Name: plant growth and agrobacterium-mediated floral-dip transformation of the extremophyte schrenkiella parvula
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
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Questo lavoro è stato supportato da un premio della National Science Foundation 1616827 MCB.

1. pianta crescita
<ol><li>
Sterilizzazione di seme (opzionale)
	<ol>
<li>Preparare 50% candeggina in acqua bidistillata (ddH2O) con 1 o 2 gocce di un detergente non ionico (Vedi Tabella materiali) in una provetta da 50 mL. Capovolgere la provetta diverse volte per miscelare la soluzione. Nota: È preferibile effettuare la sterilizzazione di seme in un flusso laminare con una superficie di UV sterilizzata per 15 min.</li>
		<li>Aggiungere la soluzione di ...

<ol>
	<li>Dassanayake, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+of+the+extremophile+crucifer+Thellungiella+parvula.">The genome of the extremophile crucifer Thellungiella parvula.</a> Nature Genetics. 43 (9), 913-918 (2011).</li><li>Oh, D. -. H., Dassanayake, M., Bohnert, H. J., Cheeseman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+at+the+extreme:+lessons+from+the+genome.">Life at the extreme: lessons from the genome.</a> Genome Biology. 13 (3), 241 (2012).</li><li>Whited, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Next+Top+Models.">The Next Top Models.</a> Cell. 163 (1), 18-20 (2015).</li><li>Dassanayake, M., Yun, D. O. D., Bressan, R. A., Cheeseman, J. M., Bohnert, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+scope+of+things+to+come:+New+paradigms+in+biotechnology.">The scope of things to come: New paradigms in biotechnology.</a> Plant Biotechnology and Agriculture: Prospects for the 21st Century. , 19-34 (2009).</li><li>Dittami, S. M., Tonon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomes+of+extremophile+crucifers:+New+platforms+for+comparative+genomics+and+beyond.">Genomes of extremophile crucifers: New platforms for comparative genomics and beyond.</a> Genome Biology. 13 (8), 166 (2012).</li><li>Amtmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Learning+from+evolution:+Thellungiella+generates+new+knowledge+on+essential+and+critical+components+of+abiotic+stress+tolerance+in+plants.">Learning from evolution: Thellungiella generates new knowledge on essential and critical components of abiotic stress tolerance in plants.</a> Molecular Plant. 2 (1), 3-12 (2009).</li><li>Oh, D. -. H., Hong, H., Lee, S. Y., Yun, D. -. J., Bohnert, H. J., Dassanayake, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+structures+and+transcriptomes+signify+niche+adaptation+for+the+multiple-ion-tolerant+extremophyte+Schrenkiella+parvula.">Genome structures and transcriptomes signify niche adaptation for the multiple-ion-tolerant extremophyte Schrenkiella parvula.</a> Plant Physiology. 164 (4), 2123-2138 (2014).</li><li>Orsini, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+salt+tolerance+parameters+in+11+wild+relatives+of+Arabidopsis+thaliana.">A comparative study of salt tolerance parameters in 11 wild relatives of Arabidopsis thaliana.</a> Journal of Experimental Botany. 61 (13), 3787-3798 (2010).</li><li>Uzilday, B., Ozgur, R., Sekmen, A. H., Yildiztugay, E., Turkan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+alternative+electron+sinks+and+antioxidant+defence+in+chloroplasts+of+the+extreme+halophyte+Eutrema+parvulum+(Thellungiella+parvula)+under+salinity.">Changes in the alternative electron sinks and antioxidant defence in chloroplasts of the extreme halophyte Eutrema parvulum (Thellungiella parvula) under salinity.</a> Annals of Botany. 115 (3), 449-463 (2015).</li><li>Teusink, R. S., Rahman, M., Bressan, R. A., Jenks, M. 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F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Floral+dip:+A+simplified+method+for+Agrobacterium-mediated+transformation+of+Arabidopsis+thaliana.">Floral dip: A simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.</a> Plant Journal. 16 (6), 735-743 (1998).</li><li>Koornneef, M., Meinke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+Arabidopsis+as+a+model+plant.">The development of Arabidopsis as a model plant.</a> Plant Journal. 61 (6), 909-921 (2010).</li><li>Bai, J., Wu, F., Mao, Y., He, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+planta+transformation+of+Brassica+rapa+and+B.