Name: plant growth and agrobacterium-mediated floral-dip transformation of the extremophyte schrenkiella parvula
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Plant Growth and Agrobacterium-mediated Floral-dip Transformation of the Extremophyte Schrenkiella parvula at JoVE.com

Diese Arbeit wurde durch den National Science Foundation Award MCB 1616827 unterstützt.

1. Pflanzenwachstum
<ol><li>
Samen Sterilisation (optional)
	<ol>
<li>Bereiten Sie 50 % Bleichmittel in bidestilliertem Wasser (DdH2O) mit 1 oder 2 Tropfen eines nichtionischen Waschmittels (siehe Tabelle der Materialien) in einem 50 mL-Tube. Invertieren Sie das Rohr mehrmals, um die Lösung zu mischen. Hinweis: Es empfiehlt sich, Samen Sterilisation in einem Laminar-Flow Kabinett mit einer UV sterilisierte Oberfläche für 15 min durchzuführen.</li>
		<...

<ol>
	<li>Dassanayake, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+of+the+extremophile+crucifer+Thellungiella+parvula.">The genome of the extremophile crucifer Thellungiella parvula.</a> Nature Genetics. 43 (9), 913-918 (2011).</li><li>Oh, D. -. H., Dassanayake, M., Bohnert, H. J., Cheeseman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+at+the+extreme:+lessons+from+the+genome.">Life at the extreme: lessons from the genome.</a> Genome Biology. 13 (3), 241 (2012).</li><li>Whited, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Next+Top+Models.">The Next Top Models.</a> Cell. 163 (1), 18-20 (2015).</li><li>Dassanayake, M., Yun, D. O. D., Bressan, R. A., Cheeseman, J. M., Bohnert, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+scope+of+things+to+come:+New+paradigms+in+biotechnology.">The scope of things to come: New paradigms in biotechnology.</a> Plant Biotechnology and Agriculture: Prospects for the 21st Century. , 19-34 (2009).</li><li>Dittami, S. M., Tonon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomes+of+extremophile+crucifers:+New+platforms+for+comparative+genomics+and+beyond.">Genomes of extremophile crucifers: New platforms for comparative genomics and beyond.</a> Genome Biology. 13 (8), 166 (2012).</li><li>Amtmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Learning+from+evolution:+Thellungiella+generates+new+knowledge+on+essential+and+critical+components+of+abiotic+stress+tolerance+in+plants.">Learning from evolution: Thellungiella generates new knowledge on essential and critical components of abiotic stress tolerance in plants.</a> Molecular Plant. 2 (1), 3-12 (2009).</li><li>Oh, D. -. H., Hong, H., Lee, S. Y., Yun, D. -. J., Bohnert, H. J., Dassanayake, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+structures+and+transcriptomes+signify+niche+adaptation+for+the+multiple-ion-tolerant+extremophyte+Schrenkiella+parvula.">Genome structures and transcriptomes signify niche adaptation for the multiple-ion-tolerant extremophyte Schrenkiella parvula.</a> Plant Physiology. 164 (4), 2123-2138 (2014).</li><li>Orsini, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+salt+tolerance+parameters+in+11+wild+relatives+of+Arabidopsis+thaliana.">A comparative study of salt tolerance parameters in 11 wild relatives of Arabidopsis thaliana.</a> Journal of Experimental Botany. 61 (13), 3787-3798 (2010).</li><li>Uzilday, B., Ozgur, R., Sekmen, A. H., Yildiztugay, E., Turkan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+alternative+electron+sinks+and+antioxidant+defence+in+chloroplasts+of+the+extreme+halophyte+Eutrema+parvulum+(Thellungiella+parvula)+under+salinity.">Changes in the alternative electron sinks and antioxidant defence in chloroplasts of the extreme halophyte Eutrema parvulum (Thellungiella parvula) under salinity.</a> Annals of Botany. 115 (3), 449-463 (2015).</li><li>Teusink, R. S., Rahman, M., Bressan, R. A., Jenks, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cuticular+waxes+on+Arabidopsis+thaliana+close+relatives+Thellungiella+halophila+and+Thellungiella+parvula.">Cuticular waxes on Arabidopsis thaliana close relatives Thellungiella halophila and Thellungiella parvula.</a> International Journal of Plant Sciences. 163 (2), 309-315 (2002).</li><li>Jarvis, D. E., Ryu, C. H., Beilstein, M. A., Schumaker, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+for+SOS1+in+the+convergent+evolution+of+salt+tolerance+in+Eutrema+salsugineum+and+Schrenkiella+parvula.">Distinct roles for SOS1 in the convergent evolution of salt tolerance in Eutrema salsugineum and Schrenkiella parvula.</a> Molecular Biology and Evolution. 31 (8), 2094-2107 (2014).</li><li>Clough, S. J., Bent, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Floral+dip:+A+simplified+method+for+Agrobacterium-mediated+transformation+of+Arabidopsis+thaliana.">Floral dip: A simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.</a> Plant Journal. 16 (6), 735-743 (1998).</li><li>Koornneef, M., Meinke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+Arabidopsis+as+a+model+plant.">The development of Arabidopsis as a model plant.</a> Plant Journal. 