Name: plant growth and agrobacterium-mediated floral-dip transformation of the extremophyte schrenkiella parvula
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Plant Growth and Agrobacterium-mediated Floral-dip Transformation of the Extremophyte Schrenkiella parvula at JoVE.com

Bu eser bir Ulusal Bilim Vakfı Ödülü MCB 1616827 tarafından desteklenmiştir.

1. bitki büyüme
<ol><li>
Tohum sterilizasyon (isteğe bağlı)
	<ol>
<li>1 çift-distile su (GKD2O) % 50 çamaşır suyu hazırlamak veya 2 damla non-iyonik bir deterjan ( Tablo malzemelerigörmek) 50 mL tüp içinde. Tüp birkaç kez çözüm karıştırmak için tersine çevirin. Not: Tohum sterilizasyon 15dk için bir UV steril yüzey ile kabine laminar akışı yapmak için tercih edilir.</li>
		<li>Çamaşır suyu çözüm ~ 100-200'e ekleyin S...

<ol>
	<li>Dassanayake, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+of+the+extremophile+crucifer+Thellungiella+parvula.">The genome of the extremophile crucifer Thellungiella parvula.</a> Nature Genetics. 43 (9), 913-918 (2011).</li><li>Oh, D. -. H., Dassanayake, M., Bohnert, H. J., Cheeseman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+at+the+extreme:+lessons+from+the+genome.">Life at the extreme: lessons from the genome.</a> Genome Biology. 13 (3), 241 (2012).</li><li>Whited, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Next+Top+Models.">The Next Top Models.</a> Cell. 163 (1), 18-20 (2015).</li><li>Dassanayake, M., Yun, D. O. D., Bressan, R. A., Cheeseman, J. M., Bohnert, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+scope+of+things+to+come:+New+paradigms+in+biotechnology.">The scope of things to come: New paradigms in biotechnology.</a> Plant Biotechnology and Agriculture: Prospects for the 21st Century. , 19-34 (2009).</li><li>Dittami, S. M., Tonon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomes+of+extremophile+crucifers:+New+platforms+for+comparative+genomics+and+beyond.">Genomes of extremophile crucifers: New platforms for comparative genomics and beyond.</a> Genome Biology. 13 (8), 166 (2012).</li><li>Amtmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Learning+from+evolution:+Thellungiella+generates+new+knowledge+on+essential+and+critical+components+of+abiotic+stress+tolerance+in+plants.">Learning from evolution: Thellungiella generates new knowledge on essential and critical components of abiotic stress tolerance in plants.</a> Molecular Plant. 2 (1), 3-12 (2009).</li><li>Oh, D. -. H., Hong, H., Lee, S. Y., Yun, D. -. J., Bohnert, H. J., Dassanayake, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+structures+and+transcriptomes+signify+niche+adaptation+for+the+multiple-ion-tolerant+extremophyte+Schrenkiella+parvula.">Genome structures and transcriptomes signify niche adaptation for the multiple-ion-tolerant extremophyte Schrenkiella parvula.</a> Plant Physiology. 164 (4), 2123-2138 (2014).</li><li>Orsini, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+salt+tolerance+parameters+in+11+wild+relatives+of+Arabidopsis+thaliana.">A comparative study of salt tolerance parameters in 11 wild relatives of Arabidopsis thaliana.</a> Journal of Experimental Botany. 61 (13), 3787-3798 (2010).</li><li>Uzilday, B., Ozgur, R., Sekmen, A. H., Yildiztugay, E., Turkan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+alternative+electron+sinks+and+antioxidant+defence+in+chloroplasts+of+the+extreme+halophyte+Eutrema+parvulum+(Thellungiella+parvula)+under+salinity.">Changes in the alternative electron sinks and antioxidant defence in chloroplasts of the extreme halophyte Eutrema parvulum (Thellungiella parvula) under salinity.</a> Annals of Botany. 115 (3), 449-463 (2015).</li><li>Teusink, R. S., Rahman, M., Bressan, R. A., Jenks, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cuticular+waxes+on+Arabidopsis+thaliana+close+relatives+Thellungiella+halophila+and+Thellungiella+parvula.">Cuticular waxes on Arabidopsis thaliana close relatives Thellungiella halophila and Thellungiella parvula.