Name: plant growth and agrobacterium-mediated floral-dip transformation of the extremophyte schrenkiella parvula
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
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1. la croissance des plantes
<ol><li>
Stérilisation des semences (facultative)
	<ol>
<li>Préparer 50 % eau de Javel dans l’eau bidistillée (ddH2O) avec 1 ou 2 gouttes d’un détergent non ionique (voir Table des matières) dans un tube de 50 mL. Inverser le tube plusieurs fois pour mélanger la solution. Remarque : Il est préférable de procéder à la stérilisation des semences dans un flux laminaire avec une surface stérilisée UV pendant 15 m...

<ol>
	<li>Dassanayake, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+of+the+extremophile+crucifer+Thellungiella+parvula.">The genome of the extremophile crucifer Thellungiella parvula.</a> Nature Genetics. 43 (9), 913-918 (2011).</li><li>Oh, D. -. H., Dassanayake, M., Bohnert, H. J., Cheeseman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+at+the+extreme:+lessons+from+the+genome.">Life at the extreme: lessons from the genome.</a> Genome Biology. 13 (3), 241 (2012).</li><li>Whited, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Next+Top+Models.">The Next Top Models.</a> Cell. 163 (1), 18-20 (2015).</li><li>Dassanayake, M., Yun, D. O. D., Bressan, R. A., Cheeseman, J. M., Bohnert, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+scope+of+things+to+come:+New+paradigms+in+biotechnology.">The scope of things to come: New paradigms in biotechnology.</a> Plant Biotechnology and Agriculture: Prospects for the 21st Century. , 19-34 (2009).</li><li>Dittami, S. M., Tonon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomes+of+extremophile+crucifers:+New+platforms+for+comparative+genomics+and+beyond.">Genomes of extremophile crucifers: New platforms for comparative genomics and beyond.</a> Genome Biology. 13 (8), 166 (2012).</li><li>Amtmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Learning+from+evolution:+Thellungiella+generates+new+knowledge+on+essential+and+critical+components+of+abiotic+stress+tolerance+in+plants.">Learning from evolution: Thellungiella generates new knowledge on essential and critical components of abiotic stress tolerance in plants.</a> Molecular Plant. 2 (1), 3-12 (2009).</li><li>Oh, D. -. H., Hong, H., Lee, S. Y., Yun, D. -. J., Bohnert, H. J., Dassanayake, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+structures+and+transcriptomes+signify+niche+adaptation+for+the+multiple-ion-tolerant+extremophyte+Schrenkiella+parvula.">Genome structures and transcriptomes signify niche adaptation for the multiple-ion-tolerant extremophyte Schrenkiella parvula.</a> Plant Physiology. 164 (4), 2123-2138 (2014).</li><li>Orsini, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+salt+tolerance+parameters+in+11+wild+relatives+of+Arabidopsis+thaliana.">A comparative study of salt tolerance parameters in 11 wild relatives of Arabidopsis thaliana.</a> Journal of Experimental Botany. 61 (13), 3787-3798 (2010).</li><li>Uzilday, B., Ozgur, R., Sekmen, A. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Quick,+cost-free+method+of+purification+of+dna+fragments+from+agarose+gel.">A Quick, cost-free method of purification of dna fragments from agarose gel.</a> Journal of Cancer. 3, 93-95 (2012).</li><li>Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. 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The mode of phage liberation by lysogenic Eschericia coli.</a> Journal of Bacteriolgy. 62 (3), 293-300 (1951).</li><li>Koncz, C., Martini, N., Szabados, L., Hrouda, M., Bachmair, A., Schell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specialized+vectors+for+gene+tagging+and+expression+studies.">Specialized vectors for gene tagging and expression studies.</a> Plant Molecular Biology Manual. , 53-74 (1994).</li><li>Weigel, D., Glazebrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+Agrobacterium+using+electroporation.">Transformation of Agrobacterium using electroporation.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (30), (2006).</li><li>Murray, M. G., Thompson, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+high+molecular+weight+plant+DNA.">Rapid isolation of high molecular weight plant DNA.</a> Nucleic Acids Research. 8 (19), 4321-4326 (1980).</li><li>Inan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salt+cress.+a+halophyte+and+cryophyte+Arabidopsis+relative+model+system+and+its+applicability+to+molecular+genetic+analyses+of+growth+and+development+of+extremophiles.">Salt cress. a halophyte and cryophyte Arabidopsis relative model system and its applicability to molecular genetic analyses of growth and development of extremophiles.</a> Plant Physiol. 135 (3), 1718-1737 (2004).</li><li>Ghedira, R., De Buck, S., Nolf, J., Depicker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+efficiency+of+Arabidopsis+thaliana+floral+dip+transformation+is+determined+not+only+by+the+Agrobacterium+strain+used+but+also+by+the+physiology+and+the+ecotype+of+the+dipped+plant.">The efficiency of Arabidopsis thaliana floral dip transformation is determined not only by the Agrobacterium strain used but also by the physiology and the ecotype of the dipped plant.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 26 (7), 823-832 (2013).</li><li>Shaohong, F. U., Xianya, W. E. I., Yingze, N. I. U., Shixing, G. U. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+Brassica+napus+with+the+method+of+floral-dip.">Transformation of Brassica napus with the method of floral-dip.</a> Biotechnology: Genomics and Its Applications. , 45-49 (2005).</li><li>Li, J., Tan, X., Zhu, F., Guo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+simple+method+for+Brassica+napus+floral-dip+transformation+and+selection+of+transgenic+plantlets.">A rapid and simple method for Brassica napus floral-dip transformation and selection of transgenic plantlets.</a> International Journal of Biology. 2 (1), 127 (2010).</li><li>Li, H. Q., Xu, J., Chen, L., Li, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+an+efficient+Agrobacterium+tumefaciens-mediated+leaf+disc+transformation+of+Thellungiella+halophila.">Establishment of an efficient Agrobacterium tumefaciens-mediated leaf disc transformation of Thellungiella halophila.</a> Plant Cell Reports. 26 (10), 1785-1789 (2007).</li><li>Wu, G., Rossidivito, G., Hu, T., Berlyand, Y., Poethig, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traffic+lines:+New+tools+for+genetic+analysis+in+Arabidopsis+thaliana.">Traffic lines: New tools for genetic analysis in Arabidopsis thaliana.</a> Genetics. 200 (1), 35-45 (2015).</li></ol>

