<td>Hoagland&#39;s modified basal salt mixture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N6-benzylaminopurine (BA)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>B3274</td>
			<td>6-Benzylaminopurine solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td>Sigma-Alrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>Sodium chloride</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Non-ionic detergent</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td>TWEEN 20&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Plasmid isolation kit</td>
			<td>Zymo Research, Irvine, CA</td>
			<td>D4036</td>
			<td>Zyppy Plasmid Kits</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinase enzyme mix kit</td>
			<td>Life Technology</td>
			<td>11791-020</td>
			<td>Gateway LR Clonase II Enzyme mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rifampicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>R3501-1G</td>
			<td>Rifampicin, powder, &#62;= 97% (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Shaking incubator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>SHKE4450</td>
			<td>MaxQ 4450 Benchtop Orbital Shakers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Soil mix</td>
			<td>Sun Gro</td>
			<td>SUN239223328CFLP</td>
			<td>Sun Gro Metro-Mix 360 Grower Mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spectinomycin</td>
			<td>VWR International, Radnor, PA</td>
			<td>IC15206705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile 50ml conical tubes</td>
			<td>USA Scientific, Ocala, FL</td>
			<td>1500-1811</td>
			<td>50 ml conical screw cap tubes, copolymer, racks, sterile</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sucrose</td>
			<td>VWR International, Radnor, PA</td>
			<td>57-50-1</td>
			<td>Sucrose, ACS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Surfactant solution</td>
			<td>Lehle seeds, Round Rock, TX</td>
			<td>VIS-02</td>
			<td>Silwet L-77</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Topoisomerase-based cloning kit</td>
			<td>Life Technologies, Carlsbad, CA</td>
			<td>K240020</td>
			<td>pENTR/D-TOPO Cloning Kit, with One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tryptone</td>
			<td>VWR International, Radnor, PA</td>
			<td>90000-282</td>
			<td>BD Bacto Tryptone, BD Biosciences</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast Extract</td>
			<td>VWR International, Radnor, PA</td>
			<td>90000-722&#160;</td>
			<td>BD Bacto Yeast Extract, BD Biosciences</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

plant growth and agrobacterium-mediated floral-dip transformation of the extremophyte schrenkiella parvula

بارفولا شرينكيلا اكستريموفيتي تكييف الإجهادات اللاأحيائية المختلفة، بما في ذلك عدة تؤكد سمية أيون. على الرغم من الموارد المجينية عالية الجودة المتاحة لدراسة كيفية تكييف النباتات للبيئة تؤكد، قيمته كنموذج الجينوم وظيفي وأداة كان محدودا بسبب الافتقار إلى نظام التحول ممكناً. في هذا البروتوكول، ونحن تقرير كيفية توليد المعدلة وراثيا مستقرة س. بارفولا خطوط باستخدام أسلوب الأزهار تراجع المتبعة بوساطة. قمنا بتعديل البروتوكول التحويل المستخدمة التمويل (أ) لحساب الصفات الفريدة من س. بارفولا، مثل عادة مزهرة غير محددة ومحتوى شمع ابيكوتيكولار عالية على أوراق. باختصار، كانت طبقات البذور بارفولا س. عند 4 درجة مئوية لمدة خمسة أيام قبل الغرس. كانت تزرع النباتات في كبيرة ضوء ح 14 و 10 ح الظلام و 130 µmol م-2s-1 كثافة ضوء، عند 22 درجة مئوية إلى 24 درجة مئوية. تم اختيار ثمانية إلى تسعة مصانع منذ أسابيع مع إينفلوريسسينسيس متعددة للتحول. كانت انخفضت هذه إينفلوريسسينسيس في حل تسلل من GV3101 tumefaciens المتبعة يحمل بلازميد pMP90RK . ونحن إجراء جولتين من غمس الزهور مع الفاصل زمني من ثلاثة إلى أربعة أسابيع لزيادة كفاءة التحويل. تم جمع بذور T1 وتجفف لمدة أربعة أسابيع في حاوية مع ﻣﺟﻓﻓﺍﺗ قبل الإنبات على الشاشة لمرشح تحويل خطوط. واستخدمت المقاومة إلى باستا للشاشة النباتات T1. نحن رش الحل باستا ثلاث مرات بفاصل زمني لمدة ثلاثة أيام بدءاً من المحطتين أسبوع الحد من إيجابيات كاذبة. وأجرى اختبار إسقاط باستا على الباقين على قيد الحياة محطات فردية لتحديد ترانسفورمانتس إيجابية حقيقية. وكان كفاءة التحويل 0.033%، مما أسفر عن 3 – 4 النباتات المعدلة وراثيا كل بذور T1 10,000 روج.