61 (6), 909-921 (2010).</li><li>Bai, J., Wu, F., Mao, Y., He, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+planta+transformation+of+Brassica+rapa+and+B.+napus+via+vernalization-infiltration+methods.">In planta transformation of Brassica rapa and B. napus via vernalization-infiltration methods.</a> Protocol Exchange. 10, 1028 (2013).</li><li>Sparrow, P. A. C., Goldsack, C. M. P., &#216;stergaard, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+technology+in+the+Brassicaceae.">Transformation technology in the Brassicaceae.</a> Genetics and Genomics of the Brassicaceae. , 505-525 (2011).</li><li>Hoagland, D. R., Arnon, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+water-culture+method+for+growing+plants+without+soil.">The water-culture method for growing plants without soil.</a> California Agricultural Experiment Station Circular. 347 (347), 1-32 (1950).</li><li>Saiki, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer-directed+enzymatic+amplification+of+DNA+with+a+thermostable+DNA+polymerase.">Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase.</a> Science. 239 (4839), 487-491 (1988).</li><li>Sun, Y., Sriramajayam, K., Luo, D., Liao, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Quick,+cost-free+method+of+purification+of+dna+fragments+from+agarose+gel.">A Quick, cost-free method of purification of dna fragments from agarose gel.</a> Journal of Cancer. 3, 93-95 (2012).</li><li>Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+sequencing+with+chain-terminating+inhibitors.">DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12), 5463-5467 (1977).</li><li>Bertani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+Lysogenesis+I.+The+mode+of+phage+liberation+by+lysogenic+Eschericia+coli.">Studies on Lysogenesis I. The mode of phage liberation by lysogenic Eschericia coli.</a> Journal of Bacteriolgy. 62 (3), 293-300 (1951).</li><li>Koncz, C., Martini, N., Szabados, L., Hrouda, M., Bachmair, A., Schell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specialized+vectors+for+gene+tagging+and+expression+studies.">Specialized vectors for gene tagging and expression studies.</a> Plant Molecular Biology Manual. , 53-74 (1994).</li><li>Weigel, D., Glazebrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+Agrobacterium+using+electroporation.">Transformation of Agrobacterium using electroporation.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (30), (2006).</li><li>Murray, M. G., Thompson, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+high+molecular+weight+plant+DNA.">Rapid isolation of high molecular weight plant DNA.</a> Nucleic Acids Research. 8 (19), 4321-4326 (1980).</li><li>Inan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salt+cress.+a+halophyte+and+cryophyte+Arabidopsis+relative+model+system+and+its+applicability+to+molecular+genetic+analyses+of+growth+and+development+of+extremophiles.">Salt cress. a halophyte and cryophyte Arabidopsis relative model system and its applicability to molecular genetic analyses of growth and development of extremophiles.</a> Plant Physiol. 135 (3), 1718-1737 (2004).</li><li>Ghedira, R., De Buck, S., Nolf, J., Depicker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+efficiency+of+Arabidopsis+thaliana+floral+dip+transformation+is+determined+not+only+by+the+Agrobacterium+strain+used+but+also+by+the+physiology+and+the+ecotype+of+the+dipped+plant.">The efficiency of Arabidopsis thaliana floral dip transformation is determined not only by the Agrobacterium strain used but also by the physiology and the ecotype of the dipped plant.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 26 (7), 823-832 (2013).</li><li>Shaohong, F. U., Xianya, W. E. I., Yingze, N. I. U., Shixing, G. U. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+Brassica+napus+with+the+method+of+floral-dip.">Transformation of Brassica napus with the method of floral-dip.</a> Biotechnology: Genomics and Its Applications. , 45-49 (2005).</li><li>Li, J., Tan, X., Zhu, F., Guo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+simple+method+for+Brassica+napus+floral-dip+transformation+and+selection+of+transgenic+plantlets.">A rapid and simple method for Brassica napus floral-dip transformation and selection of transgenic plantlets.</a> International Journal of Biology. 2 (1), 127 (2010).</li><li>Li, H. Q., Xu, J., Chen, L., Li, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+an+efficient+Agrobacterium+tumefaciens-mediated+leaf+disc+transformation+of+Thellungiella+halophila.">Establishment of an efficient Agrobacterium tumefaciens-mediated leaf disc transformation of Thellungiella halophila.</a> Plant Cell Reports. 26 (10), 1785-1789 (2007).</li><li>Wu, G., Rossidivito, G., Hu, T., Berlyand, Y., Poethig, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traffic+lines:+New+tools+for+genetic+analysis+in+Arabidopsis+thaliana.">Traffic lines: New tools for genetic analysis in Arabidopsis thaliana.</a> Genetics. 200 (1), 35-45 (2015).</li></ol>

