Name: plant growth and agrobacterium-mediated floral-dip transformation of the extremophyte schrenkiella parvula
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Plant Growth and Agrobacterium-mediated Floral-dip Transformation of the Extremophyte Schrenkiella parvula at JoVE.com

この作品は、全米科学財団賞 MCB 1616827 によって支えられました。

1. 植物の成長
<ol><li>
種子殺菌 (オプション)
	<ol>
<li>1 二重蒸留水 (ddH2O) の 50% の漂白剤の準備または非イオン性洗剤の 2 滴 (材料表参照) 50 mL のチューブで。数回のチューブを反転すると、ソリューションをミックスします。 注:層流の場合 15 分間 UV 殺菌サーフェスとキャビネットの種子殺菌を実施することをお勧めします。</li>
		<li>漂白剤溶...

<ol>
	<li>Dassanayake, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+of+the+extremophile+crucifer+Thellungiella+parvula.">The genome of the extremophile crucifer Thellungiella parvula.</a> Nature Genetics. 43 (9), 913-918 (2011).</li><li>Oh, D. -. H., Dassanayake, M., Bohnert, H. J., Cheeseman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+at+the+extreme:+lessons+from+the+genome.">Life at the extreme: lessons from the genome.</a> Genome Biology. 13 (3), 241 (2012).</li><li>Whited, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Next+Top+Models.">The Next Top Models.</a> Cell. 163 (1), 18-20 (2015).</li><li>Dassanayake, M., Yun, D. O. D., Bressan, R. A., Cheeseman, J. M., Bohnert, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+scope+of+things+to+come:+New+paradigms+in+biotechnology.">The scope of things to come: New paradigms in biotechnology.</a> Plant Biotechnology and Agriculture: Prospects for the 21st Century. , 19-34 (2009).</li><li>Dittami, S. M., Tonon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomes+of+extremophile+crucifers:+New+platforms+for+comparative+genomics+and+beyond.">Genomes of extremophile crucifers: New platforms for comparative genomics and beyond.</a> Genome Biology. 13 (8), 166 (2012).</li><li>Amtmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Learning+from+evolution:+Thellungiella+generates+new+knowledge+on+essential+and+critical+components+of+abiotic+stress+tolerance+in+plants.">Learning from evolution: Thellungiella generates new knowledge on essential and critical components of abiotic stress tolerance in plants.</a> Molecular Plant. 2 (1), 3-12 (2009).</li><li>Oh, D. -. H., Hong, H., Lee, S. Y., Yun, D. -. J., Bohnert, H. J., Dassanayake, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+structures+and+transcriptomes+signify+niche+adaptation+for+the+multiple-ion-tolerant+extremophyte+Schrenkiella+parvula.">Genome structures and transcriptomes signify niche adaptation for the multiple-ion-tolerant extremophyte Schrenkiella parvula.</a> Plant Physiology. 164 (4), 2123-2138 (2014).</li><li>Orsini, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+salt+tolerance+parameters+in+11+wild+relatives+of+Arabidopsis+thaliana.">A comparative study of salt tolerance parameters in 11 wild relatives of Arabidopsis thaliana.</a> Journal of Experimental Botany. 61 (13), 3787-3798 (2010).</li><li>Uzilday, B., Ozgur, R., Sekmen, A. H., Yildiztugay, E., Turkan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+alternative+electron+sinks+and+antioxidant+defence+in+chloroplasts+of+the+extreme+halophyte+Eutrema+parvulum+(Thellungiella+parvula)+under+salinity.">Changes in the alternative electron sinks and antioxidant defence in chloroplasts of the extreme halophyte Eutrema parvulum (Thellungiella parvula) under salinity.</a> Annals of Botany. 115 (3), 449-463 (2015).</li><li>Teusink, R. S., Rahman, M., Bressan, R. A., Jenks, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cuticular+waxes+on+Arabidopsis+thaliana+close+relatives+Thellungiella+halophila+and+Thellungiella+parvula.">Cuticular waxes on Arabidopsis thaliana close relatives Thellungiella halophila and Thellungiella parvula.</a> International Journal of Plant Sciences. 163 (2), 309-315 (2002).</li><li>Jarvis, D. E., Ryu, C. H., Beilstein, M. A., Schumaker, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+for+SOS1+in+the+convergent+evolution+of+salt+tolerance+in+Eutrema+salsugineum+and+Schrenkiella+parvula.">Distinct roles for SOS1 in the convergent evolution of salt tolerance in Eutrema salsugineum and Schrenkiella parvula.</a> Molecular Biology and Evolution. 31 (8), 2094-2107 (2014).</li><li>Clough, S. J., Bent, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Floral+dip:+A+simplified+method+for+Agrobacterium-mediated+transformation+of+Arabidopsis+thaliana.">Floral dip: A simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.</a> Plant Journal. 16 (6), 735-743 (1998).</li><li>Koornneef, M., Meinke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+Arabidopsis+as+a+model+plant.">The development of Arabidopsis as a model plant.</a> Plant Journal. 61 (6), 909-921 (2010).</li><li>Bai, J., Wu, F., Mao, Y., He, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+planta+transformation+of+Brassica+rapa+and+B.