Name: plant growth and agrobacterium-mediated floral-dip transformation of the extremophyte schrenkiella parvula
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Plant Growth and Agrobacterium-mediated Floral-dip Transformation of the Extremophyte Schrenkiella parvula at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי פרס הלאומית למדע MCB 1616827.

1. צימוח
<ol><li>
עיקור זרע (אופציונלי)
	<ol>
<li>להכין 50% מלבין מזוקק פעמיים מים (ddH2O) עם 1 או 2 טיפות של חומר ניקוי ללא יונית (ראה טבלה של חומרים) צינור 50 מ ל. היפוך ברכבת התחתית מספר פעמים כדי לערבב את הפתרון. הערה: עדיף לבצע עיקור זרע בזרימה שכבתית ארון עם משטח סטירי...

<ol>
	<li>Dassanayake, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+of+the+extremophile+crucifer+Thellungiella+parvula.">The genome of the extremophile crucifer Thellungiella parvula.</a> Nature Genetics. 43 (9), 913-918 (2011).</li><li>Oh, D. -. H., Dassanayake, M., Bohnert, H. J., Cheeseman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+at+the+extreme:+lessons+from+the+genome.">Life at the extreme: lessons from the genome.</a> Genome Biology. 13 (3), 241 (2012).</li><li>Whited, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Next+Top+Models.">The Next Top Models.</a> Cell. 163 (1), 18-20 (2015).</li><li>Dassanayake, M., Yun, D. O. D., Bressan, R. A., Cheeseman, J. M., Bohnert, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+scope+of+things+to+come:+New+paradigms+in+biotechnology.">The scope of things to come: New paradigms in biotechnology.</a> Plant Biotechnology and Agriculture: Prospects for the 21st Century. , 19-34 (2009).</li><li>Dittami, S. M., Tonon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomes+of+extremophile+crucifers:+New+platforms+for+comparative+genomics+and+beyond.">Genomes of extremophile crucifers: New platforms for comparative genomics and beyond.</a> Genome Biology. 13 (8), 166 (2012).</li><li>Amtmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Learning+from+evolution:+Thellungiella+generates+new+knowledge+on+essential+and+critical+components+of+abiotic+stress+tolerance+in+plants.">Learning from evolution: Thellungiella generates new knowledge on essential and critical components of abiotic stress tolerance in plants.</a> Molecular Plant. 2 (1), 3-12 (2009).</li><li>Oh, D. -. H., Hong, H., Lee, S. Y., Yun, D. -. J., Bohnert, H. J., Dassanayake, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+structures+and+transcriptomes+signify+niche+adaptation+for+the+multiple-ion-tolerant+extremophyte+Schrenkiella+parvula.">Genome structures and transcriptomes signify niche adaptation for the multiple-ion-tolerant extremophyte Schrenkiella parvula.</a> Plant Physiology. 164 (4), 2123-2138 (2014).</li><li>Orsini, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+salt+tolerance+parameters+in+11+wild+relatives+of+Arabidopsis+thaliana.">A comparative study of salt tolerance parameters in 11 wild relatives of Arabidopsis thaliana.</a> Journal of Experimental Botany. 61 (13), 3787-3798 (2010).</li><li>Uzilday, B., Ozgur, R., Sekmen, A. H., Yildiztugay, E., Turkan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+alternative+electron+sinks+and+antioxidant+defence+in+chloroplasts+of+the+extreme+halophyte+Eutrema+parvulum+(Thellungiella+parvula)+under+salinity.">Changes in the alternative electron sinks and antioxidant defence in chloroplasts of the extreme halophyte Eutrema parvulum (Thellungiella parvula) under salinity.</a> Annals of Botany. 115 (3), 449-463 (2015).</li><li>Teusink, R. S., Rahman, M., Bressan, R. A., Jenks, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cuticular+waxes+on+Arabidopsis+thaliana+close+relatives+Thellungiella+halophila+and+Thellungiella+parvula.">Cuticular waxes on Arabidopsis thaliana close relatives Thellungiella halophila and Thellungiella parvula.</a> International Journal of Plant Sciences. 163 (2), 309-315 (2002).</li><li>Jarvis, D. E., Ryu, C. H., Beilstein, M. A., Schumaker, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+for+SOS1+in+the+convergent+evolution+of+salt+tolerance+in+Eutrema+salsugineum+and+Schrenkiella+parvula.">Distinct roles for SOS1 in the convergent evolution of salt tolerance in Eutrema salsugineum and Schrenkiella parvula.</a> Molecular Biology and Evolution. 31 (8), 2094-2107 (2014).</li><li>Clough, S. J., Bent, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Floral+dip:+A+simplified+method+for+Agrobacterium-mediated+transformation+of+Arabidopsis+thaliana.">Floral dip: A simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.</a> Plant Journal. 16 (6), 735-743 (1998).</li><li>Koornneef, M., Meinke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+Arabidopsis+as+a+model+plant.">The development of Arabidopsis as a model plant.</a> Plant Journal. 61 (6), 909-921 (2010).</li><li>Bai, J., Wu, F., Mao, Y., He, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+planta+transformation+of+Brassica+rapa+and+B.