Der physiologische Zustand der Anlage beeinflusst maßgeblich die Effizienz der Umwandlung25. Die Verwendung von gesunde und kräftige Pflanzen für die Transformation ist eine wesentliche Voraussetzung für erfolgreiche Transformation in S. Parvula. Wasser oder leicht gestresste Pflanzen haben weniger Blüten, die im Vergleich zu den gesunden Pflanzen ideal für Transformation (Abbildung 1, Mittelkonsole). S. Parvula kann bei einer Lichtintensität ...

In diesem Protokoll beschreiben wir das Wachstum und die Schaffung von stabilen transgenen Linien für das Extremophyte Modell Schrenkiella Parvula. Die Verfügbarkeit eines effizienten Transformation-Systems ist ein Markenzeichen von jedem vielseitige genetisches Modell. Pflanzen, die in extremen Umgebungen, bezeichnet als Extremophytes, liefern eine wichtige Ressource für das Verständnis Pflanze Anpassungen an Umweltbelastungen. Schrenkiella parvula (ehemals Thellungiella Parvula und Eutrema Parvulum) ist ein solches Extremophyte-Modell, mit der Erweiterung genomischer Ressourcen1,2,3,4,5. Jedoch wurden Umwandlung Protokolle nicht noch für S. Parvula in veröffentlichten Studien berichtet.
Das Genom von S. Parvula ist das erste veröffentlichte Extremophyte Genom in Brassicaceae (Senf-Kohl-Familie) und zeigt eine umfangreiche allgemeine Genom trägt mit dem nicht-Extremophyte Modell, Arabidopsis Thaliana1. So könnten Vergleichsstudien zwischen A. Thaliana und S. Parvula profitieren aus der Fülle der genetischen Studien auf A. Thaliana zu informativen Hypothesen über wie das Genom S. Parvula reguliert entwickelt und hat anders zur Bewältigung betont extremer Umwelt5,6,7. S. Parvula ist eines der am meisten salztoleranten Arten (basierend auf Boden NaCl LD50) unter bekannten wilden Verwandten von A. Thaliana8. Neben der NaCl-Toleranz S. Parvula überlebt und seines Lebenszyklus in Anwesenheit von mehreren Salzionen in hohen Konzentrationen giftig für die meisten Pflanzen7vervollständigt. In Reaktion auf die abiotischen betont in seinem natürlichen Lebensraum weit verbreitet hat es verschiedene Merkmale entwickelt, unter denen mehrere biochemische oder physiologische Ebene 8,9,10untersucht worden sind, 11.
Seit 2010 über 400 Peer-getestet-Publikationen, die als ein Zielarten S. Parvula verwendet oder im Vergleich mit anderen Pflanzengenomen verwendet. Jedoch konnte ein klare Engpass identifiziert werden, mit einem genaueren Blick der welche Art von Studien sind durchgeführt worden. Die meisten dieser Berichte die mögliche Verwendung von S. Parvula in zukünftigen Studien zu diskutieren oder in vergleichende genomische oder Phylogenomic Studien verwenden. Aufgrund des Fehlens eines Proof-of-Concept-Transformation-Protokolls eingerichtet für S. Parvula, es nicht in funktionelle Genomik Studien, trotz des Habens eines der höchsten Qualität Pflanzengenomen bisher verfügbaren verwendet wurde (> 5 Mb Contig N50) montiert und kommentiert in Chromosom-Ebene Pseudomolecules1.
Floral-Dip Transformationsmethode Agrobakterium-vermittelten geworden die meisten allgemein verwendeten Methode zum Erstellen von Trasngenic Linien in A. Thalianaund eine reproduzierbare System Transformation entwickelte sich ein kritischer Faktor für seinen Erfolg als eine genetischen Modell12,13. Nicht alle Brassicaceae Arten ist jedoch nachweislich erfolgreich umgewandelt werden mit der floral-Dip-Methode für A. Thalianaentwickelt. Speziell, wurde die Brassicaceae Lineage II-Arten, die S. Parvula gehören widerspenstigen bis floral-Dip nach Umwandlung Methoden14,15.
Die unbestimmten Blüte Wuchsform von S. Parvula, kombiniert mit seiner schmalen Blatt Morphologie machte es schwierig, die standard Agrobakterium-vermittelten floral-Dip Transformationsmethode zu verabschieden. In dieser Studie berichten wir über das geänderte Protokoll, die, das wir für reproduzierbare Transformation von S. Parvulaentwickelt haben.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1303px;" width="1302">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Agar</td>
			<td style="width:293px;">VWR International, Radnor, PA</td>
			<td style="width:127px;">90000-762</td>
			<td style="width:541px;">Bacto Agar Soldifying Agent, BD Diagnostics</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B5 vitamins</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>G1019</td>
			<td>Gamborg&#8217;s Vitamin Solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Desiccant</td>