+napus+via+vernalization-infiltration+methods.">In planta transformation of Brassica rapa and B. napus via vernalization-infiltration methods.</a> Protocol Exchange. 10, 1028 (2013).</li><li>Sparrow, P. A. C., Goldsack, C. M. P., &#216;stergaard, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+technology+in+the+Brassicaceae.">Transformation technology in the Brassicaceae.</a> Genetics and Genomics of the Brassicaceae. , 505-525 (2011).</li><li>Hoagland, D. R., Arnon, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+water-culture+method+for+growing+plants+without+soil.">The water-culture method for growing plants without soil.</a> California Agricultural Experiment Station Circular. 347 (347), 1-32 (1950).</li><li>Saiki, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer-directed+enzymatic+amplification+of+DNA+with+a+thermostable+DNA+polymerase.">Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase.</a> Science. 239 (4839), 487-491 (1988).</li><li>Sun, Y., Sriramajayam, K., Luo, D., Liao, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Quick,+cost-free+method+of+purification+of+dna+fragments+from+agarose+gel.">A Quick, cost-free method of purification of dna fragments from agarose gel.</a> Journal of Cancer. 3, 93-95 (2012).</li><li>Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+sequencing+with+chain-terminating+inhibitors.">DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12), 5463-5467 (1977).</li><li>Bertani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+Lysogenesis+I.+The+mode+of+phage+liberation+by+lysogenic+Eschericia+coli.">Studies on Lysogenesis I. The mode of phage liberation by lysogenic Eschericia coli.</a> Journal of Bacteriolgy. 62 (3), 293-300 (1951).</li><li>Koncz, C., Martini, N., Szabados, L., Hrouda, M., Bachmair, A., Schell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specialized+vectors+for+gene+tagging+and+expression+studies.">Specialized vectors for gene tagging and expression studies.</a> Plant Molecular Biology Manual. , 53-74 (1994).</li><li>Weigel, D., Glazebrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+Agrobacterium+using+electroporation.">Transformation of Agrobacterium using electroporation.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (30), (2006).</li><li>Murray, M. G., Thompson, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+high+molecular+weight+plant+DNA.">Rapid isolation of high molecular weight plant DNA.</a> Nucleic Acids Research. 8 (19), 4321-4326 (1980).</li><li>Inan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salt+cress.+a+halophyte+and+cryophyte+Arabidopsis+relative+model+system+and+its+applicability+to+molecular+genetic+analyses+of+growth+and+development+of+extremophiles.">Salt cress. a halophyte and cryophyte Arabidopsis relative model system and its applicability to molecular genetic analyses of growth and development of extremophiles.</a> Plant Physiol. 135 (3), 1718-1737 (2004).</li><li>Ghedira, R., De Buck, S., Nolf, J., Depicker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+efficiency+of+Arabidopsis+thaliana+floral+dip+transformation+is+determined+not+only+by+the+Agrobacterium+strain+used+but+also+by+the+physiology+and+the+ecotype+of+the+dipped+plant.">The efficiency of Arabidopsis thaliana floral dip transformation is determined not only by the Agrobacterium strain used but also by the physiology and the ecotype of the dipped plant.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 26 (7), 823-832 (2013).</li><li>Shaohong, F. U., Xianya, W. E. I., Yingze, N. I. U., Shixing, G. U. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+Brassica+napus+with+the+method+of+floral-dip.">Transformation of Brassica napus with the method of floral-dip.</a> Biotechnology: Genomics and Its Applications. , 45-49 (2005).</li><li>Li, J., Tan, X., Zhu, F., Guo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+simple+method+for+Brassica+napus+floral-dip+transformation+and+selection+of+transgenic+plantlets.">A rapid and simple method for Brassica napus floral-dip transformation and selection of transgenic plantlets.</a> International Journal of Biology. 2 (1), 127 (2010).</li><li>Li, H. Q., Xu, J., Chen, L., Li, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+an+efficient+Agrobacterium+tumefaciens-mediated+leaf+disc+transformation+of+Thellungiella+halophila.">Establishment of an efficient Agrobacterium tumefaciens-mediated leaf disc transformation of Thellungiella halophila.</a> Plant Cell Reports. 26 (10), 1785-1789 (2007).</li><li>Wu, G., Rossidivito, G., Hu, T., Berlyand, Y., Poethig, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traffic+lines:+New+tools+for+genetic+analysis+in+Arabidopsis+thaliana.">Traffic lines: New tools for genetic analysis in Arabidopsis thaliana.</a> Genetics. 200 (1), 35-45 (2015).</li></ol>