+napus+via+vernalization-infiltration+methods.">In planta transformation of Brassica rapa and B. napus via vernalization-infiltration methods.</a> Protocol Exchange. 10, 1028 (2013).</li><li>Sparrow, P. A. C., Goldsack, C. M. P., &#216;stergaard, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+technology+in+the+Brassicaceae.">Transformation technology in the Brassicaceae.</a> Genetics and Genomics of the Brassicaceae. , 505-525 (2011).</li><li>Hoagland, D. R., Arnon, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+water-culture+method+for+growing+plants+without+soil.">The water-culture method for growing plants without soil.</a> California Agricultural Experiment Station Circular. 347 (347), 1-32 (1950).</li><li>Saiki, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer-directed+enzymatic+amplification+of+DNA+with+a+thermostable+DNA+polymerase.">Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase.</a> Science. 239 (4839), 487-491 (1988).</li><li>Sun, Y., Sriramajayam, K., Luo, D., Liao, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Quick,+cost-free+method+of+purification+of+dna+fragments+from+agarose+gel.">A Quick, cost-free method of purification of dna fragments from agarose gel.</a> Journal of Cancer. 3, 93-95 (2012).</li><li>Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+sequencing+with+chain-terminating+inhibitors.">DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12), 5463-5467 (1977).</li><li>Bertani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+Lysogenesis+I.+The+mode+of+phage+liberation+by+lysogenic+Eschericia+coli.">Studies on Lysogenesis I. The mode of phage liberation by lysogenic Eschericia coli.</a> Journal of Bacteriolgy. 62 (3), 293-300 (1951).</li><li>Koncz, C., Martini, N., Szabados, L., Hrouda, M., Bachmair, A., Schell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specialized+vectors+for+gene+tagging+and+expression+studies.">Specialized vectors for gene tagging and expression studies.</a> Plant Molecular Biology Manual. , 53-74 (1994).</li><li>Weigel, D., Glazebrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+Agrobacterium+using+electroporation.">Transformation of Agrobacterium using electroporation.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (30), (2006).</li><li>Murray, M. G., Thompson, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+high+molecular+weight+plant+DNA.">Rapid isolation of high molecular weight plant DNA.</a> Nucleic Acids Research. 8 (19), 4321-4326 (1980).</li><li>Inan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salt+cress.+a+halophyte+and+cryophyte+Arabidopsis+relative+model+system+and+its+applicability+to+molecular+genetic+analyses+of+growth+and+development+of+extremophiles.">Salt cress. a halophyte and cryophyte Arabidopsis relative model system and its applicability to molecular genetic analyses of growth and development of extremophiles.</a> Plant Physiol. 135 (3), 1718-1737 (2004).</li><li>Ghedira, R., De Buck, S., Nolf, J., Depicker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+efficiency+of+Arabidopsis+thaliana+floral+dip+transformation+is+determined+not+only+by+the+Agrobacterium+strain+used+but+also+by+the+physiology+and+the+ecotype+of+the+dipped+plant.">The efficiency of Arabidopsis thaliana floral dip transformation is determined not only by the Agrobacterium strain used but also by the physiology and the ecotype of the dipped plant.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 26 (7), 823-832 (2013).</li><li>Shaohong, F. U., Xianya, W. E. I., Yingze, N. I. U., Shixing, G. U. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+Brassica+napus+with+the+method+of+floral-dip.">Transformation of Brassica napus with the method of floral-dip.</a> Biotechnology: Genomics and Its Applications. , 45-49 (2005).</li><li>Li, J., Tan, X., Zhu, F., Guo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+simple+method+for+Brassica+napus+floral-dip+transformation+and+selection+of+transgenic+plantlets.">A rapid and simple method for Brassica napus floral-dip transformation and selection of transgenic plantlets.</a> International Journal of Biology. 2 (1), 127 (2010).</li><li>Li, H. Q., Xu, J., Chen, L., Li, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+an+efficient+Agrobacterium+tumefaciens-mediated+leaf+disc+transformation+of+Thellungiella+halophila.">Establishment of an efficient Agrobacterium tumefaciens-mediated leaf disc transformation of Thellungiella halophila.</a> Plant Cell Reports. 26 (10), 1785-1789 (2007).</li><li>Wu, G., Rossidivito, G., Hu, T., Berlyand, Y., Poethig, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traffic+lines:+New+tools+for+genetic+analysis+in+Arabidopsis+thaliana.">Traffic lines: New tools for genetic analysis in Arabidopsis thaliana.</a> Genetics. 200 (1), 35-45 (2015).</li></ol>