+napus+via+vernalization-infiltration+methods.">In planta transformation of Brassica rapa and B. napus via vernalization-infiltration methods.</a> Protocol Exchange. 10, 1028 (2013).</li><li>Sparrow, P. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Quick,+cost-free+method+of+purification+of+dna+fragments+from+agarose+gel.">A Quick, cost-free method of purification of dna fragments from agarose gel.</a> Journal of Cancer. 3, 93-95 (2012).</li><li>Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+sequencing+with+chain-terminating+inhibitors.">DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12), 5463-5467 (1977).</li><li>Bertani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+Lysogenesis+I.+The+mode+of+phage+liberation+by+lysogenic+Eschericia+coli.">Studies on Lysogenesis I. The mode of phage liberation by lysogenic Eschericia coli.</a> Journal of Bacteriolgy. 62 (3), 293-300 (1951).</li><li>Koncz, C., Martini, N., Szabados, L., Hrouda, M., Bachmair, A., Schell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specialized+vectors+for+gene+tagging+and+expression+studies.">Specialized vectors for gene tagging and expression studies.</a> Plant Molecular Biology Manual. , 53-74 (1994).</li><li>Weigel, D., Glazebrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+Agrobacterium+using+electroporation.">Transformation of Agrobacterium using electroporation.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (30), (2006).</li><li>Murray, M. G., Thompson, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+high+molecular+weight+plant+DNA.">Rapid isolation of high molecular weight plant DNA.</a> Nucleic Acids Research. 8 (19), 4321-4326 (1980).</li><li>Inan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salt+cress.+a+halophyte+and+cryophyte+Arabidopsis+relative+model+system+and+its+applicability+to+molecular+genetic+analyses+of+growth+and+development+of+extremophiles.">Salt cress. a halophyte and cryophyte Arabidopsis relative model system and its applicability to molecular genetic analyses of growth and development of extremophiles.</a> Plant Physiol. 135 (3), 1718-1737 (2004).</li><li>Ghedira, R., De Buck, S., Nolf, J., Depicker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+efficiency+of+Arabidopsis+thaliana+floral+dip+transformation+is+determined+not+only+by+the+Agrobacterium+strain+used+but+also+by+the+physiology+and+the+ecotype+of+the+dipped+plant.">The efficiency of Arabidopsis thaliana floral dip transformation is determined not only by the Agrobacterium strain used but also by the physiology and the ecotype of the dipped plant.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 26 (7), 823-832 (2013).</li><li>Shaohong, F. U., Xianya, W. E. I., Yingze, N. I. U., Shixing, G. U. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+Brassica+napus+with+the+method+of+floral-dip.">Transformation of Brassica napus with the method of floral-dip.</a> Biotechnology: Genomics and Its Applications. , 45-49 (2005).</li><li>Li, J., Tan, X., Zhu, F., Guo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+simple+method+for+Brassica+napus+floral-dip+transformation+and+selection+of+transgenic+plantlets.">A rapid and simple method for Brassica napus floral-dip transformation and selection of transgenic plantlets.</a> International Journal of Biology. 2 (1), 127 (2010).</li><li>Li, H. Q., Xu, J., Chen, L., Li, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+an+efficient+Agrobacterium+tumefaciens-mediated+leaf+disc+transformation+of+Thellungiella+halophila.">Establishment of an efficient Agrobacterium tumefaciens-mediated leaf disc transformation of Thellungiella halophila.</a> Plant Cell Reports. 26 (10), 1785-1789 (2007).</li><li>Wu, G., Rossidivito, G., Hu, T., Berlyand, Y., Poethig, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traffic+lines:+New+tools+for+genetic+analysis+in+Arabidopsis+thaliana.">Traffic lines: New tools for genetic analysis in Arabidopsis thaliana.</a> Genetics. 200 (1), 35-45 (2015).</li></ol>

Lo stato fisiologico della pianta influenza significativamente l'efficienza di trasformazione25. L'utilizzo di piante sane e vigorose per trasformazione è un requisito chiave per la trasformazione di successo in S. parvula. Acqua o luce piante stressati avrà meno fiori rispetto alle piante sane ideale per la trasformazione (Figura 1, pannello centrale). S. parvula può crescere con un'intensità di luce inferiore a 130 µmol m-2 s-1...