</a> International Journal of Plant Sciences. 163 (2), 309-315 (2002).</li><li>Jarvis, D. E., Ryu, C. H., Beilstein, M. A., Schumaker, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+for+SOS1+in+the+convergent+evolution+of+salt+tolerance+in+Eutrema+salsugineum+and+Schrenkiella+parvula.">Distinct roles for SOS1 in the convergent evolution of salt tolerance in Eutrema salsugineum and Schrenkiella parvula.</a> Molecular Biology and Evolution. 31 (8), 2094-2107 (2014).</li><li>Clough, S. J., Bent, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Floral+dip:+A+simplified+method+for+Agrobacterium-mediated+transformation+of+Arabidopsis+thaliana.">Floral dip: A simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.</a> Plant Journal. 16 (6), 735-743 (1998).</li><li>Koornneef, M., Meinke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+Arabidopsis+as+a+model+plant.">The development of Arabidopsis as a model plant.</a> Plant Journal. 61 (6), 909-921 (2010).</li><li>Bai, J., Wu, F., Mao, Y., He, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+planta+transformation+of+Brassica+rapa+and+B.+napus+via+vernalization-infiltration+methods.">In planta transformation of Brassica rapa and B. napus via vernalization-infiltration methods.</a> Protocol Exchange. 10, 1028 (2013).</li><li>Sparrow, P. A. C., Goldsack, C. M. P., &#216;stergaard, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+technology+in+the+Brassicaceae.">Transformation technology in the Brassicaceae.</a> Genetics and Genomics of the Brassicaceae. , 505-525 (2011).</li><li>Hoagland, D. R., Arnon, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+water-culture+method+for+growing+plants+without+soil.">The water-culture method for growing plants without soil.</a> California Agricultural Experiment Station Circular. 347 (347), 1-32 (1950).</li><li>Saiki, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer-directed+enzymatic+amplification+of+DNA+with+a+thermostable+DNA+polymerase.">Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase.</a> Science. 239 (4839), 487-491 (1988).</li><li>Sun, Y., Sriramajayam, K., Luo, D., Liao, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Quick,+cost-free+method+of+purification+of+dna+fragments+from+agarose+gel.">A Quick, cost-free method of purification of dna fragments from agarose gel.</a> Journal of Cancer. 3, 93-95 (2012).</li><li>Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+sequencing+with+chain-terminating+inhibitors.">DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12), 5463-5467 (1977).</li><li>Bertani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+Lysogenesis+I.+The+mode+of+phage+liberation+by+lysogenic+Eschericia+coli.">Studies on Lysogenesis I. The mode of phage liberation by lysogenic Eschericia coli.</a> Journal of Bacteriolgy. 62 (3), 293-300 (1951).</li><li>Koncz, C., Martini, N., Szabados, L., Hrouda, M., Bachmair, A., Schell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specialized+vectors+for+gene+tagging+and+expression+studies.">Specialized vectors for gene tagging and expression studies.</a> Plant Molecular Biology Manual. , 53-74 (1994).</li><li>Weigel, D., Glazebrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+Agrobacterium+using+electroporation.">Transformation of Agrobacterium using electroporation.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (30), (2006).</li><li>Murray, M. G., Thompson, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+high+molecular+weight+plant+DNA.">Rapid isolation of high molecular weight plant DNA.</a> Nucleic Acids Research. 8 (19), 4321-4326 (1980).</li><li>Inan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salt+cress.+a+halophyte+and+cryophyte+Arabidopsis+relative+model+system+and+its+applicability+to+molecular+genetic+analyses+of+growth+and+development+of+extremophiles.">Salt cress. a halophyte and cryophyte Arabidopsis relative model system and its applicability to molecular genetic analyses of growth and development of extremophiles.