מצב פיזיולוגי של הצמח משפיע באופן משמעותי את היעילות של טרנספורמציה25. שימוש בצמחים בריא וחסון לשינוי היא דרישה מרכזית לשינוי מוצלח ב ס parvula. מים או צמחים הדגיש האור יהיה פחות פרחים לעומת הצמחים בריא אידיאלי עבור טרנספורמציה (איור 1, במרכז החלונית). Parvula ס ...

ב פרוטוקול זה, אנו מתארים את הצמיחה ואת הקמת קווי הטרנסגניים יציבה עבור דגם extremophyte Schrenkiella parvula. הזמינות של מערכת יעילה השינוי מהווה סימן היכר של כל דגם גנטי רב תכליתי. צמחים לשגשג בסביבות קיצוניות, התייחס כמו extremophytes, לספק משאב קריטי להבנת צמח עיבודים מושם סביבתיים. Schrenkiella parvula (לשעבר Thellungiella parvula , Eutrema parvulum) הוא אחד דגם extremophyte כזה, עם הרחבת משאבי גנומית1,2,3,4,5. עם זאת, השינוי פרוטוקולים לא עדיין דווחו עבור ס parvula במחקרים שפורסמו.
הגנום של parvula ס הוא הגנום extremophyte שפורסמו הראשון ב מצליבים (חרדל-כרוב משפחה) ומראה של synteny גנום הכוללת נרחב עם המודל הלא-extremophyte, תודרנית לבנה1. לכן, מחקרים השוואתיים בין לבנה א ס parvula יכול להפיק תועלת העושר של מחקרים גנטיים מתבצע על לבנה א לעשות השערות אינפורמטיבי על איך הגנום S. parvula יש התפתחו ומוסדרת אחרת להתמודד עם קיצוני סביבתי מדגיש5,6,7. ס parvula היא אחת ביותר מלח-סובלנית מינים (מבוסס על אדמת NaCl LD50) בין קרובי משפחה פראי ידועה של לבנה א8. בנוסף הסובלנות NaCl, ס parvula שורד, משלים את מחזור החיים שלו בנוכחות יונים מרובים מלח בריכוזים גבוהים רעיל צמחים רוב7. בתגובה הלחצים והאביוטיים שכיחה בבית גידולו הטבעי, זה התפתח תכונות שונות, ביניהם כמה נחקרו ביוכימית או פיזיולוגיים רמה 8,9,10, 11.
מאז 2010, היו מעל 400 פרסומים עמיתים-reveiwed ס parvula כמין היעד או השתמש בה השוואה עם הגנום צמחים אחרים. עם זאת, צוואר בקבוק ברור יכול להיות מזוהה עם מבט מקרוב של איזה סוג של מחקרים נערכו. הרוב המכריע של דוחות אלה לדבר על פוטנציאל השימוש parvula ס במחקרים עתידיים או להשתמש בו השוואתי גנומית או לימודים phylogenomic. בגלל העדר פרוטוקול הוכחה הרעיון טרנספורמציה הוקמה עבור S. parvula, זה לא נעשה שימוש במחקרים גנומית פונקציונלי, למרות שיש לאחד הגנומים הצמח באיכות הגבוהה ביותר זמין עד כה (> 5 מגהבייט contig N50) התאספו ו מבואר pseudomolecules ברמת כרומוזום1.
השיטה בתיווך Agrobacterium טרנספורמציה פרחוני-מח ש הפך השיטה באופן כללי ביותר בשימוש כדי ליצור קווים trasngenic לבנה א, הפיתוח של מערכת לשחזור של השינוי היה גורם קריטי להצלחתו בתור מודל גנטי12,13. עם זאת, לא כל המינים מצליבים הוכחו להיהפך בהצלחה באמצעות השיטה פרחוני-מח ש שפותחו עבור לבנה א. . במיוחד, המין השני לשושלת מצליבים הכוללים parvula ס כבר הסרבן פרחוני-מח ש טרנספורמציה המבוססת על שיטות14,15.
ההרגל צמיחה פריחה ייווצרו ס parvula, בשילוב עם מורפולוגיה עלים צרים שלה עשה את זה מאתגר לאמץ את השיטה טרנספורמציה פרחוני-מח ש בתיווך Agrobacterium רגיל. במחקר זה, אנו מדווחים על פרוטוקול ששונה שפיתחנו לשינוי לשחזור ס parvula.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1303px;" width="1302">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Agar</td>
			<td style="width:293px;">VWR International, Radnor, PA</td>
			<td style="width:127px;">90000-762</td>
			<td style="width:541px;">Bacto Agar Soldifying Agent, BD Diagnostics</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B5 vitamins</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>G1019</td>
			<td>Gamborg&#8217;s Vitamin Solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Desiccant</td>
			<td>W A Hammond Drierite, Xenia, OH</td>
			<td style="width:127px;">22005</td>
			<td>Indicating DRIERITE 6 mesh</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:341px;">Destination vector for plant transformation</td>
			<td>TAIR</td>
			<td style="width:127px;">Vector:6531113857</td>
			<td>pKGWFS7</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Electroporation cuvette</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>9104-5050</td>
			<td>Electroporation cuvette, round cap, 0.2 cm gap</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Electroporator</td>
			<td>BIO-RAD Laboratories, Hercules, CA</td>
