Name: plant growth and agrobacterium-mediated floral-dip transformation of the extremophyte schrenkiella parvula
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Plant Growth and Agrobacterium-mediated Floral-dip Transformation of the Extremophyte Schrenkiella parvula at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av en National Science Foundation award kalt MCB 1616827.

1. plantevekst
<ol><li>
Frø sterilisering (valgfritt)
	<ol>
<li>Forberede 50% blekemiddel i dobbel-destillert vann (ddH2O) med 1 eller 2 dråper av en ikke-ioniske vaskemiddel (se Tabell for materiale) i et 50 mL tube. Invertere røret flere ganger for å blande løsningen. Merk: Det anbefales å gjennomføre frø sterilisering en laminær strømning kabinett med UV sterilitet overflate i 15 min.</li>
		<li>Legg den bleike løsningen til ~ 100-200 S....

<ol>
	<li>Dassanayake, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+of+the+extremophile+crucifer+Thellungiella+parvula.">The genome of the extremophile crucifer Thellungiella parvula.</a> Nature Genetics. 43 (9), 913-918 (2011).</li><li>Oh, D. -. H., Dassanayake, M., Bohnert, H. J., Cheeseman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+at+the+extreme:+lessons+from+the+genome.">Life at the extreme: lessons from the genome.</a> Genome Biology. 13 (3), 241 (2012).</li><li>Whited, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Next+Top+Models.">The Next Top Models.</a> Cell. 163 (1), 18-20 (2015).</li><li>Dassanayake, M., Yun, D. O. D., Bressan, R. A., Cheeseman, J. M., Bohnert, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+scope+of+things+to+come:+New+paradigms+in+biotechnology.">The scope of things to come: New paradigms in biotechnology.</a> Plant Biotechnology and Agriculture: Prospects for the 21st Century. , 19-34 (2009).</li><li>Dittami, S. M., Tonon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomes+of+extremophile+crucifers:+New+platforms+for+comparative+genomics+and+beyond.">Genomes of extremophile crucifers: New platforms for comparative genomics and beyond.</a> Genome Biology. 13 (8), 166 (2012).</li><li>Amtmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Learning+from+evolution:+Thellungiella+generates+new+knowledge+on+essential+and+critical+components+of+abiotic+stress+tolerance+in+plants.">Learning from evolution: Thellungiella generates new knowledge on essential and critical components of abiotic stress tolerance in plants.</a> Molecular Plant. 2 (1), 3-12 (2009).</li><li>Oh, D. -. H., Hong, H., Lee, S. Y., Yun, D. -. J., Bohnert, H. J., Dassanayake, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+structures+and+transcriptomes+signify+niche+adaptation+for+the+multiple-ion-tolerant+extremophyte+Schrenkiella+parvula.">Genome structures and transcriptomes signify niche adaptation for the multiple-ion-tolerant extremophyte Schrenkiella parvula.</a> Plant Physiology. 164 (4), 2123-2138 (2014).</li><li>Orsini, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+salt+tolerance+parameters+in+11+wild+relatives+of+Arabidopsis+thaliana.">A comparative study of salt tolerance parameters in 11 wild relatives of Arabidopsis thaliana.</a> Journal of Experimental Botany. 61 (13), 3787-3798 (2010).</li><li>Uzilday, B., Ozgur, R., Sekmen, A. H., Yildiztugay, E., Turkan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+alternative+electron+sinks+and+antioxidant+defence+in+chloroplasts+of+the+extreme+halophyte+Eutrema+parvulum+(Thellungiella+parvula)+under+salinity.">Changes in the alternative electron sinks and antioxidant defence in chloroplasts of the extreme halophyte Eutrema parvulum (Thellungiella parvula) under salinity.</a> Annals of Botany. 115 (3), 449-463 (2015).</li><li>Teusink, R. S., Rahman, M., Bressan, R. A., Jenks, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cuticular+waxes+on+Arabidopsis+thaliana+close+relatives+Thellungiella+halophila+and+Thellungiella+parvula.">Cuticular waxes on Arabidopsis thaliana close relatives Thellungiella halophila and Thellungiella parvula.</a> International Journal of Plant Sciences. 163 (2), 309-315 (2002).</li><li>Jarvis, D. E., Ryu, C. H., Beilstein, M. A., Schumaker, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+for+SOS1+in+the+convergent+evolution+of+salt+tolerance+in+Eutrema+salsugineum+and+Schrenkiella+parvula.">Distinct roles for SOS1 in the convergent evolution of salt tolerance in Eutrema salsugineum and Schrenkiella parvula.</a> Molecular Biology and Evolution. 31 (8), 2094-2107 (2014).</li><li>Clough, S. J., Bent, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Floral+dip:+A+simplified+method+for+Agrobacterium-mediated+transformation+of+Arabidopsis+thaliana.">Floral dip: A simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.</a> Plant Journal. 16 (6), 735-743 (1998).</li><li>Koornneef, M., Meinke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+Arabidopsis+as+a+model+plant.">The development of Arabidopsis as a model plant.</a> Plant Journal. 