In questo protocollo, descriviamo la crescita e la creazione di linee transgeniche stabili per il modello extremophyte Schrenkiella parvula. La disponibilità di un sistema efficiente trasformazione è un marchio di garanzia di qualsiasi modello genetico versatile. Piante che prosperano in ambienti estremi, di cui come extremophytes, fornire una risorsa fondamentale per comprendere gli adattamenti della pianta agli stress ambientali. Schrenkiella parvula (precedentemente Thellungiella parvula ed Eutrema parvulum) è uno di questi modelli extremophyte, con espansione risorse genomiche1,2,3,4,5. Tuttavia, protocolli di trasformazione non sono ancora stati segnalati per S. parvula negli studi pubblicati.
Il genoma di S. parvula è il primo genoma di extremophyte pubblicato in Brassicaceae (famiglia senape-cavolo) e Mostra un'ampia sintenia genoma globale con il modello di non-extremophyte, Arabidopsis thaliana1. Così, gli studi comparativi tra a. thaliana e S. parvula potrebbero beneficiare della ricchezza di studi genetici su a. thaliana formulare delle ipotesi ben informativi su come si è evoluto e regolato il genoma di s. parvula in modo diverso per affrontare estremi ambientali sottolinea5,6,7. S. parvula è una delle specie più sale-tolleranti (basati su terreno NaCl LD50) tra parenti selvatici noti di a. thaliana8. Oltre la tolleranza di NaCl, S. parvula sopravvive e completa il suo ciclo di vita in presenza di ioni più sale alle alte concentrazioni tossiche per la maggior parte delle piante7. In risposta agli stress abiotici prevalente nel suo habitat naturale, si sono evoluto varie caratteristiche, tra cui molti sono stati studiati i biochimici o fisiologico livello 8,9,10, 11.
Dal 2010, ci sono state oltre 400 pubblicazioni peer-reveiwed utilizzato S. parvula come specie bersaglio o in un confronto con altri genomi delle piante. Tuttavia, un collo di bottiglia chiaro potrebbe essere identificato con uno sguardo più attento di che tipo di studi sono stati condotti. La maggior parte di questi rapporti discuterà l'uso potenziale di S. parvula negli studi futuri o utilizzarlo in genomica comparativa o phylogenomic studi. A causa della mancanza di un protocollo di proof-of-concept trasformazione stabilito per S. parvula, non è stato utilizzato in studi di genomica funzionale, pur avendo uno dei genomi di pianta più alti di qualità ad oggi disponibili (> 5 Mb contig N50) assemblato e annotato in pseudomolecules livello del cromosoma1.
Il metodo di trasformazione mediata da Agrobacterium di floreale-dip è diventato il metodo più ampiamente usato per creare linee di trasngenic in a. thaliana, e lo sviluppo di un sistema riproducibile di trasformazione era un fattore critico di successo come un modello genetico12,13. Tuttavia, non tutte le specie di Brassicaceae hanno dimostrate di essere trasformata con successo utilizzando il metodo floreale-dip sviluppato per a. thaliana. Appositamente, la specie di Brassicaceae Lineage II che includono S. parvula è stato ricalcitrante a trasformazione base floreale-dip metodi14,15.
L'abitudine di crescita indeterminato fioritura di S. parvula, combinato con la sua morfologia foglia stretta ha reso impegnativo di adottare il metodo standard mediata da Agrobacterium floreale-tuffo trasformazione. In questo studio, segnaliamo il protocollo modificato che abbiamo sviluppato per riproducibile trasformazione di S. parvula.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1303px;" width="1302">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Agar</td>
			<td style="width:293px;">VWR International, Radnor, PA</td>
			<td style="width:127px;">90000-762</td>
			<td style="width:541px;">Bacto Agar Soldifying Agent, BD Diagnostics</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B5 vitamins</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>G1019</td>
			<td>Gamborg&#8217;s Vitamin Solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Desiccant</td>
			<td>W A Hammond Drierite, Xenia, OH</td>
			<td style="width:127px;">22005</td>
			<td>Indicating DRIERITE 6 mesh</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:341px;">Destination vector for plant transformation</td>
			<td>TAIR</td>