			<td>1652100</td>
			<td>MicroPulser Electroporator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fertilizer beads</td>
			<td>Osmocote Garden, Marysville, OH</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Osmocote Smart-Release Plant Food&#160;Flower &#38; Vegetable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gel extraction kit</td>
			<td>iNtRON Biotechnology, Boston, MA</td>
			<td>17289</td>
			<td>MEGAquick-spin Total fragment DNA purification kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gentamicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>G1914-5G</td>
			<td>Gentamicin sulfate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Glufosinate-ammonium (11.3%) herbicide (BASTA)</td>
			<td>Bayer environmental science, Montvale, NJ</td>
			<td>N/A</td>
			<td>FINALE herbicide</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kanamycin</td>
			<td>VWR International, Radnor, PA</td>
			<td>200004-444</td>
			<td>Kanamycin monosulfate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MES</td>
			<td>Bioworld, Dublin, OH</td>
			<td>41320024-2</td>
			<td>MES, Free Acid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MS salt</td>
			<td>MP Biomedicals, Santa Anna, CA</td>
			<td>092621822</td>
			<td>Hoagland&#39;s modified basal salt mixture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N6-benzylaminopurine (BA)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>B3274</td>
			<td>6-Benzylaminopurine solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td>Sigma-Alrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>Sodium chloride</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Non-ionic detergent</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td>TWEEN 20&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Plasmid isolation kit</td>
			<td>Zymo Research, Irvine, CA</td>
			<td>D4036</td>
			<td>Zyppy Plasmid Kits</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinase enzyme mix kit</td>
			<td>Life Technology</td>
			<td>11791-020</td>
			<td>Gateway LR Clonase II Enzyme mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rifampicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>R3501-1G</td>
			<td>Rifampicin, powder, &#62;= 97% (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Shaking incubator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>SHKE4450</td>
			<td>MaxQ 4450 Benchtop Orbital Shakers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Soil mix</td>
			<td>Sun Gro</td>
			<td>SUN239223328CFLP</td>
			<td>Sun Gro Metro-Mix 360 Grower Mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spectinomycin</td>
			<td>VWR International, Radnor, PA</td>
			<td>IC15206705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile 50ml conical tubes</td>
			<td>USA Scientific, Ocala, FL</td>
			<td>1500-1811</td>
			<td>50 ml conical screw cap tubes, copolymer, racks, sterile</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sucrose</td>
			<td>VWR International, Radnor, PA</td>
			<td>57-50-1</td>
			<td>Sucrose, ACS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Surfactant solution</td>
			<td>Lehle seeds, Round Rock, TX</td>
			<td>VIS-02</td>
			<td>Silwet L-77</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Topoisomerase-based cloning kit</td>
			<td>Life Technologies, Carlsbad, CA</td>
			<td>K240020</td>
			<td>pENTR/D-TOPO Cloning Kit, with One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tryptone</td>
			<td>VWR International, Radnor, PA</td>
			<td>90000-282</td>
			<td>BD Bacto Tryptone, BD Biosciences</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast Extract</td>
			<td>VWR International, Radnor, PA</td>
			<td>90000-722&#160;</td>
			<td>BD Bacto Yeast Extract, BD Biosciences</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