植物の生理学的状態は、変換25の効率を大きく影響します。変換のための健康で、積極的な植物の使用は、 S. parvulaの正常な変形のための重要な要件です。水または重点を置かれた植物の光変換 (図 1、センター パネル) の理想的な健康な植物と比較して少ない花を持ちます。光強度で育てることができるS. parvula未満 130 µmol m-2の<su...

このプロトコルでは、成長と extremophyte モデルSchrenkiella parvulaの安定形質転換路線の設立について説明します。効率的な変換システムの可用性は、汎用性の高い遺伝的モデルの特徴です。極端な環境で繁栄する植物は、extremophytes、として環境ストレスに対する植物の適応を理解するための重要なリソースを提供するために呼ばれます。Schrenkiella parvula(旧Thellungiella parvulaと別 parvulum) ゲノム リソース1,2,3,4、5の拡大と、1 つのようなの extremophyte モデルです。ただし、変形のプロトコルまだ報告されていないs. parvulaの出版された調査で。
S. parvulaのゲノム アブラナ科 (マスタード キャベツ家族) で初公開された extremophyte ゲノムであり、非 extremophyte モデル、シロイヌナズナ1広範な全体的なゲノム シンテニーを示します。したがって、シロイヌナズナとs. parvula比較研究の恩恵S. parvulaゲノムがどのように進化し、規制に関する有益な仮説をするシロイヌナズナで行われた遺伝研究の富別様に対処する極端な環境は5,6,7を強調します。S. parvulaは最も耐塩性種の (土食塩 LD50 に基づいて) 知られている野生の親類間でa8の 1 つです。耐塩に加えて米 parvula存続させ、高濃度でほとんどの植物7に有毒である複数の塩イオン存在下におけるライフ サイクルを完了します。その自然の生息地で流行している非生物的ストレスに対する、それが展開する様々 な特性、その中でいくつかの生化学的、または生理学的なレベルの8,9,10、研究されています。 11。
2010 年、 S. parvula対象種としてまたは他の植物のゲノムとの比較でそれを使用する 400 以上のピア分列出版物がずっとあります。ただし、どのような研究が行われているのよく見るとクリアのボトルネックを識別できます。これらのレポートの大半は将来の研究で米 parvulaの潜在的な使用について話し合うまたは比較ゲノムまたはゲノミクス研究で使用します。概念実証の変形のプロトコルの不足のために確立S. parvula日付に利用可能な最高品質の植物ゲノムの 1 つを持っていることにもかかわらず、機能のゲノム研究で使用されていない (> 5 Mb contig N50) 組み立て、pseudomolecules 染色体レベル1に付きます。
アグロバクテリウム花ディップ法atrasngenic 行を作成する最も広く使用されている方法となっているし、変換の再現システムの開発だったとして、その成功の重要な要因、遺伝モデル12,13。ただし、すべてのアブラナ科の種は、シロイヌナズナの花のすくいの手法を使用して正常に変換する示されています。特別に、 S. parvulaを含むアブラナ科のリネージュ II 種は花のすくいに基づいて変換方法14,15に反抗的なされています。
S. parvula、その狭い葉の形態と組み合わせての不確定な開花生育は標準花ディップ アグロバクテリウム法を採用するために挑戦しました。本研究では、 S. parvulaの再現性のある変換を行った修正されたプロトコルを報告します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1303px;" width="1302">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Agar</td>
			<td style="width:293px;">VWR International, Radnor, PA</td>
			<td style="width:127px;">90000-762</td>
			<td style="width:541px;">Bacto Agar Soldifying Agent, BD Diagnostics</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B5 vitamins</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>G1019</td>
			<td>Gamborg&#8217;s Vitamin Solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Desiccant</td>
			<td>W A Hammond Drierite, Xenia, OH</td>
			<td style="width:127px;">22005</td>
			<td>Indicating DRIERITE 6 mesh</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:341px;">Destination vector for plant transformation</td>
			<td>TAIR</td>
			<td style="width:127px;">Vector:6531113857</td>
			<td>pKGWFS7</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Electroporation cuvette</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>9104-5050</td>
			<td>Electroporation cuvette, round cap, 0.2 cm gap</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Electroporator</td>
			<td>BIO-RAD Laboratories, Hercules, CA</td>
			<td>1652100</td>
			<td>MicroPulser Electroporator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fertilizer beads</td>
			<td>Osmocote Garden, Marysville, OH</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Osmocote Smart-Release Plant Food&#160;Flower &#38; Vegetable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gel extraction kit</td>
			<td>iNtRON Biotechnology, Boston, MA</td>
			<td>17289</td>
			<td>MEGAquick-spin Total fragment DNA purification kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gentamicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>G1914-5G</td>
