Name: plant growth and agrobacterium-mediated floral-dip transformation of the extremophyte schrenkiella parvula
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Plant Growth and Agrobacterium-mediated Floral-dip Transformation of the Extremophyte Schrenkiella parvula at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af en National Science Foundation award MCB 1616827.

1. planternes vækst
<ol><li>
Frø sterilisation (valgfri)
	<ol>
<li>Forberede 50% blegemiddel i dobbeltdestilleret vand (ddH2O) med 1 eller 2 dråber af en nonionisk detergent (Se Tabel af materialer) i en 50 mL tube. Vend røret flere gange for at blande opløsningen. Bemærk: Det er bedre at gennemføre frø sterilisation i en laminar flow kabinet med UV steriliseret overflade i 15 min.</li>
		<li>Tilføj blegemiddelopløsning at ~ 100 – 200 S. p...

<ol>
	<li>Dassanayake, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+of+the+extremophile+crucifer+Thellungiella+parvula.">The genome of the extremophile crucifer Thellungiella parvula.</a> Nature Genetics. 43 (9), 913-918 (2011).</li><li>Oh, D. -. H., Dassanayake, M., Bohnert, H. J., Cheeseman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+at+the+extreme:+lessons+from+the+genome.">Life at the extreme: lessons from the genome.</a> Genome Biology. 13 (3), 241 (2012).</li><li>Whited, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Next+Top+Models.">The Next Top Models.</a> Cell. 163 (1), 18-20 (2015).</li><li>Dassanayake, M., Yun, D. O. D., Bressan, R. A., Cheeseman, J. M., Bohnert, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+scope+of+things+to+come:+New+paradigms+in+biotechnology.">The scope of things to come: New paradigms in biotechnology.</a> Plant Biotechnology and Agriculture: Prospects for the 21st Century. , 19-34 (2009).</li><li>Dittami, S. M., Tonon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomes+of+extremophile+crucifers:+New+platforms+for+comparative+genomics+and+beyond.">Genomes of extremophile crucifers: New platforms for comparative genomics and beyond.</a> Genome Biology. 13 (8), 166 (2012).</li><li>Amtmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Learning+from+evolution:+Thellungiella+generates+new+knowledge+on+essential+and+critical+components+of+abiotic+stress+tolerance+in+plants.">Learning from evolution: Thellungiella generates new knowledge on essential and critical components of abiotic stress tolerance in plants.</a> Molecular Plant. 2 (1), 3-12 (2009).</li><li>Oh, D. -. H., Hong, H., Lee, S. Y., Yun, D. -. J., Bohnert, H. J., Dassanayake, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+structures+and+transcriptomes+signify+niche+adaptation+for+the+multiple-ion-tolerant+extremophyte+Schrenkiella+parvula.">Genome structures and transcriptomes signify niche adaptation for the multiple-ion-tolerant extremophyte Schrenkiella parvula.</a> Plant Physiology. 164 (4), 2123-2138 (2014).</li><li>Orsini, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+salt+tolerance+parameters+in+11+wild+relatives+of+Arabidopsis+thaliana.">A comparative study of salt tolerance parameters in 11 wild relatives of Arabidopsis thaliana.</a> Journal of Experimental Botany. 61 (13), 3787-3798 (2010).</li><li>Uzilday, B., Ozgur, R., Sekmen, A. H., Yildiztugay, E., Turkan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+alternative+electron+sinks+and+antioxidant+defence+in+chloroplasts+of+the+extreme+halophyte+Eutrema+parvulum+(Thellungiella+parvula)+under+salinity.">Changes in the alternative electron sinks and antioxidant defence in chloroplasts of the extreme halophyte Eutrema parvulum (Thellungiella parvula) under salinity.</a> Annals of Botany. 115 (3), 449-463 (2015).</li><li>Teusink, R. S., Rahman, M., Bressan, R. A., Jenks, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cuticular+waxes+on+Arabidopsis+thaliana+close+relatives+Thellungiella+halophila+and+Thellungiella+parvula.">Cuticular waxes on Arabidopsis thaliana close relatives Thellungiella halophila and Thellungiella parvula.</a> International Journal of Plant Sciences. 163 (2), 309-315 (2002).</li><li>Jarvis, D. E., Ryu, C. H., Beilstein, M. A., Schumaker, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+for+SOS1+in+the+convergent+evolution+of+salt+tolerance+in+Eutrema+salsugineum+and+Schrenkiella+parvula.">Distinct roles for SOS1 in the convergent evolution of salt tolerance in Eutrema salsugineum and Schrenkiella parvula.</a> Molecular Biology and Evolution. 31 (8), 2094-2107 (2014).</li><li>Clough, S. J., Bent, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Floral+dip:+A+simplified+method+for+Agrobacterium-mediated+transformation+of+Arabidopsis+thaliana.">Floral dip: A simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.</a> Plant Journal. 16 (6), 735-743 (1998).</li><li>Koornneef, M., Meinke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+Arabidopsis+as+a+model+plant.">The development of Arabidopsis as a model plant.</a> Plant Journal. 