قمنا بتطوير بروتوكول تحويل التي تمكن من حصاد البذور0 ر خلال 150 يوما، استخدام أسلوب الأزهار تراجع معدلة من أن التمويل (أ). ويبين الشكل 1 موجزاً للجدول الزمني والنباتات بارفولا س. التي تمثل المرحلة المثلى لتنفيذ هذا التحول عن طريق الأزهار تراج...

Watch this Scientific Journal Video about Plant Growth and Agrobacterium-mediated Floral-dip Transformation of the Extremophyte Schrenkiella parvula at JoVE.com

Plant Growth and Agrobacterium-mediated Floral-dip Transformation of the Extremophyte Schrenkiella parvula

النباتات النمو والتحول فلورال-تراجع المتبعة بوساطة من اكستريموفيتي بارفولا شرينكيلا

التحول المتبعة بوساطة استخدام أسلوب الأزهار تراجع يمكن أن تستخدم بنجاح لإنشاء خطوط المعدلة وراثيا مستقرة من طراز اكستريموفيتي بارفولا شرينكيلا. نحن نقدم على بروتوكول تعديل من أن نبات التمويل، النظر في عادات مختلفة للنمو والخصائص الفسيولوجية اكستريموفيتي.

Schrenkiella parvula is an extremophyte adapted to various abiotic stresses, including multiple ion toxicity stresses. Despite high-quality genomic ...