			<td>Gentamicin sulfate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Glufosinate-ammonium (11.3%) herbicide (BASTA)</td>
			<td>Bayer environmental science, Montvale, NJ</td>
			<td>N/A</td>
			<td>FINALE herbicide</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kanamycin</td>
			<td>VWR International, Radnor, PA</td>
			<td>200004-444</td>
			<td>Kanamycin monosulfate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MES</td>
			<td>Bioworld, Dublin, OH</td>
			<td>41320024-2</td>
			<td>MES, Free Acid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MS salt</td>
			<td>MP Biomedicals, Santa Anna, CA</td>
			<td>092621822</td>
			<td>Hoagland&#39;s modified basal salt mixture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N6-benzylaminopurine (BA)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>B3274</td>
			<td>6-Benzylaminopurine solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td>Sigma-Alrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>Sodium chloride</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Non-ionic detergent</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td>TWEEN 20&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Plasmid isolation kit</td>
			<td>Zymo Research, Irvine, CA</td>
			<td>D4036</td>
			<td>Zyppy Plasmid Kits</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinase enzyme mix kit</td>
			<td>Life Technology</td>
			<td>11791-020</td>
			<td>Gateway LR Clonase II Enzyme mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rifampicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>R3501-1G</td>
			<td>Rifampicin, powder, &#62;= 97% (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Shaking incubator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>SHKE4450</td>
			<td>MaxQ 4450 Benchtop Orbital Shakers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Soil mix</td>
			<td>Sun Gro</td>
			<td>SUN239223328CFLP</td>
			<td>Sun Gro Metro-Mix 360 Grower Mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spectinomycin</td>
			<td>VWR International, Radnor, PA</td>
			<td>IC15206705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile 50ml conical tubes</td>
			<td>USA Scientific, Ocala, FL</td>
			<td>1500-1811</td>
			<td>50 ml conical screw cap tubes, copolymer, racks, sterile</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sucrose</td>
			<td>VWR International, Radnor, PA</td>
			<td>57-50-1</td>
			<td>Sucrose, ACS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Surfactant solution</td>
			<td>Lehle seeds, Round Rock, TX</td>
			<td>VIS-02</td>
			<td>Silwet L-77</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Topoisomerase-based cloning kit</td>
			<td>Life Technologies, Carlsbad, CA</td>
			<td>K240020</td>
			<td>pENTR/D-TOPO Cloning Kit, with One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tryptone</td>
			<td>VWR International, Radnor, PA</td>
			<td>90000-282</td>
			<td>BD Bacto Tryptone, BD Biosciences</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast Extract</td>
			<td>VWR International, Radnor, PA</td>
			<td>90000-722&#160;</td>
			<td>BD Bacto Yeast Extract, BD Biosciences</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