61 (6), 909-921 (2010).</li><li>Bai, J., Wu, F., Mao, Y., He, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+planta+transformation+of+Brassica+rapa+and+B.+napus+via+vernalization-infiltration+methods.">In planta transformation of Brassica rapa and B. napus via vernalization-infiltration methods.</a> Protocol Exchange. 10, 1028 (2013).</li><li>Sparrow, P. A. C., Goldsack, C. M. P., &#216;stergaard, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+technology+in+the+Brassicaceae.">Transformation technology in the Brassicaceae.</a> Genetics and Genomics of the Brassicaceae. , 505-525 (2011).</li><li>Hoagland, D. R., Arnon, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+water-culture+method+for+growing+plants+without+soil.">The water-culture method for growing plants without soil.</a> California Agricultural Experiment Station Circular. 347 (347), 1-32 (1950).</li><li>Saiki, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer-directed+enzymatic+amplification+of+DNA+with+a+thermostable+DNA+polymerase.">Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase.</a> Science. 239 (4839), 487-491 (1988).</li><li>Sun, Y., Sriramajayam, K., Luo, D., Liao, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Quick,+cost-free+method+of+purification+of+dna+fragments+from+agarose+gel.">A Quick, cost-free method of purification of dna fragments from agarose gel.</a> Journal of Cancer. 3, 93-95 (2012).</li><li>Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+sequencing+with+chain-terminating+inhibitors.">DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12), 5463-5467 (1977).</li><li>Bertani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+Lysogenesis+I.+The+mode+of+phage+liberation+by+lysogenic+Eschericia+coli.">Studies on Lysogenesis I. The mode of phage liberation by lysogenic Eschericia coli.</a> Journal of Bacteriolgy. 62 (3), 293-300 (1951).</li><li>Koncz, C., Martini, N., Szabados, L., Hrouda, M., Bachmair, A., Schell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specialized+vectors+for+gene+tagging+and+expression+studies.">Specialized vectors for gene tagging and expression studies.</a> Plant Molecular Biology Manual. , 53-74 (1994).</li><li>Weigel, D., Glazebrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+Agrobacterium+using+electroporation.">Transformation of Agrobacterium using electroporation.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (30), (2006).</li><li>Murray, M. G., Thompson, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+high+molecular+weight+plant+DNA.">Rapid isolation of high molecular weight plant DNA.</a> Nucleic Acids Research. 8 (19), 4321-4326 (1980).</li><li>Inan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salt+cress.+a+halophyte+and+cryophyte+Arabidopsis+relative+model+system+and+its+applicability+to+molecular+genetic+analyses+of+growth+and+development+of+extremophiles.">Salt cress. a halophyte and cryophyte Arabidopsis relative model system and its applicability to molecular genetic analyses of growth and development of extremophiles.</a> Plant Physiol. 135 (3), 1718-1737 (2004).</li><li>Ghedira, R., De Buck, S., Nolf, J., Depicker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+efficiency+of+Arabidopsis+thaliana+floral+dip+transformation+is+determined+not+only+by+the+Agrobacterium+strain+used+but+also+by+the+physiology+and+the+ecotype+of+the+dipped+plant.">The efficiency of Arabidopsis thaliana floral dip transformation is determined not only by the Agrobacterium strain used but also by the physiology and the ecotype of the dipped plant.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 26 (7), 823-832 (2013).</li><li>Shaohong, F. U., Xianya, W. E. I., Yingze, N. I. U., Shixing, G. U. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+Brassica+napus+with+the+method+of+floral-dip.">Transformation of Brassica napus with the method of floral-dip.</a> Biotechnology: Genomics and Its Applications. , 45-49 (2005).</li><li>Li, J., Tan, X., Zhu, F., Guo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+simple+method+for+Brassica+napus+floral-dip+transformation+and+selection+of+transgenic+plantlets.">A rapid and simple method for Brassica napus floral-dip transformation and selection of transgenic plantlets.</a> International Journal of Biology. 2 (1), 127 (2010).</li><li>Li, H. Q., Xu, J., Chen, L., Li, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+an+efficient+Agrobacterium+tumefaciens-mediated+leaf+disc+transformation+of+Thellungiella+halophila.">Establishment of an efficient Agrobacterium tumefaciens-mediated leaf disc transformation of Thellungiella halophila.</a> Plant Cell Reports. 26 (10), 1785-1789 (2007).</li><li>Wu, G., Rossidivito, G., Hu, T., Berlyand, Y., Poethig, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traffic+lines:+New+tools+for+genetic+analysis+in+Arabidopsis+thaliana.">Traffic lines: New tools for genetic analysis in Arabidopsis thaliana.</a> Genetics. 200 (1), 35-45 (2015).</li></ol>