plant growth and agrobacterium-mediated floral-dip transformation of the extremophyte schrenkiella parvula

Schrenkiella parvula הוא extremophyte הותאם מושם והאביוטיים שונים, כולל לחצים רעילות יון מרובים. למרות באיכות גבוהה גנומית המשאבים הזמינים כדי ללמוד איך הצמחים להתאים הסביבה מדגיש, ערכו כמודל גנומיקה תפקודית, כלי הגביל היעדרה של מערכת שינוי ריאלי. ב פרוטוקול זה, אנחנו לדווח על איך ליצור יציבה הטרנסגניים ס parvula קווים באמצעות שיטת פרחוני-מח ש בתיווך Agrobacterium. לשנות את פרוטוקול טרנספורמציה המשמש לבנה א עבור התכונות הייחודיות של S. parvula, כגון של הרגל פריחה ייווצרו ותוכן שעווה epicuticular גבוהה על עלים. בקצרה, ס parvula זרעים היו מרובדת ב 4 מעלות צלזיוס למשך חמישה ימים לפני השתילה. הצמחים גדלו ב- photoperiod אור 14 h ואת כהה 10שע 130 µmol מ'-2s-1 עוצמת אור, ב- 22 ° C עד 24 ° C. 8-9 צמחים בת שבוע עם התפרחות מרובות נבחרו לשינוי. התפרחות אלה היו טבולים ב פתרון חדירה של Agrobacterium tumefaciens GV3101, נושאת את פלסמיד pMP90RK . ביצענו שני סיבובים של פרח טובלים במרווח של 3-4 שבועות כדי להגביר את היעילות טרנספורמציה. הזרעים T1 היו נאספים, יבשים במשך ארבעה שבועות במיכל עם desiccants לפני הנביטה עבור המועמד מסך טרנספורמציה קווים. התנגדות באסטה שימש למסך T1 צמחים. ריססנו את הפתרון באסטה שלוש פעמים במרווח של שלושה ימים, החל מ- שני צמחים בת שבוע כדי לצמצם את תוצאות חיוביות שגויות. מבחן טיפה באסטה בוצעה ב ששרדו צמחים בודדים כדי לזהות נכון transformants חיובי. היעילות השינוי היה 0.033%, מניב 3-4 הצמחים הטרנסגניים לכל 10,000 זרעים T1 מופצות.