</a> Plant Physiol. 135 (3), 1718-1737 (2004).</li><li>Ghedira, R., De Buck, S., Nolf, J., Depicker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+efficiency+of+Arabidopsis+thaliana+floral+dip+transformation+is+determined+not+only+by+the+Agrobacterium+strain+used+but+also+by+the+physiology+and+the+ecotype+of+the+dipped+plant.">The efficiency of Arabidopsis thaliana floral dip transformation is determined not only by the Agrobacterium strain used but also by the physiology and the ecotype of the dipped plant.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 26 (7), 823-832 (2013).</li><li>Shaohong, F. U., Xianya, W. E. I., Yingze, N. I. U., Shixing, G. U. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+Brassica+napus+with+the+method+of+floral-dip.">Transformation of Brassica napus with the method of floral-dip.</a> Biotechnology: Genomics and Its Applications. , 45-49 (2005).</li><li>Li, J., Tan, X., Zhu, F., Guo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+simple+method+for+Brassica+napus+floral-dip+transformation+and+selection+of+transgenic+plantlets.">A rapid and simple method for Brassica napus floral-dip transformation and selection of transgenic plantlets.</a> International Journal of Biology. 2 (1), 127 (2010).</li><li>Li, H. Q., Xu, J., Chen, L., Li, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+an+efficient+Agrobacterium+tumefaciens-mediated+leaf+disc+transformation+of+Thellungiella+halophila.">Establishment of an efficient Agrobacterium tumefaciens-mediated leaf disc transformation of Thellungiella halophila.</a> Plant Cell Reports. 26 (10), 1785-1789 (2007).</li><li>Wu, G., Rossidivito, G., Hu, T., Berlyand, Y., Poethig, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traffic+lines:+New+tools+for+genetic+analysis+in+Arabidopsis+thaliana.">Traffic lines: New tools for genetic analysis in Arabidopsis thaliana.</a> Genetics. 200 (1), 35-45 (2015).</li></ol>

Bitkinin fizyolojik devlet dönüştürme25verimliliğini önemli ölçüde etkiler. Sağlıklı ve dinç bitkilerin kullanımı için dönüştürme başarılı dönüşüm içinde S. parvulaiçin anahtar bir gereksinimdir. Su veya hafif stresli bitkiler sağlıklı bitkiler için dönüşüm (Şekil 1, merkezi panel) ideal kıyasla daha az çiçek olacak. S. parvula hafif yoğunlukta büyüyebilir daha az 130 µmol m-2 s-1ama ...

Bu protokol için büyüme ve extremophyte model Schrenkiella parvulaiçin kararlı transgenik hatları kurulması açıklanmaktadır. Verimli dönüştürme sistemin herhangi bir çok yönlü genetik model damgasını olduğunu. Aşırı ortamlarda gelişirler bitkiler extremophytes, kritik bir kaynak sağlamak bitki uyarlamaları için çevresel stresleri anlamak için kabul edilir. Schrenkiella parvula (eski adıyla Thellungiella parvula ve Eutrema parvulum) genomik kaynakları1,2,3,4,5genişletilmesi ile böyle bir extremophyte model, olduğunu. Ancak, dönüşüm protokolleri henüz S. parvula için yayınlanmış çalışmalarda bildirilmiştir değil.
S. parvula genom Turpgiller (hardal-lahana aile) ilk yayımlanan extremophyte genom olup geniş bir genel genom synteny sigara extremophyte modeli, Arabidopsis thaliana1ile gösterir. Böylece, A. thaliana ve S. parvula arasında karşılaştırmalı çalışmalar genetik çalışmalar parvula S. genom nasıl gelişti ve düzenlenmiş bilgilendirici hipotezler yapmak A. thaliana üzerinde gerçekleştirilen zenginliği yarar farklı şekilde başa çıkmak için5,6,7aşırı çevre vurguluyor. S. parvula (toprak NaCl LD50 dayalı) tuz en dayanıklı türlerin bilinen yabani akrabaları arasında A. thaliana8biridir. Ek olarak NaCl hoşgörü, S. parvula ve hayatta yüksek konsantrasyonlarda toksik çoğu bitkiler7' ye birden çok tuz iyonları huzurunda ömrünü tamamlayan. Abiyotik stres doğal tabiatında yaygın yanıt olarak, çeşitli özellikleri, aralarında birkaç biyokimyasal ya da fizyolojik düzey 8,9,10okudu gelmifltir, 11.