L’état physiologique de la plante influence significativement l’efficacité de transformation25. L’utilisation de plants sains et vigoureux pour transformation est une condition essentielle pour la réussite de la transformation en S. parvula. L’eau ou lumière des plantes stressées auront moins de fleurs par rapport à l’idéal de transformation (Figure 1, panneau central) des plantes saines. S. parvula peuvent pousser à une intensité ...

Dans ce protocole, nous décrivons la croissance et la création de lignées transgéniques stables pour le modèle extremophyte Schrenkiella parvula. La disponibilité d’un système efficace de transformation est une caractéristique de n’importe quel modèle génétique polyvalent. Plantes qui se développent dans des environnements extrêmes, mentionné comme extremophytes, fournissent une ressource cruciale pour comprendre les adaptations des plantes aux stress environnementaux. Schrenkiella parvula (anciennement Thellungiella parvula et Eutrema parvula) est un tel modèle extremophyte, avec l’expansion des ressources génomiques1,2,3,4,5. Toutefois, des protocoles de transformation n'ont pas encore été signalées pour S. parvula études publiées.
Le génome de S. parvula est le premier génome d’extremophyte publiés dans Brassicaceae (famille de la moutarde-chou) et montre une vaste synténie du génome globale avec le modèle non-extremophyte, Arabidopsis thaliana1. Ainsi, des études comparatives entre a. thaliana et S. parvula pourraient bénéficier de la richesse des études génétiques effectuées sur a. thaliana , faire des hypothèses informatives sur comment le génome de s. parvula a évolué et réglementé différemment pour faire face aux extrêmes environnementaux souligne5,6,7. S. parvula est une des espèces plus tolérantes au sel (basés sur sol NaCl LD50) parmi les parents sauvages connues d’a. thaliana8. En plus de la tolérance de NaCl, S. parvula survit et termine son cycle de vie en présence de plusieurs ions salins à de fortes concentrations de toxiques pour la plupart de plantes7. En réponse aux stress abiotiques dans son habitat naturel, il a évolué des traits différents, parmi lesquels plusieurs ont été étudiés à la biochimiques ou physiologiques niveau 8,9,10, 11.
Depuis 2010, ont été plus de 400 publications peer-reveiwed utilisé S. parvula comme espèce cible ou utilisèrent dans une comparaison avec d’autres génomes de plantes. Toutefois, un goulot d’étranglement clair pourrait être identifié avec un examen approfondi de ce type d’études ont été menées. La majorité de ces rapports discute l’utilisation potentielle de S. parvula dans de futures études ou l’utilise dans la génomique comparative ou études de phylogenomic. En raison de l’absence d’un protocole de validation de la transformation établie pour S. parvula, il n’a pas été utilisé dans les études de génomique fonctionnelles, malgré avoir un des plus hautes génomes de plantes de qualité disponibles à ce jour (> 5 Mo contig N50) assemblés et annoté en pseudomolécules au niveau du chromosome1.
La méthode de la transformation par Agrobacterium floral creux est devenue la méthode la plus largement utilisée pour créer des lignes de trasngenic dans Arabidopsis, et l’élaboration d’un système reproductible de transformation a été un facteur essentiel à son succès comme un modèle génétique12,13. Cependant, pas toutes les espèces de Brassicaceae ont démontré être transformée avec succès en utilisant la méthode floral creux mis au point pour a. thaliana. Spécialement, les espèces de Brassicaceae Lineage II qui incluent S. parvula a été récalcitrant à floral creux transformation fonction méthodes14,15.
L’habitude de croissance floraison pour une période indéterminée de S. parvula, combinée à sa morphologie de feuille étroite rend difficile d’adopter la méthode de transformation de floral creux standard par Agrobacterium. Dans cette étude, nous présentons le protocole modifié, que nous avons développé pour transformation reproductible de S. parvula.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1303px;" width="1302">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Agar</td>
			<td style="width:293px;">VWR International, Radnor, PA</td>
			<td style="width:127px;">90000-762</td>
			<td style="width:541px;">Bacto Agar Soldifying Agent, BD Diagnostics</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B5 vitamins</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>G1019</td>
			<td>Gamborg&#8217;s Vitamin Solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Desiccant</td>