פיתחנו פרוטוקול טרנספורמציה המאפשרת קציר של T0 זרעים בתוך 150 ימים, באמצעות שיטה פרחוני-מח ש שונה מזו עבור לבנה א. איור 1 מציג סיכום של ציר זמן, ס parvula צמחים המייצגים את הבמה אופטימלית עבור ביצוע השינוי דרך פרחוני-מח ש. בחרנו ס parvula צמחים עם ...

Watch this Scientific Journal Video about Plant Growth and Agrobacterium-mediated Floral-dip Transformation of the Extremophyte Schrenkiella parvula at JoVE.com

Plant Growth and Agrobacterium-mediated Floral-dip Transformation of the Extremophyte Schrenkiella parvula

צמח צמיחה ושינוי בתיווך Agrobacterium פרחוני-מח ש של Extremophyte Schrenkiella parvula

שינוי בתיווך Agrobacterium באמצעות שיטת פרחוני-מח ש יכול להיות מועסק בהצלחה כדי ליצור שורות הטרנסגניים יציב של המודל extremophyte Schrenkiella parvula. אנו מציגים פרוטוקול שונה מזו עבור תודרנית לבנה, בהתחשב גידול שונים והרגלי הפיזיולוגיות של extremophyte.

Schrenkiella parvula is an extremophyte adapted to various abiotic stresses, including multiple ion toxicity stresses. Despite high-quality genomic ...