			<td>W A Hammond Drierite, Xenia, OH</td>
			<td style="width:127px;">22005</td>
			<td>Indicating DRIERITE 6 mesh</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:341px;">Destination vector for plant transformation</td>
			<td>TAIR</td>
			<td style="width:127px;">Vector:6531113857</td>
			<td>pKGWFS7</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Electroporation cuvette</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>9104-5050</td>
			<td>Electroporation cuvette, round cap, 0.2 cm gap</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Electroporator</td>
			<td>BIO-RAD Laboratories, Hercules, CA</td>
			<td>1652100</td>
			<td>MicroPulser Electroporator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fertilizer beads</td>
			<td>Osmocote Garden, Marysville, OH</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Osmocote Smart-Release Plant Food&#160;Flower &#38; Vegetable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gel extraction kit</td>
			<td>iNtRON Biotechnology, Boston, MA</td>
			<td>17289</td>
			<td>MEGAquick-spin Total fragment DNA purification kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gentamicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>G1914-5G</td>
			<td>Gentamicin sulfate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Glufosinate-ammonium (11.3%) herbicide (BASTA)</td>
			<td>Bayer environmental science, Montvale, NJ</td>
			<td>N/A</td>
			<td>FINALE herbicide</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kanamycin</td>
			<td>VWR International, Radnor, PA</td>
			<td>200004-444</td>
			<td>Kanamycin monosulfate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MES</td>
			<td>Bioworld, Dublin, OH</td>
			<td>41320024-2</td>
			<td>MES, Free Acid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MS salt</td>
			<td>MP Biomedicals, Santa Anna, CA</td>
			<td>092621822</td>
			<td>Hoagland&#39;s modified basal salt mixture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N6-benzylaminopurine (BA)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>B3274</td>
			<td>6-Benzylaminopurine solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td>Sigma-Alrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>Sodium chloride</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Non-ionic detergent</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td>TWEEN 20&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Plasmid isolation kit</td>
			<td>Zymo Research, Irvine, CA</td>
			<td>D4036</td>
			<td>Zyppy Plasmid Kits</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinase enzyme mix kit</td>
			<td>Life Technology</td>
			<td>11791-020</td>
			<td>Gateway LR Clonase II Enzyme mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rifampicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>R3501-1G</td>
			<td>Rifampicin, powder, &#62;= 97% (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Shaking incubator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>SHKE4450</td>
			<td>MaxQ 4450 Benchtop Orbital Shakers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Soil mix</td>
			<td>Sun Gro</td>
			<td>SUN239223328CFLP</td>
			<td>Sun Gro Metro-Mix 360 Grower Mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spectinomycin</td>
			<td>VWR International, Radnor, PA</td>
			<td>IC15206705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile 50ml conical tubes</td>
			<td>USA Scientific, Ocala, FL</td>
			<td>1500-1811</td>
			<td>50 ml conical screw cap tubes, copolymer, racks, sterile</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sucrose</td>
			<td>VWR International, Radnor, PA</td>
			<td>57-50-1</td>
			<td>Sucrose, ACS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Surfactant solution</td>
			<td>Lehle seeds, Round Rock, TX</td>
			<td>VIS-02</td>
			<td>Silwet L-77</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Topoisomerase-based cloning kit</td>
			<td>Life Technologies, Carlsbad, CA</td>
			<td>K240020</td>
			<td>pENTR/D-TOPO Cloning Kit, with One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tryptone</td>
			<td>VWR International, Radnor, PA</td>
			<td>90000-282</td>
			<td>BD Bacto Tryptone, BD Biosciences</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast Extract</td>
			<td>VWR International, Radnor, PA</td>
			<td>90000-722&#160;</td>
			<td>BD Bacto Yeast Extract, BD Biosciences</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