			<td>W A Hammond Drierite, Xenia, OH</td>
			<td style="width:127px;">22005</td>
			<td>Indicating DRIERITE 6 mesh</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:341px;">Destination vector for plant transformation</td>
			<td>TAIR</td>
			<td style="width:127px;">Vector:6531113857</td>
			<td>pKGWFS7</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Electroporation cuvette</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>9104-5050</td>
			<td>Electroporation cuvette, round cap, 0.2 cm gap</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Electroporator</td>
			<td>BIO-RAD Laboratories, Hercules, CA</td>
			<td>1652100</td>
			<td>MicroPulser Electroporator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fertilizer beads</td>
			<td>Osmocote Garden, Marysville, OH</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Osmocote Smart-Release Plant Food&#160;Flower &#38; Vegetable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gel extraction kit</td>
			<td>iNtRON Biotechnology, Boston, MA</td>
			<td>17289</td>
			<td>MEGAquick-spin Total fragment DNA purification kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gentamicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>G1914-5G</td>
			<td>Gentamicin sulfate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Glufosinate-ammonium (11.3%) herbicide (BASTA)</td>
			<td>Bayer environmental science, Montvale, NJ</td>
			<td>N/A</td>
			<td>FINALE herbicide</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kanamycin</td>
			<td>VWR International, Radnor, PA</td>
			<td>200004-444</td>
			<td>Kanamycin monosulfate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MES</td>
			<td>Bioworld, Dublin, OH</td>
			<td>41320024-2</td>
			<td>MES, Free Acid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MS salt</td>
			<td>MP Biomedicals, Santa Anna, CA</td>
			<td>092621822</td>
			<td>Hoagland&#39;s modified basal salt mixture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N6-benzylaminopurine (BA)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>B3274</td>
			<td>6-Benzylaminopurine solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td>Sigma-Alrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>Sodium chloride</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Non-ionic detergent</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td>TWEEN 20&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Plasmid isolation kit</td>
			<td>Zymo Research, Irvine, CA</td>
			<td>D4036</td>
			<td>Zyppy Plasmid Kits</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinase enzyme mix kit</td>
			<td>Life Technology</td>
			<td>11791-020</td>
			<td>Gateway LR Clonase II Enzyme mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rifampicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>R3501-1G</td>
			<td>Rifampicin, powder, &#62;= 97% (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Shaking incubator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>SHKE4450</td>
			<td>MaxQ 4450 Benchtop Orbital Shakers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Soil mix</td>
			<td>Sun Gro</td>
			<td>SUN239223328CFLP</td>
			<td>Sun Gro Metro-Mix 360 Grower Mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spectinomycin</td>
			<td>VWR International, Radnor, PA</td>
			<td>IC15206705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile 50ml conical tubes</td>
			<td>USA Scientific, Ocala, FL</td>
			<td>1500-1811</td>
			<td>50 ml conical screw cap tubes, copolymer, racks, sterile</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sucrose</td>
			<td>VWR International, Radnor, PA</td>
			<td>57-50-1</td>
			<td>Sucrose, ACS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Surfactant solution</td>
			<td>Lehle seeds, Round Rock, TX</td>
			<td>VIS-02</td>
			<td>Silwet L-77</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Topoisomerase-based cloning kit</td>
			<td>Life Technologies, Carlsbad, CA</td>
			<td>K240020</td>
			<td>pENTR/D-TOPO Cloning Kit, with One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tryptone</td>
			<td>VWR International, Radnor, PA</td>
			<td>90000-282</td>
			<td>BD Bacto Tryptone, BD Biosciences</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast Extract</td>
			<td>VWR International, Radnor, PA</td>
			<td>90000-722&#160;</td>
			<td>BD Bacto Yeast Extract, BD Biosciences</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