Plantens fysiologiske tilstand væsentligt påvirker effektiviteten af transformation25. Brug af sund og energisk planter til transformation er et centralt krav for vellykket transformation i S. parvula. Vand eller lys stresset planter vil have færre blomster i forhold til de sunde planter ideelt for transformation (figur 1, center panel). S. parvula kan vokse ved en let intensitet mindre end 130 µmol m-2 s-1, men planter har ...

I denne protokol beskrive vi den vækst og etablering af stabile transgene linjer for extremophyte modellen Schrenkiella parvula. Tilgængeligheden af en effektiv transformation system er kendetegnende for nogen alsidig genetiske model. Planter, der trives i ekstreme miljøer, nævnt som extremophytes, give en afgørende ressource for at forstå plante tilpasning af miljøbelastninger. Schrenkiella parvula (tidligere Thellungiella parvula og Eutrema parvulum) er en sådan extremophyte model, med ekspanderende genomiske ressourcer1,2,3,4,5. Men, transformation protokoller har ikke endnu blevet rapporteret til S. parvula i offentliggjorte undersøgelser.
Genomet af S. parvula er den første offentliggjorte extremophyte genom i Brassicaceae (sennep-kål familie) og viser en omfattende samlede genom synteny med ikke-extremophyte model, Arabidopsis thaliana1. Således, sammenlignende undersøgelser mellem A. thaliana og S. parvula kunne drage nytte af rigdommen af genetiske undersøgelser udført på A. thaliana at gøre informative hypoteser om, hvordan S. parvula genomet har udviklet sig og reguleret anderledes for at håndtere understreger ekstreme miljømæssige5,6,7. S. parvula er en af de mest salt-tolerant arter (baseret på jord NaCl LD50) blandt kendte vilde slægtninge af A. thaliana8. Udover NaCl tolerance, S. parvula overlever og fuldender dens livscyklus i overværelse af flere salt ioner i høje koncentrationer giftige for de fleste planter7. Svar på de abiotiske påvirkninger, den fremherskende i dens naturlige habitat, den har udviklet sig forskellige karaktertræk, hvoraf flere er blevet undersøgt på de biokemiske eller fysiologiske niveau 8,9,10, 11.
Siden 2010, har der været over 400 peer-reveiwed publikationer, der bruges S. parvula som målart eller bruges det i en sammenligning med andre plante genomer. Imidlertid kunne en klar flaskehals identificeres med et nærmere kig på hvilken type undersøgelser er blevet gennemført. Fleste af disse rapporter drøfte den potentielle anvendelse af S. parvula i fremtidige undersøgelser eller bruge det i komparativ genomisk eller phylogenomic studier. På grund af manglende en proof of concept transformation protokol etableret for S. parvula, det ikke har været brugt i funktionelle genomisk undersøgelser, selv om de har en af de højeste kvalitet plante genomer rådighed til dato (> 5 Mb contig N50) samlet og kommenteret i kromosom-niveau pseudomolecules1.
Agrobacterium-medieret blomster-dip transformation metode er blevet den mest bredt anvendte metode til at oprette trasngenic linjer i A. thaliana, og udviklingen af en reproducerbar system af transformation var en kritisk faktor for dens succes som en genetiske model12,13. Dog har ikke alle Brassicaceae arter vist sig at omsættes med succes ved hjælp af metoden blomster-dip udviklet til A. thaliana. Specielt, har arternes Brassicaceae Lineage II, der omfatter S. parvula været genstridige til blomster-dip baseret transformation metoder14,15.
Ubestemt blomstrende vækst vane af S. parvula, kombineret med dens smalle blad morfologi har gjort det udfordrende at vedtage standard Agrobacterium-medieret blomster-dip transformation metode. I denne undersøgelse rapport vi den ændrede protokol, vi har udviklet for reproducerbare transformation af S. parvula.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1303px;" width="1302">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Agar</td>
			<td style="width:293px;">VWR International, Radnor, PA</td>
			<td style="width:127px;">90000-762</td>
			<td style="width:541px;">Bacto Agar Soldifying Agent, BD Diagnostics</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B5 vitamins</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>G1019</td>
			<td>Gamborg&#8217;s Vitamin Solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Desiccant</td>
			<td>W A Hammond Drierite, Xenia, OH</td>
			<td style="width:127px;">22005</td>