			<td style="width:127px;">Vector:6531113857</td>
			<td>pKGWFS7</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Electroporation cuvette</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>9104-5050</td>
			<td>Electroporation cuvette, round cap, 0.2 cm gap</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Electroporator</td>
			<td>BIO-RAD Laboratories, Hercules, CA</td>
			<td>1652100</td>
			<td>MicroPulser Electroporator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fertilizer beads</td>
			<td>Osmocote Garden, Marysville, OH</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Osmocote Smart-Release Plant Food&#160;Flower &#38; Vegetable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gel extraction kit</td>
			<td>iNtRON Biotechnology, Boston, MA</td>
			<td>17289</td>
			<td>MEGAquick-spin Total fragment DNA purification kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gentamicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>G1914-5G</td>
			<td>Gentamicin sulfate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Glufosinate-ammonium (11.3%) herbicide (BASTA)</td>
			<td>Bayer environmental science, Montvale, NJ</td>
			<td>N/A</td>
			<td>FINALE herbicide</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kanamycin</td>
			<td>VWR International, Radnor, PA</td>
			<td>200004-444</td>
			<td>Kanamycin monosulfate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MES</td>
			<td>Bioworld, Dublin, OH</td>
			<td>41320024-2</td>
			<td>MES, Free Acid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MS salt</td>
			<td>MP Biomedicals, Santa Anna, CA</td>
			<td>092621822</td>
			<td>Hoagland&#39;s modified basal salt mixture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N6-benzylaminopurine (BA)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>B3274</td>
			<td>6-Benzylaminopurine solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td>Sigma-Alrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>Sodium chloride</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Non-ionic detergent</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td>TWEEN 20&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Plasmid isolation kit</td>
			<td>Zymo Research, Irvine, CA</td>
			<td>D4036</td>
			<td>Zyppy Plasmid Kits</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinase enzyme mix kit</td>
			<td>Life Technology</td>
			<td>11791-020</td>
			<td>Gateway LR Clonase II Enzyme mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rifampicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>R3501-1G</td>
			<td>Rifampicin, powder, &#62;= 97% (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Shaking incubator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>SHKE4450</td>
			<td>MaxQ 4450 Benchtop Orbital Shakers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Soil mix</td>
			<td>Sun Gro</td>
			<td>SUN239223328CFLP</td>
			<td>Sun Gro Metro-Mix 360 Grower Mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spectinomycin</td>
			<td>VWR International, Radnor, PA</td>
			<td>IC15206705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile 50ml conical tubes</td>
			<td>USA Scientific, Ocala, FL</td>
			<td>1500-1811</td>
			<td>50 ml conical screw cap tubes, copolymer, racks, sterile</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sucrose</td>
			<td>VWR International, Radnor, PA</td>
			<td>57-50-1</td>
			<td>Sucrose, ACS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Surfactant solution</td>
			<td>Lehle seeds, Round Rock, TX</td>
			<td>VIS-02</td>
			<td>Silwet L-77</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Topoisomerase-based cloning kit</td>
			<td>Life Technologies, Carlsbad, CA</td>
			<td>K240020</td>
			<td>pENTR/D-TOPO Cloning Kit, with One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tryptone</td>
			<td>VWR International, Radnor, PA</td>
			<td>90000-282</td>
			<td>BD Bacto Tryptone, BD Biosciences</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast Extract</td>
			<td>VWR International, Radnor, PA</td>
			<td>90000-722&#160;</td>
			<td>BD Bacto Yeast Extract, BD Biosciences</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