61 (6), 909-921 (2010).</li><li>Bai, J., Wu, F., Mao, Y., He, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+planta+transformation+of+Brassica+rapa+and+B.+napus+via+vernalization-infiltration+methods.">In planta transformation of Brassica rapa and B. napus via vernalization-infiltration methods.</a> Protocol Exchange. 10, 1028 (2013).</li><li>Sparrow, P. A. C., Goldsack, C. M. P., &#216;stergaard, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+technology+in+the+Brassicaceae.">Transformation technology in the Brassicaceae.</a> Genetics and Genomics of the Brassicaceae. , 505-525 (2011).</li><li>Hoagland, D. R., Arnon, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+water-culture+method+for+growing+plants+without+soil.">The water-culture method for growing plants without soil.</a> California Agricultural Experiment Station Circular. 347 (347), 1-32 (1950).</li><li>Saiki, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer-directed+enzymatic+amplification+of+DNA+with+a+thermostable+DNA+polymerase.">Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase.</a> Science. 239 (4839), 487-491 (1988).</li><li>Sun, Y., Sriramajayam, K., Luo, D., Liao, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Quick,+cost-free+method+of+purification+of+dna+fragments+from+agarose+gel.">A Quick, cost-free method of purification of dna fragments from agarose gel.</a> Journal of Cancer. 3, 93-95 (2012).</li><li>Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+sequencing+with+chain-terminating+inhibitors.">DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12), 5463-5467 (1977).</li><li>Bertani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+Lysogenesis+I.+The+mode+of+phage+liberation+by+lysogenic+Eschericia+coli.">Studies on Lysogenesis I. The mode of phage liberation by lysogenic Eschericia coli.</a> Journal of Bacteriolgy. 62 (3), 293-300 (1951).</li><li>Koncz, C., Martini, N., Szabados, L., Hrouda, M., Bachmair, A., Schell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specialized+vectors+for+gene+tagging+and+expression+studies.">Specialized vectors for gene tagging and expression studies.</a> Plant Molecular Biology Manual. , 53-74 (1994).</li><li>Weigel, D., Glazebrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+Agrobacterium+using+electroporation.">Transformation of Agrobacterium using electroporation.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (30), (2006).</li><li>Murray, M. G., Thompson, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+high+molecular+weight+plant+DNA.">Rapid isolation of high molecular weight plant DNA.</a> Nucleic Acids Research. 8 (19), 4321-4326 (1980).</li><li>Inan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salt+cress.+a+halophyte+and+cryophyte+Arabidopsis+relative+model+system+and+its+applicability+to+molecular+genetic+analyses+of+growth+and+development+of+extremophiles.">Salt cress. a halophyte and cryophyte Arabidopsis relative model system and its applicability to molecular genetic analyses of growth and development of extremophiles.</a> Plant Physiol. 135 (3), 1718-1737 (2004).</li><li>Ghedira, R., De Buck, S., Nolf, J., Depicker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+efficiency+of+Arabidopsis+thaliana+floral+dip+transformation+is+determined+not+only+by+the+Agrobacterium+strain+used+but+also+by+the+physiology+and+the+ecotype+of+the+dipped+plant.">The efficiency of Arabidopsis thaliana floral dip transformation is determined not only by the Agrobacterium strain used but also by the physiology and the ecotype of the dipped plant.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 26 (7), 823-832 (2013).</li><li>Shaohong, F. U., Xianya, W. E. I., Yingze, N. I. U., Shixing, G. U. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+Brassica+napus+with+the+method+of+floral-dip.">Transformation of Brassica napus with the method of floral-dip.</a> Biotechnology: Genomics and Its Applications. , 45-49 (2005).</li><li>Li, J., Tan, X., Zhu, F., Guo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+simple+method+for+Brassica+napus+floral-dip+transformation+and+selection+of+transgenic+plantlets.">A rapid and simple method for Brassica napus floral-dip transformation and selection of transgenic plantlets.</a> International Journal of Biology. 2 (1), 127 (2010).</li><li>Li, H. Q., Xu, J., Chen, L., Li, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+an+efficient+Agrobacterium+tumefaciens-mediated+leaf+disc+transformation+of+Thellungiella+halophila.">Establishment of an efficient Agrobacterium tumefaciens-mediated leaf disc transformation of Thellungiella halophila.</a> Plant Cell Reports. 26 (10), 1785-1789 (2007).</li><li>Wu, G., Rossidivito, G., Hu, T., Berlyand, Y., Poethig, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traffic+lines:+New+tools+for+genetic+analysis+in+Arabidopsis+thaliana.">Traffic lines: New tools for genetic analysis in Arabidopsis thaliana.</a> Genetics. 200 (1), 35-45 (2015).</li></ol>