plant growth and agrobacterium-mediated floral-dip transformation of the extremophyte schrenkiella parvula

Schrenkiella parvula est une extremophyte adaptée aux différents stress abiotiques, y compris les multiples contraintes de la toxicité d’ion. Malgré la qualité des ressources génomiques disponibles pour étudier comment les plantes s’adaptent à l’environnement souligne, sa valeur comme un modèle de génomique fonctionnelle et outil ont été limité par l’absence d’un système de transformation possible. Dans ce protocole, nous rapportons comment générer transgéniques stable S. parvula lignes en utilisant une méthode d’immersion à floral par Agrobacterium. Nous avons modifié le protocole de transformation utilisé pour a. thaliana pour tenir compte des caractéristiques uniques du S. parvula, comme une habitude de floraison pour une période indéterminée et une teneur en cires épicuticulaire élevé sur les feuilles. En bref, S. parvula graines ont été stratifiées à 4 ° C pendant cinq jours avant la plantation. Les plantes ont été cultivées à une photopériode d’une lumière de 14 h et 10 h d’obscurité et une 130 µmol m-2s-1 intensité lumineuse, à 22 ° C à 24 ° C. Huit à neuf semaines plantes avec plusieurs inflorescences ont été sélectionnés pour la transformation. Ces inflorescences sont trempés dans une solution d’infiltration d’Agrobacterium tumefaciens GV3101 portant le plasmide pMP90RK . Nous avons effectué deux séries de fleur plongeant avec un intervalle de trois à quatre semaines pour augmenter l’efficacité de la transformation. Les graines de T1 ont été recueillies et séchées pendant quatre semaines dans un récipient avec gel de silice avant la germination pour dépister le candidat transformé lignes. Résistance aux BASTA a été utilisée pour dépister les plantes T1. Nous avons pulvérisé la solution BASTA trois fois avec un intervalle de trois jours à partir de deux semaines centrales pour réduire les faux positifs. Une épreuve de chute BASTA a été réalisée sur la survie des plantes individuelles afin d’identifier les vrais positifs transformants. L’efficacité de la transformation a été 0,033 %, ce qui donne des plantes transgéniques de 3 – 4 10 000 graines T1 propagées.