plant growth and agrobacterium-mediated floral-dip transformation of the extremophyte schrenkiella parvula

Schrenkiella parvula è un extremophyte adattato a diversi stress abiotici, tra cui molteplici sollecitazioni di tossicità dello ione. Nonostante alta qualità risorse genomiche disponibili per studiare come adattano le piante per ambientale sottolinea, suo valore come un modello di genomica funzionale e strumento è stata limitata dalla mancanza di un sistema di trasformazione fattibile. In questo protocollo, segnaliamo come generare transgenici stabile S. parvula linee utilizzando un metodo di floreale-dip mediata da Agrobacterium. Abbiamo modificato il protocollo di trasformazione usato per a. thaliana per rappresentare caratteristiche uniche di S. parvula, come un'abitudine di fioritura indeterminato e un contenuto di cere epicuticolari alta sulle foglie. In breve, S. parvula semi sono stati stratificati a 4 ° C per cinque giorni prima della piantatura. Piante sono state coltivate in un fotoperiodo di una luce 14h e 10 h scuro e un 130 µmol m-2s-1 intensità della luce, a 22 ° C a 24 ° C. Otto a nove settimane piante con infiorescenze multiple sono stati selezionati per la trasformazione. Queste infiorescenze sono stati immersi in una soluzione di infiltrazione di Agrobacterium tumefaciens GV3101 portando il plasmide pMP90RK . Abbiamo effettuato due giri del fiore di immersione con un intervallo di tre o quattro settimane per aumentare l'efficienza di trasformazione. I semi T1 sono stati raccolti e asciugati per quattro settimane in un contenitore con materiale essicante prima germinazione alla schermata per candidato trasformato le linee. Resistenza a BASTA era usata per selezionare piante T1. Abbiamo spruzzato la soluzione BASTA tre volte con un intervallo di tre giorni a partire da due settimana-vecchi impianti per ridurre i falsi positivi. È stata eseguita una prova di caduta BASTA sopravvivere singole piante per identificare il vero positivo trasformanti. L'efficienza di trasformazione era 0,033%, producendo piante transgeniche di 3 – 4 per 10.000 semi T1 propagate.

Abbiamo sviluppato un protocollo di trasformazione che consente la raccolta dei semi di T0 entro 150 giorni, utilizzando un metodo di floreale-dip modificato da quello di a. thaliana. La figura 1 Mostra un riepilogo della timeline e S. parvula piante che rappresentano la fase ottima per l'esecuzione della trasformazione attraverso floreale-dip. Abbiamo scelto S. parvula piante con fiori di 70 -80 in più infiorescenze a 6...

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Plant Growth and Agrobacterium-mediated Floral-dip Transformation of the Extremophyte Schrenkiella parvula

Pianta di crescita e trasformazione di Floral-dip mediata da Agrobacterium della Extremophyte Schrenkiella parvula

Trasformazione mediata da Agrobacterium utilizzando un metodo floreale-dip può essere impiegato con successo per creare linee transgeniche stabile del modello extremophyte Schrenkiella parvula. Vi presentiamo un protocollo modificato da quello per Arabidopsis thaliana, considerando le abitudini differenti di sviluppo e caratteristiche fisiologiche della extremophyte.

Schrenkiella parvula is an extremophyte adapted to various abiotic stresses, including multiple ion toxicity stresses. Despite high-quality genomic ...