Fysiologisk tilstand av anlegget betydelig påvirker effektiviteten av transformasjon25. Bruk av sunn og livskraftig planter for transformasjon er viktig for vellykket transformasjon i S. parvula. Vann eller lette stresset planter vil ha færre blomster sammenlignet med de friske plantene ideelt for transformasjon (figur 1, midtre panel). S. parvula kan vokse i lav intensitet mindre enn 130 µmol m-2 s-1, men de pleier å være ...

I denne protokollen beskriver vi vekst og etablering av stabil transgene linjer for extremophyte modell Schrenkiella parvula. Tilgjengeligheten av en effektiv transformasjon system er et kjennetegn på en allsidig genetisk modell. Plantene som trives i ekstreme miljøer, referert til som extremophytes, gir en kritisk ressurs for å forstå anlegget tilpasninger mot miljømessige belastninger. Schrenkiella parvula (tidligere Thellungiella parvula og Eutrema parvulum) er en slik extremophyte modell, med å utvide genomisk ressurser,1,,2,,3,,4,,5. Men har transformasjon protokoller ikke ennå blitt rapportert for S. parvula i publiserte studier.
Genomet av S. parvula er første publiserte extremophyte genomet i Korsblomstfamilien (sennep-kål familien) og viser en omfattende totale genom synteny med ikke-extremophyte modell, Arabidopsis thaliana1. Dermed komparative studier mellom A. thaliana og S. parvula kan ha nytte av vell av genetiske studier utført på A. thaliana å gjøre informativ hypoteser om hvordan S. parvula genomet har utviklet seg og regulert annerledes for å tåle understreker ekstreme miljø5,6,7. S. parvula er en av de mest salt-tolerant artene (basert på jord NaCl LD50) blant kjente ville slektninger av A. thaliana8. NaCl toleranse, S. parvula overlever og livssyklusen i nærvær av flere salt ioner ved høye konsentrasjoner giftig for de fleste planter7er fullført. Svar på abiotiske stress utbredt i sitt naturlige habitat, den har utviklet seg ulike egenskaper, hvorav flere har blitt studert på biokjemiske eller fysiologiske nivå 8,9,10, 11.
Siden 2010, har det vært over 400 peer-reveiwed publikasjoner som brukes S. parvula som mål art eller brukt i en sammenligning med andre plante genomer. Men kan en tydelig flaskehals identifiseres med en nærmere titt på hva slags studier har vært gjennomført. Fleste av disse rapportene diskutere benytte S. parvula i fremtidige studier eller bruke den i sammenlignende genomisk eller phylogenomic studier. På grunn av mangel på en proof-of-concept transformasjon protokoll etablert for S. parvula, den ikke er brukt i funksjonelle genomisk studier, til tross for at en av høyeste kvalitet anlegget genomer tilgjengelig ennå (> 5 Mb contig N50) samlet og kommentert i kromosom nivå pseudomolecules1.
Metoden Agrobacterium-mediert blomster-dip transformasjon har blitt den mest brukte metoden til å opprette trasngenic i A. thalianaog utvikling av en reproduserbar system transformasjon var en kritisk faktor i suksessen som en genetisk modell12,13. Ikke alle Korsblomstfamilien arter har imidlertid vist forvandles lykkes med metoden blomster-dip utviklet for A. thaliana. Spesielt, har Brassicaceae Lineage II arter som inkluderer S. parvula vært gjenstridige til blomster-dip basert transformasjon metoder14,15.
Ubestemte blomstrende vekst vane S. parvula, kombinert med sine smale blad morfologi har gjort det utfordrende å vedta den standard Agrobacterium-mediert blomster-dip transformasjon metoden. I denne studien rapporterer vi endret protokollen har vi utviklet for reproduserbar transformasjon av S. parvula.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1303px;" width="1302">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Agar</td>
			<td style="width:293px;">VWR International, Radnor, PA</td>
			<td style="width:127px;">90000-762</td>
			<td style="width:541px;">Bacto Agar Soldifying Agent, BD Diagnostics</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B5 vitamins</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>G1019</td>
			<td>Gamborg&#8217;s Vitamin Solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Desiccant</td>
			<td>W A Hammond Drierite, Xenia, OH</td>
			<td style="width:127px;">22005</td>
			<td>Indicating DRIERITE 6 mesh</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:341px;">Destination vector for plant transformation</td>