plant growth and agrobacterium-mediated floral-dip transformation of the extremophyte schrenkiella parvula

Schrenkiella parvulaは多重イオン毒性ストレスを含む様々 な非生物的ストレスに適応する extremophyte です。ツールは、実行可能な変換システムの不足によって制限されているし、利用可能な高品質のゲノム リソースにもかかわらず植物が環境に適応する方法を研究する強調、機能ゲノム学モデルとしての価値。このプロトコルで報告する安定した遺伝子組換え米 parvulaの生成方法アグロバクテリウム仲介された花のすくいメソッドを使用して行。不確定な開花習性と葉高エピクチクラ ワックス コンテンツなどs. parvulaのユニークな特徴を考慮してaに使用される変換プロトコルを変更しました。簡単に言えば、 S. parvula種子は植える前に 5 日間の 4 ° C で階層化しました。14 h 光と暗い 10 h と、130 µmol m-2の-1光強度、24 ° C に 22 の ° c の日長で栽培しました。8 複数花序と 9 週齢の工場には、変換に選ばれました。PMP90RKプラスミドを運ぶアグロバクテリウムGV3101 の浸透ソリューションは、これらの花序を浸したされました。花漬変換効率を高めるため 3 〜 4 週間の間隔で 2 回のラウンドを行った。T1 種子は、収集され、候補者の画面に発芽の行の変換前に、乾燥剤が付いている容器で 4 週間の乾燥します。バスタへの抵抗は、T1 植物を画面に使用されました。誤検知を減らすために 2 週古い工場で 3 日間の間隔で 3 回バスタ ソリューションを散布しました。バスタ ドロップ テストは真の肯定的な形質転換体を識別するために個々 の植物の存続で実行されました。変換効率 0.033 お %、10,000 T1 種子伝播あたり 3-4 遺伝子組換え植物の降伏であった。

シロイヌナズナの変更から花のすくいメソッドを使用して、150 日以内 T0種子の収穫を可能にする変形のプロトコルを開発しました。図 1は、タイムラインと花のすくいを通じて変換を実行するための最適なステージを表すs. parvula植物の概要を示しています。変換のためのターゲット段階として発芽後 60-80 日で複数花序S....

Watch this Scientific Journal Video about Plant Growth and Agrobacterium-mediated Floral-dip Transformation of the Extremophyte Schrenkiella parvula at JoVE.com

Plant Growth and Agrobacterium-mediated Floral-dip Transformation of the Extremophyte Schrenkiella parvula

作物の生長と花ディップ アグロバクテリウム Extremophyte Schrenkiella parvulaの

花 dip 法を用いたアグロバクテリウム仲介された変形は extremophyte モデルSchrenkiella parvulaの安定形質転換線を作成する正常に用いることができます。シロイヌナズナ、別の成長の習慣と、extremophyte の生理学的特性を考慮したためと変更プロトコルを提案します。

Schrenkiella parvula is an extremophyte adapted to various abiotic stresses, including multiple ion toxicity stresses. Despite high-quality genomic ...