Questo metodo, un protocollo di trasformazione riproducibile per Schrenkiella parvula, può aiutare a rispondere alle domande nel campo del genoming comparativo e funzionale delle piante, in particolare studi che studiano gli adattamenti delle piante ad ambienti difficili. Questa tecnica consente di ricercare le funzioni di routine nella Schrenkiella parvula sull'estremofita adattata alle sollecitazioni del sale multi-ionico. Consente anche studi comparativi che esaminano anche il suo parente stretto, il genitore madre Aribidopsis Thaliana.Confrontando Schrenkiella Parvula con Aribidopsis Thaliana può fornire informazioni sulle varianze nella regolazione e nella funzione genica che consentono l'adattamento unico della parvula di Schrenkiella. Il protocollo di trasformazione per Arabidopsis Thaliana è già ben consolidato. Il metodo consente ora studi comparativi utilizzando piante transgeniche di Schrenkiella Parvula.Generalmente i ricercatori nuovi a questo metodo faranno fatica a causa dell'abitudine alla fioritura e della morfologia delle foglie delle piante di Schrenkiella Parvula che rendono difficile una trasformazione efficace utilizzando un tuffo di flora e la selezione di veri trasformatori. Per iniziare, utilizzare uno stuzzicadenti bagnato per trasferire circa 20-25 semi di S.Parvula su terreno umido. Quindi stratificare i semi a quattro gradi Celsius per cinque o sette giorni.Dopo la stratificazione, riportare i semi nella camera di crescita per sette-10 giorni. Una volta germinate tutte le piantine, lasciare una sola piantina in ciascuno dei quattro angoli e al centro delle pentole. Coltiva le piante per otto o 10 settimane nella camera di crescita fino a quando non fioriscano.Il giorno della trasformazione, selezionare le piante di S.Parvula secondo il protocollo di testo. Utilizzare forcep e piccole forbici per rimuovere eventuali infiorescenze impollinati che si stanno già sviluppando in silique. Dopo che le piante sono pronte, preparare una soluzione di infiltrazione di agrobatteri.Successivamente, immergere l'infiorescenza S.Parvula nella soluzione di infiltrazione di agrobatteri per 20 secondi. Mostrato qui è la prima fase delle piante che possono essere utilizzate per la trasformazione, purché le silique già sviluppate siano rimosse prima della trasformazione, possono essere utilizzate piante più vecchie con più fiori. Dopo la trasformazione, posizionare le piante ippate in fiore orizzontalmente in vassoi puliti con cupole per coprire le piante.Quindi metti le piante in una stanza di crescita buia per uno o due giorni. Riportare le piante in posizione verticale e trasferirle nella sala di crescita. Nella settimana successiva, monitorare le infiorescenze i immersionate.Dieci giorni dopo il primo tuffo floreale, le piante di S.Parvula continuano a produrre nuove infiorescenze e silique. Un secondo giro di tuffo floreale può essere eseguito per trasformare ulteriormente le infiorescenze emergenti. Coltiva le piante fino a quando i semi maturano e raccogli i semi intorno a 21 settimane.Asciugare i semi per due o tre settimane a temperatura ambiente in un contenitore ermetico pieno di essiccanti. Piantare il T un seme secondo il protocollo di testo. Coltiva le piante fino a quando non si sviluppano le prime due o tre vere foglie.Per eseguire la prima selezione per la resistenza agli erbicidi, diluire l'erbicida di glufosinato ammonio e spruzzarlo sulle piantine. Coprire le piantine con le cupole durante la notte. Rimettere i vassoi nella sala di crescita e rimuovere la cupola.Attendere che la maggior parte delle piantine siano selezionate dall'erbicida. Per iniziare la seconda selezione, identificare le piante che sopravvivono dopo essere state spruzzate da tre a quattro volte con la soluzione BASTA. Dopo aver coltivato le piante per altre due o tre settimane, selezionare la foglia matura più grande su ogni pianta.Quindi strofinare delicatamente la superficie della foglia con un dito per rimuovere lo strato di cera. Quindi posizionare una goccia della soluzione BASTA diluita sulla foglia. Monitorare le foglie trattate con la soluzione BASTA per i segni di appassimento fino a una settimana.Infine selezionare le piante con foglie non influenzate dalle gocce BASTA per ulteriori analisi. In questo protocollo, S.Parvula è stata trasformata con agrobatterio utilizzando un metodo di immersione floreale. L'infezione da agrobatterio ha portato all'aborto di alcuni fiori.Tuttavia le piante di S.Parvula continuarono a produrre nuovi fiori dopo il primo tuffo di fiori, e potevano essere trasformate di nuovo. Utilizzando i test di spruzzatura e caduta BASTA, è possibile identificare con precisione i veri trasformatori positivi. Il numero di campioni testati utilizzando la conferma PCR può essere ridotto.Sebbene questo metodo sia simile alla trasformazione dell'Arabidopsis Thaliana, è importante ricordare le differenze di crescita e morfologia di Schrenkiella Parvula. La modifica del protocollo per riflettere queste differenze è fondamentale per una trasformazione riuscita. Questa tecnica potrebbe aiutare i ricercatori a esplorare l'evoluzione delle variazioni genomiche che portano a molteplici adattamenti dello stress da sale nel modello dell'estremofita, Schrenkiella Parvula.Combinando questa tecnica con le informazioni sulle funzioni di Aradopsis Thaliana, un'altra pianta strettamente imparentato con Schrenkiella Parvula. I ricercatori possono studiare le variazioni nella regolazione e nelle funzioni che queste sono due strutture distinte tra queste due specie. Durante il processo di trasformazione, è importante contenere tutta la soluzione di infiltrazione di agrobatteri in contenitori autoclavebili.Sterilizzare e scartare in sicurezza tutti i materiali che sono venuti a contatto con l'agrobatterio, inclusi guanti, punte di pipette macro e asciugamani di carta.

Research

JoVE Journal

Genetics

Plant Growth and Agrobacterium-mediated Floral-dip Transformation of the Extremophyte Schrenkiella parvula

A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation

Una piattaforma robotica per high-throughput Protoplast Isolamento e Trasformazione

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal ...

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Genetica

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