			<td>Indicating DRIERITE 6 mesh</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:341px;">Destination vector for plant transformation</td>
			<td>TAIR</td>
			<td style="width:127px;">Vector:6531113857</td>
			<td>pKGWFS7</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Electroporation cuvette</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>9104-5050</td>
			<td>Electroporation cuvette, round cap, 0.2 cm gap</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Electroporator</td>
			<td>BIO-RAD Laboratories, Hercules, CA</td>
			<td>1652100</td>
			<td>MicroPulser Electroporator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fertilizer beads</td>
			<td>Osmocote Garden, Marysville, OH</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Osmocote Smart-Release Plant Food&#160;Flower &#38; Vegetable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gel extraction kit</td>
			<td>iNtRON Biotechnology, Boston, MA</td>
			<td>17289</td>
			<td>MEGAquick-spin Total fragment DNA purification kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gentamicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>G1914-5G</td>
			<td>Gentamicin sulfate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Glufosinate-ammonium (11.3%) herbicide (BASTA)</td>
			<td>Bayer environmental science, Montvale, NJ</td>
			<td>N/A</td>
			<td>FINALE herbicide</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kanamycin</td>
			<td>VWR International, Radnor, PA</td>
			<td>200004-444</td>
			<td>Kanamycin monosulfate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MES</td>
			<td>Bioworld, Dublin, OH</td>
			<td>41320024-2</td>
			<td>MES, Free Acid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MS salt</td>
			<td>MP Biomedicals, Santa Anna, CA</td>
			<td>092621822</td>
			<td>Hoagland&#39;s modified basal salt mixture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N6-benzylaminopurine (BA)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>B3274</td>
			<td>6-Benzylaminopurine solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td>Sigma-Alrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>Sodium chloride</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Non-ionic detergent</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td>TWEEN 20&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Plasmid isolation kit</td>
			<td>Zymo Research, Irvine, CA</td>
			<td>D4036</td>
			<td>Zyppy Plasmid Kits</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinase enzyme mix kit</td>
			<td>Life Technology</td>
			<td>11791-020</td>
			<td>Gateway LR Clonase II Enzyme mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rifampicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>R3501-1G</td>
			<td>Rifampicin, powder, &#62;= 97% (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Shaking incubator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>SHKE4450</td>
			<td>MaxQ 4450 Benchtop Orbital Shakers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Soil mix</td>
			<td>Sun Gro</td>
			<td>SUN239223328CFLP</td>
			<td>Sun Gro Metro-Mix 360 Grower Mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spectinomycin</td>
			<td>VWR International, Radnor, PA</td>
			<td>IC15206705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile 50ml conical tubes</td>
			<td>USA Scientific, Ocala, FL</td>
			<td>1500-1811</td>
			<td>50 ml conical screw cap tubes, copolymer, racks, sterile</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sucrose</td>
			<td>VWR International, Radnor, PA</td>
			<td>57-50-1</td>
			<td>Sucrose, ACS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Surfactant solution</td>
			<td>Lehle seeds, Round Rock, TX</td>
			<td>VIS-02</td>
			<td>Silwet L-77</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Topoisomerase-based cloning kit</td>
			<td>Life Technologies, Carlsbad, CA</td>
			<td>K240020</td>
			<td>pENTR/D-TOPO Cloning Kit, with One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tryptone</td>
			<td>VWR International, Radnor, PA</td>
			<td>90000-282</td>
			<td>BD Bacto Tryptone, BD Biosciences</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast Extract</td>
			<td>VWR International, Radnor, PA</td>
			<td>90000-722&#160;</td>
			<td>BD Bacto Yeast Extract, BD Biosciences</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