هذه الطريقة، بروتوكول تحويل قابل للاستنساخ لRenkiella parvula، يمكن أن تساعد في الإجابة على الأسئلة في مجال الجينوم النباتي المقارن والوظيفي، وخاصة الدراسات التي تحقق التكيفات النباتية إلى بيئات قاسية. هذه التقنية تمكن من إجراء تحقيقات في الوظائف الروتينية في Parvula شرنكيلا على extremophyte تكييفها لضغوط الملح متعدد الأيونات. كما أنه يتيح إجراء دراسات مقارنة تنظر أيضا إلى قريبها، الأم أربيدبسيس ثاليانا.مقارنة شرنكيلا Parvula مع Aribidopsis ثاليانا يمكن أن توفر نظرة ثاقبة في الاختلافات في تنظيم الجينات والوظيفة التي تمكن التكيف فريدة من الناحية الخاصة من Parvula شرنكيلا. بروتوكول التحول لعربيدوبسيس ثاليانة قد تم بالفعل راسخة. وتمكن هذه الطريقة الآن من إجراء دراسات مقارنة باستخدام نباتات شرنكيلا بارفولا المعدلة وراثيا.عموما سوف الباحثون جديدة لهذه الطريقة النضال بسبب عادة المزهرة ومورفولوجيا ورقة من النباتات شرنكيلا Parvula التي تجعل التحول الفعال باستخدام تراجع النباتات وكذلك اختيار التحويلات الحقيقية صعبة. للبدء، استخدم مسواك مبللة لنقل حوالي 20 إلى 25 بذور S.Parvula على التربة الرطبة. ثم تقسيم البذور في أربع درجات مئوية لمدة خمسة إلى سبعة أيام.بعد التقسيم الطبقي، والعودة البذور إلى غرفة النمو لمدة سبعة إلى 10 أيام. مرة واحدة وقد انبت جميع الشتلات، وترك شتلة واحدة فقط في كل من الزوايا الأربع وفي وسط الأواني. تنمو النباتات لمدة ثمانية إلى 10 أسابيع في غرفة النمو حتى زهرة.في يوم التحول، حدد النباتات S.Parvula وفقا لبروتوكول النص. استخدام ملقط ومقص صغير لإزالة أي ملقح infloresences التي تتطور بالفعل إلى السيليك. بعد النباتات جاهزة، وإعداد حل تسلل البكتيريا الزراعية.بعد هذا، تراجع إنفلورس S.Parvula في حل تسلل البكتيريا الزراعية لمدة 20 ثانية. يظهر هنا هو المرحلة الأولى من النباتات التي يمكن استخدامها للتحول، طالما يتم إزالة السيليك المتقدمة بالفعل قبل التحول، يمكن استخدام النباتات القديمة مع المزيد من الزهور. بعد التحول، ووضع زهرة انخفض النباتات أفقيا في الصواني النظيفة مع القباب لتغطية النباتات.ثم ضع النباتات في غرفة نمو مظلمة لمدة يوم إلى يومين. إعادة النباتات إلى وضع مستقيم ونقلها إلى غرفة النمو. في الأسبوع التالي، مراقبة فيورسنس انخفض.بعد عشرة أيام من أول تراجع الأزهار، سوف تستمر نباتات S.Parvula في إنتاج رواسب وسيليك جديدة. ويمكن إجراء جولة ثانية من تراجع الأزهار لمزيد من تحويل النهايات الناشئة حديثا. تنمو النباتات حتى تنضج البذور، وحصاد البذور حوالي 21 أسبوعا.جفف البذور لمدة أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع في درجة حرارة الغرفة في حاوية محكمة الإغلاق مليئة بالجفاف. زرع بذور T واحد وفقا لبروتوكول النص. تنمو النباتات حتى أول اثنين إلى ثلاثة أوراق حقيقية تتطور.لأداء الاختيار الأول لمقاومة مبيدات الأعشاب، تمييع مبيدات الأعشاب الأمونيوم الغلوفوزية ورذاذه على الشتلات. تغطية الشتلات مع القباب بين عشية وضحاها. ضع الصواني مرة أخرى إلى غرفة النمو، وأزل القبة.انتظر حتى يتم اختيار معظم الشتلات من قبل مبيد الأعشاب. لبدء الاختيار الثاني، تحديد النباتات التي البقاء على قيد الحياة بعد رش ثلاث إلى أربع مرات مع حل BASTA. بعد زراعة النباتات لمدة أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع أخرى، حدد أكبر ورقة ناضجة على كل مصنع.فرك المقبل سطح ورقة بلطف مع إصبع لإزالة طبقة الشمع. ثم ضع قطرة من محلول BASTA المخفف على الورقة. مراقبة الأوراق المعالجة مع حل BASTA لعلامات الذبول لمدة تصل إلى أسبوع واحد.وأخيراً حدد النباتات مع يترك تتأثر قطرات BASTA لمزيد من التحليل. في هذا البروتوكول، تم تحويل S.Parvula مع البكتيريا الزراعية باستخدام طريقة تراجع الأزهار. وأدت العدوى بالبكتيريا الزراعية إلى إجهاض بعض الزهور.ومع ذلك واصلت النباتات S.Parvula لإنتاج الزهور الجديدة بعد أول غمس زهرة، ويمكن أن تتحول مرة أخرى. باستخدام اختبارات الرذاذ والإسقاط BASTA، يمكن تحديد التحويلات الإيجابية الحقيقية بدقة. ويمكن تقليل عدد العينات التي تم اختبارها باستخدام تأكيد PCR.في حين أن هذه الطريقة تشبه تحول عربيدوبسيس ثاليانا، من المهم أن نتذكر الاختلافات في النمو ومورفولوجيا شرنكيلا بارفولا. تعديل البروتوكول لعكس هذه الاختلافات أمر بالغ الأهمية لنجاح التحويل. يمكن أن تساعد هذه التقنية الباحثين على استكشاف تطور الاختلافات الجينومية التي تؤدي إلى تعديلات متعددة على إجهاد الملح في نموذج extremophyte ، شرنكيلا بارفولا.الجمع بين هذه التقنية مع المعلومات عن وظائف Aradopsis ثاليانا، مصنع آخر يرتبط ارتباطا وثيقا شرنكيلا Parvula. يمكن للباحثين دراسة الاختلافات في التنظيم والوظائف التي هي اثنين من هياكل متميزة بين هذين النوعين. خلال عملية التحول ، من المهم أن تحتوي على جميع حل تسلل البكتيريا الزراعية في حاويات قابلة للمعالجة التلقائية.تعقيم والتخلص بأمان جميع المواد التي جاءت في اتصال مع البكتيريا الزراعية بما في ذلك القفازات، نصائح ماصة الماكرو، والمناشف الورقية.