			<td>TAIR</td>
			<td style="width:127px;">Vector:6531113857</td>
			<td>pKGWFS7</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Electroporation cuvette</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>9104-5050</td>
			<td>Electroporation cuvette, round cap, 0.2 cm gap</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Electroporator</td>
			<td>BIO-RAD Laboratories, Hercules, CA</td>
			<td>1652100</td>
			<td>MicroPulser Electroporator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fertilizer beads</td>
			<td>Osmocote Garden, Marysville, OH</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Osmocote Smart-Release Plant Food&#160;Flower &#38; Vegetable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gel extraction kit</td>
			<td>iNtRON Biotechnology, Boston, MA</td>
			<td>17289</td>
			<td>MEGAquick-spin Total fragment DNA purification kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gentamicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>G1914-5G</td>
			<td>Gentamicin sulfate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Glufosinate-ammonium (11.3%) herbicide (BASTA)</td>
			<td>Bayer environmental science, Montvale, NJ</td>
			<td>N/A</td>
			<td>FINALE herbicide</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kanamycin</td>
			<td>VWR International, Radnor, PA</td>
			<td>200004-444</td>
			<td>Kanamycin monosulfate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MES</td>
			<td>Bioworld, Dublin, OH</td>
			<td>41320024-2</td>
			<td>MES, Free Acid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MS salt</td>
			<td>MP Biomedicals, Santa Anna, CA</td>
			<td>092621822</td>
			<td>Hoagland&#39;s modified basal salt mixture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N6-benzylaminopurine (BA)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>B3274</td>
			<td>6-Benzylaminopurine solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td>Sigma-Alrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>Sodium chloride</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Non-ionic detergent</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td>TWEEN 20&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Plasmid isolation kit</td>
			<td>Zymo Research, Irvine, CA</td>
			<td>D4036</td>
			<td>Zyppy Plasmid Kits</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinase enzyme mix kit</td>
			<td>Life Technology</td>
			<td>11791-020</td>
			<td>Gateway LR Clonase II Enzyme mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rifampicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>R3501-1G</td>
			<td>Rifampicin, powder, &#62;= 97% (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Shaking incubator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>SHKE4450</td>
			<td>MaxQ 4450 Benchtop Orbital Shakers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Soil mix</td>
			<td>Sun Gro</td>
			<td>SUN239223328CFLP</td>
			<td>Sun Gro Metro-Mix 360 Grower Mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spectinomycin</td>
			<td>VWR International, Radnor, PA</td>
			<td>IC15206705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile 50ml conical tubes</td>
			<td>USA Scientific, Ocala, FL</td>
			<td>1500-1811</td>
			<td>50 ml conical screw cap tubes, copolymer, racks, sterile</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sucrose</td>
			<td>VWR International, Radnor, PA</td>
			<td>57-50-1</td>
			<td>Sucrose, ACS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Surfactant solution</td>
			<td>Lehle seeds, Round Rock, TX</td>
			<td>VIS-02</td>
			<td>Silwet L-77</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Topoisomerase-based cloning kit</td>
			<td>Life Technologies, Carlsbad, CA</td>
			<td>K240020</td>
			<td>pENTR/D-TOPO Cloning Kit, with One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tryptone</td>
			<td>VWR International, Radnor, PA</td>
			<td>90000-282</td>
			<td>BD Bacto Tryptone, BD Biosciences</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast Extract</td>
			<td>VWR International, Radnor, PA</td>
			<td>90000-722&#160;</td>
			<td>BD Bacto Yeast Extract, BD Biosciences</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