Nous avons développé un protocole de transformation qui permet la récolte de graines0 T dans les 150 jours suivant, en utilisant une méthode d’immersion à floral modifiée de celle d’a. thaliana. La figure 1 montre un résumé de la chronologie et les plantes de S. parvula qui représentent le stade optimal pour l’exécution de la transformation par le biais de floral-dip. Nous avons choisi S. parvula plantes a...

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Plant Growth and Agrobacterium-mediated Floral-dip Transformation of the Extremophyte Schrenkiella parvula

Croissance des plantes et la Transformation par Agrobacterium Floral creux de la Extremophyte Schrenkiella parvula

La transformation par Agrobacterium en utilisant une méthode floral creux peut être employée avec succès pour créer des lignées transgéniques stables du modèle extremophyte Schrenkiella parvula. Nous présentons un protocole modifié de celui d' Arabidopsis thaliana, compte tenu des habitudes de croissance différent et les caractéristiques physiologiques de l’extremophyte.

Schrenkiella parvula is an extremophyte adapted to various abiotic stresses, including multiple ion toxicity stresses. Despite high-quality genomic ...

Cette méthode, un protocole de transformation reproductible pour schrenkiella parvula, peut aider à répondre aux questions dans le domaine de la genoming comparative et fonctionnelle des plantes, en particulier les études sur les adaptations végétales à des environnements difficiles. Cette technique permet d’investigations des fonctions courantes dans la parvula de Schrenkiella sur l’extremophyte adapté aux contraintes de sel multi-ion. Il permet également des études comparatives qui examine également son proche parent, le parent mère Aribidopsis Thaliana.La comparaison de Schrenkiella Parvula avec Aribidopsis Thaliana peut donner un aperçu des variances dans la régulation et la fonction génétiques qui permettent l’adaptation unique de Schrenkiella parvula. Le protocole de transformation d’Arabidopsis Thaliana est déjà bien établi. La méthode permet maintenant des études comparatives à l’aide de plantes transgéniques Schrenkiella Parvula.En général, les chercheurs nouveaux à cette méthode auront du mal en raison de l’habitude de floraison et la morphologie des feuilles des plantes Schrenkiella Parvula qui rendent la transformation efficace à l’aide d’un plongeon de la flore ainsi que la sélection de véritables transformateurs difficiles. Pour commencer, utilisez un cure-dent humide pour transférer environ 20 à 25 graines de S.Parvula sur un sol humide. Ensuite, stratifier les graines à quatre degrés Celsius pendant cinq à sept jours.Après stratification, remettre les graines dans la chambre de croissance pendant sept à dix jours. Une fois que tous les semis ont germé, ne laisser qu’un seul semis dans chacun des quatre coins et au centre des pots. Faire pousser les plantes de huit à dix semaines dans la chambre de croissance jusqu’à ce qu’elles fleurissent.Le jour de la transformation, sélectionnez les plantes S.Parvula selon le protocole de texte. Utilisez des forceps et de petits ciseaux pour éliminer les inflorescences pollinisée qui se développent déjà en siliques. Une fois les plantes prêtes, préparez une solution d’infiltration d’agrobactéries.Après cela, tremper l’inflorescence de S.Parvula dans la solution d’infiltration d’agrobactéries pendant 20 secondes. Montré ici est la première étape des plantes qui peuvent être utilisés pour la transformation, aussi longtemps que les siliques déjà développés sont enlevés avant la transformation, les plantes plus anciennes avec plus de fleurs peuvent être utilisés. Après la transformation, placez les plantes trempées horizontalement dans des plateaux propres avec des dômes pour couvrir les plantes.Placez ensuite les plantes dans une pièce de croissance sombre pendant un à deux jours. Remettre les plantes en position verticale et les transférer dans la salle de croissance. La semaine suivante, surveillez les inflorescences trempées.Dix jours après la première