plant growth and agrobacterium-mediated floral-dip transformation of the extremophyte schrenkiella parvula

Schrenkiella Parvula ist eine Extremophyte, die verschiedenen abiotischen Belastungen ausgesetzt, darunter mehrere Ionen-Toxizität betont angepasst. Trotz hoher Qualität genomischer Ressourcen zur Verfügung zu studieren, wie Pflanzen sich an ökologischen anpassen betont seinen Wert als ein Modell der funktionellen Genomik und Werkzeug hat durch das Fehlen eines Systems möglich Transformation beschränkt worden. Wir berichten in diesem Protokoll wie stabile transgenen S. Parvula erzeugt Linien mit einem Agrobakterium-vermittelten floral-Dip Verfahren. Wir modifiziert das Umwandlung Protokoll A. Thaliana , um einzigartige Merkmale von S. Parvula, wie eine unbestimmte blühenden Gewohnheit und eine hohe epikutikulären Wachsgehalt auf den Blättern zu berücksichtigen. Kurz, waren S. Parvula Samen bei 4 ° C für fünf Tage vor der Aussaat stratifiziert. Pflanzen wurden angebaut an eine Photoperiode 14 h Licht und dunkel 10 h und eine 130 µmol m-2s-1 Lichtintensität, bei 22 ° C bis 24 ° C. Acht bis neun Wochen alten Pflanzen mit mehreren Blütenständen wurden für die Transformation ausgewählt. Diese Blütenstände wurden in einer Infiltration-Lösung von Agrobacterium Tumefaciens GV3101 tragen das Plasmid pMP90RK getaucht. Wir führten zwei Runden der Blume mit einem Intervall von drei bis vier Wochen zur Steigerung der Effizienz der Umwandlung eintauchen. Die T1-Samen wurden gesammelt und getrocknet für vier Wochen in einem Behälter mit Trockenmittel, bevor Keimung zum Bildschirm für Kandidaten Linien umgewandelt. Widerstand gegen BASTA diente T1 Pflanzen auf den Bildschirm. Die BASTA-Lösung besprüht wir dreimal mit einem Abstand von drei Tagen ab zwei Wochen alten Pflanzen, Fehlalarme zu reduzieren. Ein BASTA Drop durchgeführt wurde auf die Überlebenden Einzelpflanzen um wahre positive Transformanten zu identifizieren. Die Transformationseffizienz war 0,033 %, 3 – 4 transgene Pflanzen pro 10.000 T1 Samen vermehrt nachgeben.