plant growth and agrobacterium-mediated floral-dip transformation of the extremophyte schrenkiella parvula

Schrenkiella parvula er en extremophyte tilpasset ulike abiotiske påkjenninger, inkludert flere ion toksisitet påkjenninger. Til tross for høy kvalitet genomisk ressurser tilgjengelig til å studere hvordan planter tilpasse seg miljøet understreker verdien som funksjonell genomforskning modell og verktøyet har vært begrenset av mangel på en mulig transformasjon system. I denne protokollen, rapporterer vi hvordan å generere stabil transgene S. parvula linjer med en Agrobacterium-mediert blomster-dip-metode. Vi endret transformasjon protokollen som brukes til A. thaliana konto for unike trekk av S. parvula, for eksempel en ubestemmelig blomstrende vane og en høy epicuticular voksen innhold på bladene. Kort, S. parvula frø var lagdelt på 4 ° C i fem dager før planting. Planter ble dyrket på en fotoperiode av et 14 h lys og 10t mørke og 130 µmol m-2s-1 lav intensitet, på 22 ° C til 24 ° C. Åtte til ni uke-gamle planter med flere inflorescences ble valgt for transformasjon. Disse inflorescences var dyppet i en infiltrasjon av Agrobacterium tumefaciens GV3101 bærer pMP90RK plasmider. Vi utført to rundene blomst dipping med et intervall på tre til fire uker å effektivisere transformasjon. T1 frø var samlet og tørket i fire uker i en container med desiccants før spiring skjermen kandidat forvandlet linjer. Motstand mot BASTA ble brukt til skjerm T1 planter. Vi sprayet BASTA løsningen tre ganger med et intervall på tre dager starter på to uke gamle planter å redusere falske positiver. En BASTA drop test ble utført på overlevende personlige planter for å identifisere ekte positiv transformants. Transformasjon effektiviteten var 0.033%, gir 3-4 transgene planter per 10 000 T1 frø overført.

Vi utviklet en transformasjon protokoll som høsting av T0 frø innen 150 dager, bruke en floral-dip endret fra det for A. thaliana. Figur 1 viser en oppsummering av tidslinjen og S. parvula planter som representerer optimal scenen for å utføre transformasjonen gjennom blomster-dip. Vi valgte S. parvula planter med 70 –80 blomster i flere inflorescences 60 – 80 dager etter spiring som mål scenen for transformasjon....

Watch this Scientific Journal Video about Plant Growth and Agrobacterium-mediated Floral-dip Transformation of the Extremophyte Schrenkiella parvula at JoVE.com

Plant Growth and Agrobacterium-mediated Floral-dip Transformation of the Extremophyte Schrenkiella parvula

Vekst og Agrobacterium-mediert Floral-dip transformasjonen av Extremophyte Schrenkiella parvula

Agrobacterium-mediert transformasjon bruke en floral-dip kan brukes å opprette stabil transgene linjer av extremophyte modellen Schrenkiella parvula. Vi presenterer en protokoll endret fra det for Arabidopsis thaliana, vurderer ulike vekst vaner og fysiologiske kjennetegner extremophyte.

Schrenkiella parvula is an extremophyte adapted to various abiotic stresses, including multiple ion toxicity stresses. Despite high-quality genomic ...