plant growth and agrobacterium-mediated floral-dip transformation of the extremophyte schrenkiella parvula

Schrenkiella parvula er en extremophyte tilpasses forskellige abiotiske understreger, herunder flere ion toksicitet understreger. Trods høj kvalitet genomiske ressourcer til rådighed til at studere, hvordan planter tilpasse sig miljø understreger, dets værdi som en funktionel genomforskning model og værktøj har været begrænset af manglen på en gennemførlig transformation system. I denne protokol, rapporterer vi hvordan man kan generere stabile transgene S. parvula linjer ved hjælp af en Agrobacterium-medieret blomster-dip metode. Vi ændrede transformation protokollen anvendes til A. thaliana redegøre for unikke træk ved S. parvula, som en ubestemt blomstring vane og en høj epicuticular voks indhold på bladene. Kort, S. parvula frø blev stratificeret ved 4 ° C i fem dage før plantning. Planterne blev dyrket på en lysperiode en 14 h lys og 10 h mørke og en 130 µmol m-2s-1 lysintensitet, ved 22 ° C til 24 ° C. Otte til ni uger gamle planter med flere blomsterstande blev udvalgt til transformation. Disse blomsterstande var dyppet i en infiltration løsning af Agrobacterium tumefaciens GV3101 transporterer pMP90RK plasmid. Vi udførte to runder af blomst dypning med et interval på tre til fire uger at øge transformation effektivitet. T1 frø blev indsamlet og tørret i fire uger i en beholder med desiccants før spiringen at screene for kandidat omdannet linjer. Modstand til BASTA blev anvendt til at screene T1 planter. Vi sprøjtede BASTA løsning tre gange med et interval på tre dage starter på to uger gamle planter at mindske falske positiver. En BASTA drop test blev udført på overlevende enkelte planter til at identificere sande positive transformants. Transformation effektivitet var 0.033%, hvilket giver 3 – 4 transgene planter pr. 10.000 T1 frø opformeret.

Vi udviklede en transformation protokol, der giver mulighed for høst af T0 frøene 150 dage, en metoden blomster-dip er ændret fra at for A. thaliana. Figur 1 viser en oversigt over tidslinjen og S. parvula planter, der repræsenterer den optimale fase for udførelsen transformation gennem blomster-dip. Vi valgte S. parvula planter med 70 –80 blomster i flere blomsterstande 60 – 80 dage efter spiring som target scen...

Watch this Scientific Journal Video about Plant Growth and Agrobacterium-mediated Floral-dip Transformation of the Extremophyte Schrenkiella parvula at JoVE.com

Plant Growth and Agrobacterium-mediated Floral-dip Transformation of the Extremophyte Schrenkiella parvula

Plant vækst og Agrobacterium-medieret Floral-dip Transformation af Extremophyte Schrenkiella parvula

Agrobacterium-medieret transformation ved hjælp af en blomster-dip metode kan anvendes med succes at skabe stabile transgene linjer af extremophyte model Schrenkiella parvula. Vi præsenterer en protokol, der er ændret fra at for Arabidopsis thaliana, overvejer forskellige vækst vaner og fysiologiske egenskaber af extremophyte.

Schrenkiella parvula is an extremophyte adapted to various abiotic stresses, including multiple ion toxicity stresses. Despite high-quality genomic ...