この方法は、シュレンキエラパルヴラの再現可能な変換プロトコルであり、植物の比較および機能性の分野における質問、特に過酷な環境への植物適応を調査する研究に答えることができます。この技術により、多イオン塩ストレスに適応した極端のシュレンキエラパルヴラのルーチン機能の調査が可能になります。また、その近親アリビドプシス・タリアナを見る比較研究を可能にします。シュレンキエラ・パルヴラとアリビドプシス・タリアナを比較すると、シュレンキエラ・パルヴラのユニークな適応を可能にする遺伝子調節および機能の差異に関する洞察を提供することができます。シロイヌナズナの変換プロトコルはすでに確立されています。この方法は現在、トランスジェニックシュレンキエラパルヴラ植物を用いた比較研究を可能にする。一般的に、この方法に新しい研究者は、開花習慣と植物の葉の形態と植物のディップを使用して効果的な変換を行うだけでなく、真の形質転換体の選択のために苦労します。まず、濡れた爪楊枝を使用して、約20〜25 S.Parvula種子を湿った土壌に移します。その後、5〜7日間摂氏4度で種子を層化します。成層後、7〜10日間、成長室に種子を戻します。すべての苗が発芽したら、4つのコーナーのそれぞれと鍋の中心に1つの苗を残します。彼らが花を咲くまで、成長室で8〜10週間植物を成長させます。変換の日に、テキストプロトコルに従ってS.Parvula植物を選択します。鉗子と小さいはさみを使用して、すでにシリケに発達している受粉した花序を取り除く。植物の準備ができたら、アグロバクテリウム浸潤液を調製します。この後、S.Parvulaの花序をアグロバクテリウム浸潤液中に20秒間浸します。ここに示されているのは、変換に使用できる植物の最も初期の段階であり、既に発達したシリケイが変換前に除去されている限り、より多くの花を持つ古い植物を使用することができる。変換後、花を浸した植物を、植物を覆うドーム付きのきれいなトレイに水平に置きます。その後、1〜2日間暗い成長室に植物を配置します。工場を直立した位置に戻し、成長室に移します。次の週に、浸漬花序を監視します。最初の花のディップの10日後、S.Parvula植物は新しい花序とシリケを生産し続けます。花のディップの第2ラウンドは、新たに出現する花序をさらに変えるために行うことができます。種子が成熟するまで植物を育て、約21週間の種子を収穫します。乾燥剤で満たされた気密容器の室温で2〜3週間種子を乾燥させます。テキストプロトコルに従ってT 1シードを植えます。最初の2〜3本の真の葉が発達するまで植物を育てます。除草剤耐性の最初の選択を行うために、グルフォシネート除草剤アンモニウムを希釈し、苗にスプレーします。一晩ドームで苗を覆います。トレイを成長室に戻し、ドームを取り外します。苗木のほとんどが除草剤によって選択されるまで待ちます。2番目の選択を開始するには、BASTA溶液で3〜4回スプレーされた後に生き残る植物を特定します。さらに2〜3週間植物を栽培した後、各植物で最大の成熟した葉を選択します。次に、葉の表面を指でやさしくこすり、ワックス層を取り除きます。その後、希釈されたBASTA溶液を葉の上に置きます。BASTA溶液で処理された葉を監視し、最大1週間しおれる兆候を確認します。最後に、BASTAドロップの影響を受けない葉を持つ植物を選択して、さらなる分析を行います。このプロトコルでは、S.Parvulaは花のディップ法を用いてアグロバクテリウムで変換された。アグロバクテリウムの感染は、いくつかの花の中絶をもたらした。しかし、S.Parvulaの植物は、最初の花の浸漬後に新しい花を生産し続け、再び変換することができました。BASTAのスプレーおよび低下テストを使用して、真陽性の形質転換体を正確に識別することができる。PCR確認を使用して試験したサンプル数を減らすことができます。この方法はシロイヌナズナの変容に似ていますが、シュレンキエラ・パルヴラの成長と形態の違いを覚えておくことが重要です。変換を成功させるには、これらの違いを反映するようにプロトコルを変更することが重要です。この技術は、研究者が外肢モデルシュレンキエラ・パルヴラの複数の塩ストレス適応につながるゲノム変動の進化を探求するのに役立つ可能性がある。この技術と、シュレンキエラ・パルヴラと密接に関連する別の植物であるアラドプシス・タリアナの機能に関する情報を組み合わせます。研究者は、これら2つの種の間の2つの異なる構造である調節と機能のバリエーションを研究することができます。変換プロセスの間、オートクレーブ可能な容器内にすべてのアグロバクテリウム浸潤液を含めることが重要である。手袋、マクロピペットチップ、ペーパータオルなど、アグロバクテリウムに接触したすべての材料を殺菌し、安全に廃棄してください。