Denne metoden, en reproduserbar transformasjonsprotokoll for Schrenkiella parvula, kan bidra til å svare på spørsmål innen komparativ og funksjonell genoming, spesielt studier som undersøker plantetilpasninger til tøffe miljøer. Denne teknikken muliggjør undersøkelser av rutinemessige funksjoner i Schrenkiella parvula på ekstremophyte tilpasset multi-ion salt stress. Det muliggjør også komparative studier som også ser på sin nære slektning, mor foreldre Aribidopsis Thaliana.Sammenligning av Schrenkiella Parvula med Aribidopsis Thaliana kan gi innsikt i avvik i genregulering og funksjon som muliggjør unik tilpasning av Schrenkiella parvula. Transformasjonsprotokollen for Arabidopsis Thaliana er allerede godt etablert. Metoden muliggjør nå komparative studier ved hjelp av transgene Schrenkiella Parvula planter.Generelt forskere nye til denne metoden vil slite på grunn av blomstrende vane og blad morfologi av Schrenkiella Parvula planter som gjør effektiv transformasjon ved hjelp av en flora dip samt valg av sanne transformants vanskelig. Til å begynne med, bruk en våt tannpirker til å overføre ca 20 til 25 S.Parvula frø på våt jord. Deretter stratifisere frøene på fire grader celsius i fem til syv dager.Etter stratifisering, returnere frøene til vekstkammeret i syv til 10 dager. Når alle plantene har spiret, la bare en frøplante i hvert av de fire hjørnene og i midten av pottene. Vokse plantene i åtte til 10 uker i vekstkammeret til de blomstrer.På transformasjonsdagen velger du S.Parvula-anlegg i henhold til tekstprotokollen. Bruk tang og liten saks for å fjerne eventuelle pollinerte blomsterstander som allerede utvikler seg til siliques. Etter at plantene er klare, lag en agrobacterium infiltrasjonsløsning.Etter dette dypper du S.Parvula-blomsterstanden i agrobacterium infiltrasjonsløsning i 20 sekunder. Vist her er den tidligste fasen av plantene som kan brukes til transformasjon, så lenge allerede utviklede siliques fjernes før transformasjon, kan eldre planter med flere blomster brukes. Etter transformasjonen, plasser blomsterdyppet planter horisontalt i rene skuffer med kupler for å dekke plantene.Plasser deretter plantene i et mørkt vekstrom i en til to dager. Returner plantene til en oppreist stilling og overfør dem til vekstrommet. I den påfølgende uken, overvåke de dyppet blomsterstander.Ti dager etter den første blomsterdyppen vil S.Parvula-plantene fortsette å produsere nye blomsterstander og siliques. En ny runde med blomsterdukk kan utføres for å ytterligere forvandle de nyvoksende blomstene. Dyrking plantene til frøene modnes, og høst frøene rundt 21 uker.Tørk frøene i to til tre uker ved romtemperatur i en lufttett beholder fylt med tørkemidler. Plant T en frø i henhold til tekstprotokollen. Dyrke plantene til de første to til tre sanne bladene utvikler seg.For å utføre det første valget for ugressmiddelresistens, fortynne glufosinate ammonium ugressmiddel og spray det på plantene. Dekk plantene med kuplene over natten. Sett skuffene tilbake til vekstrommet, og fjern kuppelen.Vent til de fleste plantene er valgt ut av ugressmiddelet. For å begynne det andre valget, identifiser plantene som overlever etter å ha blitt sprayet tre til fire ganger med BASTA-løsningen. Etter å ha dyrket plantene i to til tre uker, velg det største modne bladet på hver plante.Deretter gni overflaten av bladet forsiktig med en finger for å fjerne vokslaget. Legg deretter en dråpe av den fortynnede BASTA-løsningen på bladet. Overvåk bladene behandlet med BASTA-løsningen for tegn på visner i opptil en uke.Til slutt velger du plantene med blader upåvirket av BASTA-dråpene for videre analyse. I denne protokollen ble S.Parvula forvandlet med agrobacterium ved hjelp av en floral dip metode. Infeksjon med agrobacterium resulterte i abort av noen blomster.Men S.Parvula-plantene fortsatte å produsere nye blomster etter den første blomstdyppingen, og kunne forvandles igjen. Ved hjelp av BASTA spray og slipp tester, kan ekte positive transformanter identifiseres nøyaktig. Antall prøver som er testet ved hjelp av PCR-bekreftelse, kan reduseres.Mens denne metoden ligner transformasjonen av Arabidopsis Thaliana, er det viktig å huske forskjellene i vekst og morfologi av Schrenkiella Parvula. Endring av protokollen for å gjenspeile disse forskjellene er avgjørende for vellykket transformasjon. Denne teknikken kan hjelpe forskere med å utforske utviklingen av genomiske variasjoner som fører til flere saltstresstilpasninger i ekstremophyte-modellen, Schrenkiella Parvula.Kombinere denne teknikken med informasjon om funksjonene til Aradopsis Thaliana, en annen plante nært knyttet til Schrenkiella Parvula. Forskere kan studere variasjonene i reguleringen og funksjoner som dette er to forskjellige strukturer mellom disse to artene. Under transformasjonsprosessen er det viktig å inneholde all agrobacterium infiltrasjonsløsning i autoklaverbare beholdere.Steriliser og kast alle materialene som kom i kontakt med agrobacterium, inkludert hansker, makropipettespisser og papirhåndklær.