Denne metode, en reproducerbar transformationsprotokol for Schrenkiella parvula, kan hjælpe med at besvare spørgsmål inden for planteparativ og funktionel genoming, især undersøgelser, der undersøger plantetilpasninger til barske miljøer. Denne teknik muliggør undersøgelser af rutinemæssige funktioner i Schrenkiella parvula på extremophyte tilpasset multi-ion salt belastninger. Det giver også mulighed for sammenlignende undersøgelser, som også ser på sin nære slægtning, moderen forælder Aribidopsis Thaliana.Sammenligning af Schrenkiella Parvula med Aribidopsis Thaliana kan give indsigt i afvigelser i genregulering og -funktion, der muliggør unik tilpasning af Schrenkiella parvula. Transformationsprotokollen for Arabidopsis Thaliana er allerede veletableret. Metoden muliggør nu sammenlignende undersøgelser med transgene Schrenkiella Parvula-planter.Generelt forskere nye til denne metode vil kæmpe på grund af blomstring vane og bladet morfologi Schrenkiella Parvula planter, der gør effektiv transformation ved hjælp af en flora dip samt udvælgelsen af sande transformanter vanskeligt. Til at begynde, bruge en våd tandstikker til at overføre omkring 20 til 25 S.Parvula frø på våd jord. Derefter stratificere frøene ved fire grader celsius i fem til syv dage.Efter stratificering, returnere frøene til vækstkammeret i syv til 10 dage. Når alle planter har spiret, lad kun én kimplante i hver af de fire hjørner og i midten af potterne. Dyrk planterne i otte til 10 uger i vækstkammeret, indtil de blomstrer.På transformationsdagen skal du vælge S.Parvula-planter i henhold til tekstprotokollen. Brug snørebånd og små saks til at fjerne eventuelle besvingede blomsterstande, der allerede udvikler sig til siliques. Når planterne er klar, forberede en agrobacterium infiltration løsning.Derefter dyppes S.Parvula-blomsterstanden i agrobacteriuminfiltrationsopløsning i 20 sekunder. Vist her er den tidligste fase af de planter, der kan bruges til transformation, så længe allerede udviklede siliques fjernes før transformation, ældre planter med flere blomster kan bruges. Efter omdannelsen, sted blomst dyppet planter vandret i rene bakker med kupler til at dække planterne.Derefter placere planterne i en mørk vækst rum i en til to dage. Returner planterne til en oprejst position og overføre dem til vækstrummet. I den følgende uge, overvåge dyppet blomsterstande.Ti dage efter den første blomsterdukker vil S.Parvula planter fortsætte med at producere nye blomsterstande og siliques. En anden runde af blomster dip kan udføres for yderligere at omdanne de nye blomsterstande. Dyrk planterne, indtil frøene modnes, og høst frøene omkring 21 uger.Tør frøene i to til tre uger ved stuetemperatur i en lufttæt beholder fyldt med tørremidler. Plant T en frø i henhold til teksten protokol. Dyrk planterne, indtil de første to til tre sande blade udvikle.For at udføre det første valg for herbicid modstand, fortyndes glufosinat ammonium herbicid og spray det på planterne. Dæk planterne med kuplerne natten over. Sæt bakkerne tilbage til vækstrummet, og fjern kuplen.Vent, indtil de fleste af de planter er udvalgt ud af herbicid. For at begynde det andet valg skal du identificere de planter, der overlever efter at være blevet sprøjtet tre til fire gange med BASTA-løsningen. Efter dyrkning af planterne i to til tre uger mere, skal du vælge den største modne blad på hver plante.Næste gnid overfladen af bladet forsigtigt med en finger for at fjerne voks lag. Anskaf derefter en dråbe af den fortyndede BASTA-opløsning på bladet. Hold øje med de blade, der er behandlet med BASTA-opløsningen, for tegn på visne i op til en uge.Endelig vælge planter med blade upåvirket af BASTA dråber til yderligere analyse. I denne protokol blev S.Parvula omdannet med agrobacterium ved hjælp af en blomsterdip metode. Infektion med agrobacterium resulterede i abort af nogle blomster.Men S.Parvula planterne fortsatte med at producere nye blomster efter den første blomst dypning, og kunne omdannes igen. Ved hjælp af BASTA spray og drop test, kan ægte positive transformanter præcist identificeres. Antallet af prøver, der er testet ved hjælp af PCR-bekræftelse, kan reduceres.Mens denne metode svarer til omdannelsen af Arabidopsis Thaliana, er det vigtigt at huske forskellene i vækst og morfologi af Schrenkiella Parvula. Ændring af protokollen, så den afspejler disse forskelle, er afgørende for en vellykket transformation. Denne teknik kan hjælpe forskere med at udforske udviklingen af genomiske variationer, der fører til flere salt stress tilpasninger i extremophyte model, Schrenkiella Parvula.Ved at kombinere denne teknik med oplysninger om Aradopsis Thalianas funktioner, en anden plante nært beslægtet med Schrenkiella Parvula. Forskere kan studere variationer i forordningen og funktioner, at disse er to forskellige strukturer mellem disse to arter. Under transformationsprocessen er det vigtigt at indeholde alle agrobacterium infiltrationsopløsningen i autoklavelige beholdere.Sterilisere og sikkert kassere alle de materialer, der kom i kontakt med agrobacterium herunder handsker, makro pipette tips, og papirhåndklæder.