Wir entwickelt eine Umwandlung Protokoll, die Ernte T0 Samen innerhalb von 150 Tagen kann, mit einer floralen-Dip-Methode aus, die für A. Thalianamodifiziert. Abbildung 1 zeigt eine Zusammenfassung der Chronik und S. Parvula Pflanzen, die die optimale Bühne für die Ausführung der Transformation durch blumig-Dip darstellen. Wir 70 –80 S. Parvula Blumenpflanzen in mehrere Blütenstände bei 60 bis 80 Tage nach der Kei...

Watch this Scientific Journal Video about Plant Growth and Agrobacterium-mediated Floral-dip Transformation of the Extremophyte Schrenkiella parvula at JoVE.com

Plant Growth and Agrobacterium-mediated Floral-dip Transformation of the Extremophyte Schrenkiella parvula

Pflanzen Sie Wachstum und Agrobakterium-vermittelten Floral-Dip Transformation des Extremophyte Schrenkiella parvula

Agrobakterium-vermittelten Transformation mit einem floral-Dip-Methode kann erfolgreich eingesetzt werden, stabilere transgene Linien des Modells Extremophyte Schrenkiella Parvulaerstellen. Wir präsentieren Ihnen ein Protokoll aus, die für Arabidopsis Thaliana, unter Berücksichtigung verschiedener Wachstum Gewohnheiten und physiologischen Eigenschaften der Extremophyte modifiziert.

Schrenkiella parvula is an extremophyte adapted to various abiotic stresses, including multiple ion toxicity stresses. Despite high-quality genomic ...