Research

JoVE Journal

Genetics

Plant Growth and Agrobacterium-mediated Floral-dip Transformation of the Extremophyte Schrenkiella parvula

A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation

En robot plattform for High-throughput Protoplast Isolering og Transformation

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal ...

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Genetisk manipulering av Plant Patogen<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; Å studere Fungal Biology and Plant mikrobe interaksjoner

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

The Use of Induced Somatic Sector Analysis (ISSA) for Studying Genes and Promoters Involved in Wood Formation and Secondary Stem Development

The Use of Induced Somatic Sector Analysis ISSA for Studying Genes and Promoters Involved in Wood Formation and Secondary Stem Development

Bruk av indusert Somatisk Sector Analysis (ISSA) for å studere gener og arrangører involvert i Wood Dannelse og Sekundær Stem Development

Secondary stem growth in trees and associated wood formation are significant both from biological and commercial perspectives. However, relatively little ...

Rapid Deletion Production in Fungi via Agrobacterium Mediated Transformation of OSCAR Deletion Constructs

Rapid Deletion Production in Fungi via Agrobacterium Mediated Transformation of OSCAR Deletion Constructs

Rapid Deletion Produksjon i Fungi via<em&gt; Agrobacterium</em&gt; Mediated Transformation of OSCAR Deletion Constructs

Precise deletion of gene(s) of interest, while leaving the rest of the genome unchanged, provides the ideal product to determine that particular ...

Assessment of DNA Contamination in RNA Samples Based on Ribosomal DNA

Vurdering av DNA forurensning i RNA eksempler basert på Ribosomal DNA

One method extensively used for the quantification of gene expression changes and transcript abundances is reverse-transcription quantitative real-time ...

Purification of High Molecular Weight Genomic DNA from Powdery Mildew for Long-Read Sequencing

Rensing av High Molecular Weight Genomisk DNA fra meldugg for Long-Les Sekvense

The powdery mildew fungi are a group of economically important fungal plant pathogens. Relatively little is known about the molecular biology and genetics ...

Optimization and Comparative Analysis of Plant Organellar DNA Enrichment Methods Suitable for Next-generation Sequencing

Optimalisering og sammenligningsanalyse av organellar DNA-berigelsesmetoder som er egnet for neste generasjons sekvensering

Plant organellar genomes contain large, repetitive elements that may undergo pairing or recombination to form complex structures and/or sub-genomic ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Robust DNA isolasjon og høy gjennomstrømming sekvensering biblioteket konstruksjon for Herbarium prøver

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

Utforske rot Microbiome: utpakking bakterielle samfunnet Data fra jord, Rhizosphere og rot Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

Discrimintion and Mapping of the Primary and Processed Transcripts in Maize Mitochondrion Using a Circular RT-PCR-based Strategy

Discrimintion og kartlegging av primær og behandlet transkripsjoner i mais mitokondrie bruke en sirkulær RT-PCR-basert strategi

In plant mitochondria, some steady-state transcripts have 5&#39; triphosphate derived from transcription initiation (primary transcripts), while the ...