Research

JoVE Journal

Genetics

Plant Growth and Agrobacterium-mediated Floral-dip Transformation of the Extremophyte Schrenkiella parvula

A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation

ハイスループットプロトプラスト単離と変革のためのロボットプラットフォーム

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal ...

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

植物病原体の遺伝子操作<em&gt;ウスチラゴmaydis</em&gt;真菌生物と植物微生物相互作用を研究します

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

The Use of Induced Somatic Sector Analysis (ISSA) for Studying Genes and Promoters Involved in Wood Formation and Secondary Stem Development

The Use of Induced Somatic Sector Analysis ISSA for Studying Genes and Promoters Involved in Wood Formation and Secondary Stem Development

木部形成に関与する遺伝子およびプロモーターを研究するための誘導性体細胞セクター分析（ISSA）の使用とセカンダリステム開発

Secondary stem growth in trees and associated wood formation are significant both from biological and commercial perspectives. However, relatively little ...

Rapid Deletion Production in Fungi via Agrobacterium Mediated Transformation of OSCAR Deletion Constructs

Rapid Deletion Production in Fungi via Agrobacterium Mediated Transformation of OSCAR Deletion Constructs

真菌による迅速な欠失生産<em&gt;アグロバクテリウム</em&gt; OSCAR削除コンストラクトの仲介された変換

Precise deletion of gene(s) of interest, while leaving the rest of the genome unchanged, provides the ideal product to determine that particular ...

Assessment of DNA Contamination in RNA Samples Based on Ribosomal DNA

リボソーム DNA に基づいて RNA サンプルの DNA 汚染の評価

One method extensively used for the quantification of gene expression changes and transcript abundances is reverse-transcription quantitative real-time ...

Purification of High Molecular Weight Genomic DNA from Powdery Mildew for Long-Read Sequencing

ロングリード配列決定のためのうどんこ病から高分子量のゲノムDNAの精製

The powdery mildew fungi are a group of economically important fungal plant pathogens. Relatively little is known about the molecular biology and genetics ...

Optimization and Comparative Analysis of Plant Organellar DNA Enrichment Methods Suitable for Next-generation Sequencing

次世代シークエンシングに適した植物オルガネラDNA濃縮法の最適化と比較分析

Plant organellar genomes contain large, repetitive elements that may undergo pairing or recombination to form complex structures and/or sub-genomic ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

堅牢な DNA の隔離および標本の高スループット シーケンス ライブラリーの構築

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

探索ルート マイクロバイ: 土、根、およびルート Endosphere から細菌群集のデータを抽出

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

Discrimintion and Mapping of the Primary and Processed Transcripts in Maize Mitochondrion Using a Circular RT-PCR-based Strategy

円形RT-PCRベースの戦略を用いたトウモロコシミトコンドリオンにおける一次写物と処理された転写物の判別とマッピング

In plant mitochondria, some steady-state transcripts have 5&#39; triphosphate derived from transcription initiation (primary transcripts), while the ...

作物の生長と花ディップ アグロバクテリウム Extremophyte Schrenkiella parvulaの

作物の生長と花ディップアグロバクテリウム Extremophyte Schrenkiella parvulaの