Diese Methode, ein reproduzierbares Transformationsprotokoll für Schrenkiella parvula, kann helfen, Fragen auf dem Gebiet der pflanzenvergleichenden und funktionellen Genombildung zu beantworten, insbesondere Studien zur Untersuchung von Pflanzenanpassungen an raue Umgebungen. Diese Technik ermöglicht untersuchungen Routinefunktionen in Schrenkiella parvula an der Extremophyten an Multiionensalzspannungen angepasst. Es ermöglicht auch vergleichende Studien, die auch auf seine nahen Verwandten, die Mutter Aribidopsis Thaliana betrachtet.Der Vergleich von Schrenkiella Parvula mit Aribidopsis Thaliana kann Einblicke in Varianzen in der Genregulation und -funktion geben, die die einzigartige Anpassung von Schrenkiella parvula ermöglichen. Das Transformationsprotokoll für Arabidopsis Thaliana ist bereits etabliert. Die Methode ermöglicht nun vergleichende Studien mit transgenen Schrenkiella Parvula-Pflanzen.Im Allgemeinen Forscher neu zu dieser Methode wird wegen der blühenden Gewohnheit und der Blattmorphologie von Schrenkiella Parvula Pflanzen kämpfen, die effektive Transformation mit einem Flora Dip sowie die Auswahl von wahren Transformationsmitteln schwierig machen. Um zu beginnen, verwenden Sie einen nassen Zahnstocher, um etwa 20 bis 25 S.Parvula Samen auf nassen Boden zu übertragen. Dann schichten Sie die Samen bei vier Grad Celsius für fünf bis sieben Tage.Nach der Schichtung, geben Sie die Samen in die Wachstumskammer für sieben bis zehn Tage. Sobald alle Sämlinge gekeimt sind, lassen Sie nur einen Sämling in jeder der vier Ecken und in der Mitte der Töpfe. Wachsen Sie die Pflanzen für acht bis zehn Wochen in der Wachstumskammer, bis sie blühen.Wählen Sie am Tag der Transformation S.Parvula-Pflanzen gemäß dem Textprotokoll aus. Verwenden Sie Zangen und kleine Scheren, um alle bestäubten Blütenstände zu entfernen, die sich bereits zu Siliques entwickeln. Nachdem die Pflanzen fertig sind, bereiten Sie eine Agrobacterium-Infiltrationslösung vor.Danach tauchen Sie den S.Parvula Blütenstand in agrobacterium Infiltrationslösung für 20 Sekunden. Hier ist das früheste Stadium der Pflanzen, die für die Transformation verwendet werden können, solange bereits entwickelte Siliques vor der Transformation entfernt werden, können ältere Pflanzen mit mehr Blüten verwendet werden. Nach der Umwandlung, legen Blumen getaucht etenzten Pflanzen horizontal in saubere Schalen mit Kuppeln, um die Pflanzen zu bedecken.Dann legen Sie die Pflanzen für ein bis zwei Tage in einen dunklen Wachstumsraum. Bringen Sie die Pflanzen in eine aufrechte Position zurück und übertragen Sie sie in den Wachstumsraum. In der darauffolgenden Woche, überwachen Sie die getauchten Blütenstände.Zehn Tage nach dem ersten floralen Dip werden Die S.Parvula-Pflanzen immer wieder neue Blütenstände und Sikörnungen produzieren. Eine zweite Runde von floralen Dip kann durchgeführt werden, um die neu entstehenden Blütenstände weiter zu transformieren. Wachsen Sie die Pflanzen, bis die Samen reifen, und ernten Sie die Samen etwa 21 Wochen.Trocknen Sie die Samen für zwei bis drei Wochen bei Raumtemperatur in einem luftdichten Behälter mit Trockenmitteln gefüllt. Pflanzen Sie die T-ein-Samen gemäß dem Textprotokoll. Wachsen Sie die Pflanzen, bis sich die ersten zwei bis drei echten Blätter entwickeln.Um die erste Auswahl für Herbizidresistenz durchzuführen, verdünnen Sie Glufosinat-Ammoniumherbizid und sprühen Sie es auf die Sämlinge. Bedecken Sie die Sämlinge über Nacht mit den Kuppeln. Legen Sie die Schalen zurück in den Wachstumsraum, und entfernen Sie die Kuppel.Warten Sie, bis die meisten Sämlinge durch das Herbizid ausgewählt sind. Um mit der zweiten Auswahl zu beginnen, identifizieren Sie die Pflanzen, die überleben, nachdem sie drei- bis viermal mit der BASTA-Lösung besprüht wurden. Nach dem Anbau der Pflanzen für zwei bis drei weitere Wochen, wählen Sie das größte reife Blatt auf jeder Pflanze.Als nächstes reiben Sie die Oberfläche des Blattes vorsichtig mit einem Finger, um die Wachsschicht zu entfernen. Dann einen Tropfen der verdünnten BASTA-Lösung auf das Blatt legen. Überwachen Sie die mit der BASTA-Lösung behandelten Blätter bis zu einer Woche lang auf Anzeichen von Welken.Wählen Sie schließlich die Pflanzen mit Blättern, die von den BASTA-Tropfen nicht betroffen sind, zur weiteren Analyse aus. In diesem Protokoll wurde S.Parvula mit Agrobacterium mit einer floralen Dip-Methode transformiert. Eine Infektion mit Agrobacterium führte zur Abtreibung einiger Blumen.Die S.Parvula-Pflanzen produzierten jedoch nach dem ersten Blütentauchen weiterhin neue Blüten und konnten wieder verwandelt werden. Mit den BASTA-Sprüh- und Falltests können echte positive Transformationsmittel genau identifiziert werden. Die Anzahl der mit PCR-Bestätigung getesteten Proben kann reduziert werden.Während diese Methode der Transformation von Arabidopsis Thaliana ähnelt, ist es wichtig, sich an die Unterschiede im Wachstum und der Morphologie von Schrenkiella Parvula zu erinnern. Das Ändern des Protokolls, um diese Unterschiede widerzuspiegeln, ist für eine erfolgreiche Transformation von entscheidender Bedeutung. Diese Technik könnte Forschern helfen, die Evolution genomischer Variationen zu erforschen, die zu mehreren Salzspannungsanpassungen im Extremophytenmodell Schrenkiella Parvula führen.Kombination dieser Technik mit den Informationen über die Funktionen von Aradopsis Thaliana, einer weiteren Pflanze, die eng mit Schrenkiella Parvula verwandt ist. Die Forscher können die Unterschiede in der Regelung und Funktionen untersuchen, dass dies zwei unterschiedliche Strukturen zwischen diesen beiden Arten sind. Während des Transformationsprozesses ist es wichtig, die gesamte Agrobacterium-Infiltrationslösung in autoklavierbaren Behältern zu enthalten.Sterilisieren und entsorgen Sie alle Materialien, die mit Agrobacterium in Berührung kamen, einschließlich Handschuhe, Makropipettenspitzen und Papiertücher.