שיטה זו, פרוטוקול טרנספורמציה לשחזור עבור Parvula Schrenkiella, יכול לעזור לענות על שאלות בתחום הגנום השוואתי ותפקודי של צמחים, במיוחד מחקרים החוקרים התאמות צמחים לסביבות קשות. טכניקה זו מאפשרת חקירות של תפקודים שגרתיים ב Parvula Schrenkiella על extremophyte מותאם לחצים מלח רב יון. הוא גם מאפשר מחקרים השוואתיים אשר גם מסתכל קרוב משפחה שלה, ההורה האם Aribidopsis Thaliana.השוואת שרנקיאלה פרבולה לארבידופסיס תאליאנה יכולה לספק תובנות על שונות בוויסות גנים ותפקוד המאפשרים התאמה ייחודית של פרבולה שרנקילה. פרוטוקול השינוי של ערבידופסיס תאליאנה כבר היה מבוסס היטב. השיטה מאפשרת כיום מחקרים השוואתיים באמצעות צמחי שרנקיאלה פרבולה מהודרים.בדרך כלל חוקרים חדשים בשיטה זו יתקשו בגלל הרגל הפריחה ומורפולוגיה עלה של צמחים Schrenkiella Parvula אשר עושים טרנספורמציה יעילה באמצעות מטבל פלורה, כמו גם את הבחירה של טרנספורמנטים אמיתיים קשה. כדי להתחיל, להשתמש קיסם רטוב להעביר על 20 כדי 25 זרעי S.Parvula על אדמה רטובה. ואז לשכבות את הזרעים בארבע מעלות צלזיוס במשך חמישה עד שבעה ימים.לאחר ריבוד, להחזיר את הזרעים לתא הצמיחה במשך שבעה עד 10 ימים. לאחר שכל השתילים נבטו, השאירו רק שתיל אחד בכל אחת מארבע הפינות ובמרכז הסירים. לגדל את הצמחים במשך שמונה עד 10 שבועות בתא הצמיחה עד שהם פורחים.ביום השינוי, בחר צמחי S.Parvula בהתאם לפרוטוקול הטקסט. השתמש מדפים ומספריים קטנים כדי להסיר את כל תפרחות מאביק כי הם כבר מתפתחים לתוך סיליק. לאחר שהצמחים מוכנים, הכינו פתרון חדירה לאגרובקטריום.לאחר מכן, לטבול את תפרחת S.Parvula בתספורת חדירת אגרובקטריום במשך 20 שניות. מוצג כאן הוא השלב המוקדם ביותר של הצמחים שניתן להשתמש בהם עבור טרנספורמציה, כל עוד סיליקות שפותחו כבר מוסרים לפני השינוי, צמחים ישנים עם פרחים נוספים ניתן להשתמש. לאחר השינוי, מניחים צמחים טבולים פרחים אופקית במגשים נקיים עם כיפות כדי לכסות את הצמחים.ואז למקם את הצמחים בחדר צמיחה חשוך במשך יום עד יומיים. מחזירים את הצמחים למצב זקוף ומעבירים אותם לחדר הצמיחה. בשבוע שלאחר מכן, לפקח על תפרחות טבולות.עשרה ימים לאחר המטבל הפרחוני הראשון, צמחי S.Parvula ימשיכו לייצר תפרחות וסיליקות חדשות. סיבוב שני של מטבל פרחוני יכול להתבצע כדי להפוך עוד יותר את תפרחות המתעוררים החדשים. לגדל את הצמחים עד זרעים להתבגר, לקצור את הזרעים סביב 21 שבועות.יבש את הזרעים במשך שבועיים עד שלושה שבועות בטמפרטורת החדר במיכל אטום מלא התייבשות. לשתול את T אחד זרעים על פי פרוטוקול הטקסט. לגדל את הצמחים עד שני עד שלושה עלים אמיתיים הראשונים לפתח.כדי לבצע את הבחירה הראשונה עבור עמידות קוטל עשבים, לדלל קוטל עשבים אמוניום glufosinate לרסס אותו על השתילים. כסו את השתילים עם הכיפות במשך הלילה. תחזיר את המגשים לחדר הגידול, ותסיר את הכיפה.המתן עד שרוב השתילים ייבחרו על ידי קוטל עשבים. כדי להתחיל את הבחירה השנייה, לזהות את הצמחים ששרדו לאחר ריסוס שלוש עד ארבע פעמים עם פתרון BASTA. לאחר גידול הצמחים במשך שבועיים עד שלושה שבועות נוספים, בחר את העלה הבוגר הגדול ביותר על כל צמח.הבא לשפשף את פני השטח של העלה בעדינות עם אצבע כדי להסיר את שכבת השעווה. ואז למקם טיפה של פתרון BASTA מדולל על העלה. לפקח על העלים שטופלו עם פתרון BASTA לסימנים של נבול עד שבוע.לבסוף בחר את הצמחים עם עלים מושפעים על ידי טיפות BASTA לניתוח נוסף. בפרוטוקול זה, S.Parvula השתנה עם אגרובקטריום בשיטת טבילה פרחונית. זיהום עם אגרובקטריום הביא הפלה של כמה פרחים.עם זאת הצמחים S.Parvula המשיכו לייצר פרחים חדשים לאחר טבילת הפרח הראשונה, והוא יכול להשתנות שוב. באמצעות בדיקות תרסיס ושחרור של BASTA, ניתן לזהות במדויק טרנספורמנטים חיוביים אמיתיים. ניתן להפחית את מספר הדגימות שנבדקו באמצעות אישור PCR.בעוד שיטה זו דומה לשינוי של Arabidopsis Thaliana, חשוב לזכור את ההבדלים בצמיחה ומורפולוגיה של שרנקיאלה Parvula. שינוי הפרוטוקול כדי לשקף הבדלים אלה הוא קריטי לשינוי מוצלח. טכניקה זו יכולה לעזור לחוקרים לחקור את האבולוציה של וריאציות גנומיות המוביל התאמות מתח מלח מרובים במודל extremophyte, שרנקיאלה Parvula.שילוב טכניקה זו עם המידע על הפונקציות של Aradopsis Thaliana, צמח נוסף הקשורים קשר הדוק שרנקיאלה Parvula. חוקרים יכולים לחקור את הווריאציות ברגולציה ובפונקציות כי אלה שני מבנים נפרדים בין שני מינים אלה. במהלך תהליך הטרנספורמציה, חשוב להכיל את כל פתרון חדירת האגרובקטריום במיכלים autoclaveable.יש לעקר ולהשליך בבטחה את כל החומרים שבאו במגע עם אגרובקטריום הכולל כפפות, טיפים לפיפיט מאקרו ומגבות נייר.