Research

JoVE Journal

Genetics

Plant Growth and Agrobacterium-mediated Floral-dip Transformation of the Extremophyte Schrenkiella parvula

A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation

ومنصة الروبوتية لإنتاجية عالية البروتوبلازم عزل والتحول

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal ...

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

التلاعب الجيني للمسببات الأمراض النباتية<em&gt; السوادية الذروية</em&gt; لدراسة علم الأحياء الفطرية النباتية وميكروب التفاعلات

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

The Use of Induced Somatic Sector Analysis (ISSA) for Studying Genes and Promoters Involved in Wood Formation and Secondary Stem Development

The Use of Induced Somatic Sector Analysis ISSA for Studying Genes and Promoters Involved in Wood Formation and Secondary Stem Development

استخدام المستحثة الجسدية التحليل القطاعي (ISSA) لدراسة الجينات والمروجين المشاركة في تشكيل الخشب والتنمية الجذعية الثانوية

Secondary stem growth in trees and associated wood formation are significant both from biological and commercial perspectives. However, relatively little ...

Rapid Deletion Production in Fungi via Agrobacterium Mediated Transformation of OSCAR Deletion Constructs

Rapid Deletion Production in Fungi via Agrobacterium Mediated Transformation of OSCAR Deletion Constructs

الإنتاج السريع في الفطريات عن طريق<em&gt; الأجرعية</em&gt; التحول بوساطة أوسكار حذف يبني

Precise deletion of gene(s) of interest, while leaving the rest of the genome unchanged, provides the ideal product to determine that particular ...

Assessment of DNA Contamination in RNA Samples Based on Ribosomal DNA

تقييم التلوث الحمض النووي في عينات الحمض النووي الريبي استناداً إلى ريبوسومال الحمض النووي

One method extensively used for the quantification of gene expression changes and transcript abundances is reverse-transcription quantitative real-time ...

Purification of High Molecular Weight Genomic DNA from Powdery Mildew for Long-Read Sequencing

تنقية عالية الوزن الجزيئي الحمض النووي الجينوم من البياض الدقيقي لونغ-مقروءة التسلسل

The powdery mildew fungi are a group of economically important fungal plant pathogens. Relatively little is known about the molecular biology and genetics ...

Optimization and Comparative Analysis of Plant Organellar DNA Enrichment Methods Suitable for Next-generation Sequencing

الأمثل والتحليل المقارن لطرق التخصيب الحمض النووي النباتي أورغانيلار مناسبة للجيل القادم التسلسل

Plant organellar genomes contain large, repetitive elements that may undergo pairing or recombination to form complex structures and/or sub-genomic ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

عزل الحمض النووي قوية وبناء مكتبة التسلسل الفائق للعينات دار النباتات

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

استكشاف ميكروبيومي الجذر: استخراج البيانات المجتمع البكتيرية من التربة، ورهيزوسفيري، واندوسفيري الجذر

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

Discrimintion and Mapping of the Primary and Processed Transcripts in Maize Mitochondrion Using a Circular RT-PCR-based Strategy

التمييز ورسم خرائط للنصوص الأولية والمجهزة في ميتوتشوندريون الذرة باستخدام استراتيجية دائرية تستند إلى RT-PCR

In plant mitochondria, some steady-state transcripts have 5&#39; triphosphate derived from transcription initiation (primary transcripts), while the ...