Research

JoVE Journal

Genetics

Plant Growth and Agrobacterium-mediated Floral-dip Transformation of the Extremophyte Schrenkiella parvula

A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation

Ein Roboter-Plattform für Hochdurchsatz-Isolierung von Protoplasten und Transformation

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal ...

Forschung

Genetik

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Genetische Manipulation der Pflanze Pathogen<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; Zu Pilzbiologie und Pflanzen Mikroben-Interaktionen Studie

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

The Use of Induced Somatic Sector Analysis (ISSA) for Studying Genes and Promoters Involved in Wood Formation and Secondary Stem Development

The Use of Induced Somatic Sector Analysis ISSA for Studying Genes and Promoters Involved in Wood Formation and Secondary Stem Development

Die Verwendung von Induced Somatic Sektoranalyse (IVSS) in Holzbildung und Nebenschaft Entwicklung beteiligten Gene und Promotoren Studieren

Secondary stem growth in trees and associated wood formation are significant both from biological and commercial perspectives. However, relatively little ...

Rapid Deletion Production in Fungi via Agrobacterium Mediated Transformation of OSCAR Deletion Constructs

Rapid Deletion Production in Fungi via Agrobacterium Mediated Transformation of OSCAR Deletion Constructs

Rapid Deletion Produktion in Pilzen über<em&gt; Agrobacterium</em&gt; Vermittelte Transformation von OSCAR Deletion Constructs

Precise deletion of gene(s) of interest, while leaving the rest of the genome unchanged, provides the ideal product to determine that particular ...

Assessment of DNA Contamination in RNA Samples Based on Ribosomal DNA

Bewertung der Kontamination der DNA in RNA-Proben anhand der ribosomalen DNA

One method extensively used for the quantification of gene expression changes and transcript abundances is reverse-transcription quantitative real-time ...

Purification of High Molecular Weight Genomic DNA from Powdery Mildew for Long-Read Sequencing

Reinigung von High Molecular Weight genomischer DNA aus Echten Mehltaus für Long-Read-Sequenzierung

The powdery mildew fungi are a group of economically important fungal plant pathogens. Relatively little is known about the molecular biology and genetics ...

Optimization and Comparative Analysis of Plant Organellar DNA Enrichment Methods Suitable for Next-generation Sequencing

Optimierung und Vergleichsanalyse von pflanzlichen organellaren DNA-Anreicherungsmethoden Geeignet für die Sequenzierung der nächsten Generation

Plant organellar genomes contain large, repetitive elements that may undergo pairing or recombination to form complex structures and/or sub-genomic ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Robuste DNA-Isolierung und Hochdurchsatz-Sequenzierung Bibliotheksbau für Herbar

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

Die Wurzel Mikrobiom zu erkunden: Extrahieren von Bakteriengemeinschaft Daten aus dem Boden, die Rhizosphäre und die Wurzel Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

Discrimintion and Mapping of the Primary and Processed Transcripts in Maize Mitochondrion Using a Circular RT-PCR-based Strategy

Diskrimintion und Mapping der primären und verarbeiteten Transkripte in Mais mitochondrion mit einer kreisförmigen RT-PCR-basierten Strategie

In plant mitochondria, some steady-state transcripts have 5&#39; triphosphate derived from transcription initiation (primary transcripts), while the ...