Research

JoVE Journal

Genetics

Plant Growth and Agrobacterium-mediated Floral-dip Transformation of the Extremophyte Schrenkiella parvula

A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation

פלטפורמה רובוטית עבור תפוקה גבוהה בידוד פרוטופלאסט וההשנאה

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal ...

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

מניפולציה גנטית של פתוגן הצמח<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; ללמוד ביולוגיה פטרייתי אינטראקציות חיידק צמח

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

The Use of Induced Somatic Sector Analysis (ISSA) for Studying Genes and Promoters Involved in Wood Formation and Secondary Stem Development

The Use of Induced Somatic Sector Analysis ISSA for Studying Genes and Promoters Involved in Wood Formation and Secondary Stem Development

השימוש בניתוח מגזר סומטיים מושרה (ISSA) לימוד גנים ומקדמי המעורבים ביצירת עץ ופיתוח גזע משניים

Secondary stem growth in trees and associated wood formation are significant both from biological and commercial perspectives. However, relatively little ...

Rapid Deletion Production in Fungi via Agrobacterium Mediated Transformation of OSCAR Deletion Constructs

Rapid Deletion Production in Fungi via Agrobacterium Mediated Transformation of OSCAR Deletion Constructs

הפקה מהירה מחיקת פטריות דרך<em&gt; Agrobacterium</em&gt; שינוי מתווך של OSCAR מחיקת מבנים

Precise deletion of gene(s) of interest, while leaving the rest of the genome unchanged, provides the ideal product to determine that particular ...

Assessment of DNA Contamination in RNA Samples Based on Ribosomal DNA

הערכה של ה-DNA זיהום בדגימות ה-RNA בהתבסס על Ribosomal DNA

One method extensively used for the quantification of gene expression changes and transcript abundances is reverse-transcription quantitative real-time ...

Purification of High Molecular Weight Genomic DNA from Powdery Mildew for Long-Read Sequencing

טיהור של ה- DNA הגנומי משקל מולקולרי גבוה מ אבקתי טחב על רצף ארוך לקריאה

The powdery mildew fungi are a group of economically important fungal plant pathogens. Relatively little is known about the molecular biology and genetics ...

Optimization and Comparative Analysis of Plant Organellar DNA Enrichment Methods Suitable for Next-generation Sequencing

מיטוב וניתוח השוואתי של הצמח DNA Organnelar העשרה שיטות מתאים עבור הדור הבא רצף

Plant organellar genomes contain large, repetitive elements that may undergo pairing or recombination to form complex structures and/or sub-genomic ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

DNA חזקים בידוד ובנייה ספריית רצף תפוקה גבוהה עבור דגימות עשבייה

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

לחקור את השורש Microbiome: שליפת נתונים הקהילה חיידקי מן האדמה, Rhizosphere, Endosphere שורש

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

Discrimintion and Mapping of the Primary and Processed Transcripts in Maize Mitochondrion Using a Circular RT-PCR-based Strategy

דיסקציה ומיפוי של התעתיקים הראשוניים והמעובדים בתירס מיטוכונטריון שימוש באסטרטגיה מעגלית-PCR המבוססת על מעגלי

In plant mitochondria, some steady-state transcripts have 5&#39; triphosphate derived from transcription initiation (primary transcripts), while the ...