Research

JoVE Journal

Genetics

Plant Growth and Agrobacterium-mediated Floral-dip Transformation of the Extremophyte Schrenkiella parvula

A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation

En robot platform for High-throughput protoplastisolering og Transformation

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal ...

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Genetisk Manipulation af afgroedesygdomme<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; At studere Fungal Biology og Plant Microbe Interactions

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

The Use of Induced Somatic Sector Analysis (ISSA) for Studying Genes and Promoters Involved in Wood Formation and Secondary Stem Development

The Use of Induced Somatic Sector Analysis ISSA for Studying Genes and Promoters Involved in Wood Formation and Secondary Stem Development

Brug af induceret Somatisk Sector Analysis (ISSA) for at studere Gener og Initiativtagere involveret i Wood Formation og Sekundær Stem Development

Secondary stem growth in trees and associated wood formation are significant both from biological and commercial perspectives. However, relatively little ...

Rapid Deletion Production in Fungi via Agrobacterium Mediated Transformation of OSCAR Deletion Constructs

Rapid Deletion Production in Fungi via Agrobacterium Mediated Transformation of OSCAR Deletion Constructs

Hurtig sletningsproduktion i svampe via<em&gt; Agrobacterium</em&gt; Medieret transformation af OSCAR-sletningskonstruktioner

Precise deletion of gene(s) of interest, while leaving the rest of the genome unchanged, provides the ideal product to determine that particular ...

Assessment of DNA Contamination in RNA Samples Based on Ribosomal DNA

Vurdering af DNA forurening i RNA prøver baseret på ribosomale DNA

One method extensively used for the quantification of gene expression changes and transcript abundances is reverse-transcription quantitative real-time ...

Purification of High Molecular Weight Genomic DNA from Powdery Mildew for Long-Read Sequencing

Rensning af High Molecular Weight Genomisk DNA fra meldug for lang Læs sekventering

The powdery mildew fungi are a group of economically important fungal plant pathogens. Relatively little is known about the molecular biology and genetics ...

Optimization and Comparative Analysis of Plant Organellar DNA Enrichment Methods Suitable for Next-generation Sequencing

Optimering og sammenligningsanalyse af planteorganell DNA-berigelsesmetoder egnet til næste generations sekventering

Plant organellar genomes contain large, repetitive elements that may undergo pairing or recombination to form complex structures and/or sub-genomic ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Robust DNA isoleret og høj overførselshastighed sekventering bibliotek konstruktion til Herbarium prøver

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

At udforske Root Microbiome: udtrække bakteriel Fællesskabets Data fra jord, rhizosfære og rod Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

Discrimintion and Mapping of the Primary and Processed Transcripts in Maize Mitochondrion Using a Circular RT-PCR-based Strategy

Diskrimination og kortlægning af primære og forarbejdede transskriptioner i majs mitokondrier ved hjælp af en cirkulær RT-PCR-baseret strategi

In plant mitochondria, some steady-state transcripts have 5&#39; triphosphate derived from transcription initiation (primary transcripts), while the ...