trempette florale, les plantes S.Parvula continuent de produire de nouvelles inflorescences et siliques. Une deuxième série de trempette florale peut être effectuée pour transformer davantage les inflorescences émergentes. Faire pousser les plantes jusqu’à ce que les graines mûrissent et récolter les graines environ 21 semaines.Sécher les graines de deux à trois semaines à température ambiante dans un contenant hermétique rempli de dessiccants. Plantez les graines T one selon le protocole de texte. Faire pousser les plantes jusqu’à ce que les deux à trois premières vraies feuilles se développent.Pour effectuer la première sélection de résistance aux herbicides, diluer l’herbicide glufosinate ammonium et le pulvériser sur les semis. Couvrir les semis avec les dômes pendant la nuit. Remettre les plateaux à la salle de croissance et retirer le dôme.Attendez que la plupart des semis soient sélectionnés par l’herbicide. Pour commencer la deuxième sélection, identifiez les plantes qui survivent après avoir été pulvérisées trois à quatre fois avec la solution BASTA. Après avoir fait pousser les plantes pendant deux à trois semaines de plus, choisissez la plus grande feuille mature de chaque plante.Frottez ensuite doucement la surface de la feuille avec un doigt pour enlever la couche de cire. Ensuite, placez une goutte de la solution BASTA diluée sur la feuille. Surveillez les feuilles traitées avec la solution BASTA pour les signes de flétrissement jusqu’à une semaine.Sélectionnez enfin les plantes dont les feuilles ne sont pas affectées par les gouttes BASTA pour une analyse plus approfondie. Dans ce protocole, S.Parvula a été transformé avec l’agrobactérie utilisant une méthode florale de trempette. L’infection par l’agrobactérie a entraîné l’avortement de certaines fleurs.Cependant, les plantes de S.Parvula ont continué à produire de nouvelles fleurs après la première floraison, et pourraient être transformées à nouveau. À l’aide des tests de pulvérisation et de drop BASTA, de véritables transformateurs positifs peuvent être identifiés avec précision. Le nombre d’échantillons testés à l’aide de la confirmation PCR peut être réduit.Bien que cette méthode soit similaire à la transformation d’Arabidopsis Thaliana, il est important de se rappeler les différences de croissance et de morphologie de Schrenkiella Parvula. La modification du protocole pour tenir compte de ces différences est essentielle à la réussite de la transformation. Cette technique pourrait aider les chercheurs à explorer l’évolution des variations génomiques conduisant à de multiples adaptations au stress saline dans le modèle extremophyte, Schrenkiella Parvula.Combinant cette technique avec les informations sur les fonctions d’Aradopsis Thaliana, une autre plante étroitement liée à Schrenkiella Parvula. Les chercheurs peuvent étudier les variations de la régulation et des fonctions qu’il s’est passé de deux structures distinctes entre ces deux espèces. Pendant le processus de transformation, il est important de contenir toute la solution d’infiltration d’agrobactéries dans des contenants autoclavés.Stérilisez et jetez en toute sécurité tous les matériaux qui sont entrés en contact avec l’agrobactérie, y compris les gants, les pointes de pipette macro et les serviettes en papier.

Research

JoVE Journal

Genetics

Plant Growth and Agrobacterium-mediated Floral-dip Transformation of the Extremophyte Schrenkiella parvula

A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation

Une plate-forme robotique pour haut débit protoplastes Isolement et Transformation

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal ...

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Génétique

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

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L&#39;utilisation de la Induced somatique analyse sectorielle (AISS) pour l&#39;étude des gènes et de promoteurs impliqués dans la formation du bois et le développement de souches secondaire

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