2010 yılından bu yana, S. parvula bir hedef tür olarak ya bir karşılaştırma ile diğer bitki genom kullanılan 400'den fazla eş-reveiwed yayınları olmuştur. Ancak, açık bir performans sorunu ne tür çalışmalar yürütülen bir daha yakından bakmak ile belirlenmiştir. Bu raporlar çoğunluğu S. parvula potansiyelini kullanmak gelecek çalışmalarda tartışmak veya karşılaştırmalı genomik veya phylogenomic çalışmalar kullanın. Bir kanıtı-of-concept dönüştürme iletişim kuralı olmaması nedeniyle kurulan S. parvulaiçin o değil kullanılan en yüksek kalite bitki genom bugüne kadar mevcut biri olmasına rağmen fonksiyonel genomik çalışmalar (> 5 Mb dokunma N50) toplandı ve kromozom düzeyi pseudomolecules1açıklamalı.
Agrobacterium aracılı daldırma çiçek dönüşüm yöntemi A. thalianaiçinde trasngenic satırları oluşturmak için en geniş kullanılan yöntem haline gelmiştir ve dönüşümünün bir tekrarlanabilir sisteminin geliştirilmesi başarısını kritik bir faktör oldu bir genetik model12,13. Ancak, tüm turpgiller türler başarıyla A. thalianaiçin geliştirilen çiçek daldırma yöntemiyle dönüştürülmesi için gösterilmiştir. Özel olarak, S. parvula dahil turpgiller Lineage II tür çiçek daldırma tabanlı dönüştürme yöntemleri14,15' e inatçı oldu.
S. parvuladar yaprak morfolojisi ile kombine, belirsiz çiçekli büyüme alışkanlığı zorlu standart Agrobacterium aracılı daldırma çiçek dönüşüm yöntemi benimsemeye yaptı. Bu çalışmada, S. parvulatekrarlanabilir dönüşüm için geliştirdiğimiz değiştirilmiş Protokolü rapor.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1303px;" width="1302">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Agar</td>
			<td style="width:293px;">VWR International, Radnor, PA</td>
			<td style="width:127px;">90000-762</td>
			<td style="width:541px;">Bacto Agar Soldifying Agent, BD Diagnostics</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B5 vitamins</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>G1019</td>
			<td>Gamborg&#8217;s Vitamin Solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Desiccant</td>
			<td>W A Hammond Drierite, Xenia, OH</td>
			<td style="width:127px;">22005</td>
			<td>Indicating DRIERITE 6 mesh</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:341px;">Destination vector for plant transformation</td>
			<td>TAIR</td>
			<td style="width:127px;">Vector:6531113857</td>
			<td>pKGWFS7</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Electroporation cuvette</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>9104-5050</td>
			<td>Electroporation cuvette, round cap, 0.2 cm gap</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Electroporator</td>
			<td>BIO-RAD Laboratories, Hercules, CA</td>
			<td>1652100</td>
			<td>MicroPulser Electroporator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fertilizer beads</td>
			<td>Osmocote Garden, Marysville, OH</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Osmocote Smart-Release Plant Food&#160;Flower &#38; Vegetable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gel extraction kit</td>
			<td>iNtRON Biotechnology, Boston, MA</td>
			<td>17289</td>
			<td>MEGAquick-spin Total fragment DNA purification kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gentamicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>G1914-5G</td>
			<td>Gentamicin sulfate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Glufosinate-ammonium (11.3%) herbicide (BASTA)</td>
			<td>Bayer environmental science, Montvale, NJ</td>
			<td>N/A</td>
			<td>FINALE herbicide</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kanamycin</td>
			<td>VWR International, Radnor, PA</td>
			<td>200004-444</td>
			<td>Kanamycin monosulfate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MES</td>
			<td>Bioworld, Dublin, OH</td>
			<td>41320024-2</td>
			<td>MES, Free Acid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MS salt</td>
			<td>MP Biomedicals, Santa Anna, CA</td>
			<td>092621822</td>
			<td>Hoagland&#39;s modified basal salt mixture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N6-benzylaminopurine (BA)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>B3274</td>
			<td>6-Benzylaminopurine solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td>Sigma-Alrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>Sodium chloride</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Non-ionic detergent</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td>TWEEN 20&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Plasmid isolation kit</td>
			<td>Zymo Research, Irvine, CA</td>
			<td>D4036</td>
			<td>Zyppy Plasmid Kits</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinase enzyme mix kit</td>
			<td>Life Technology</td>
			<td>11791-020</td>
			<td>Gateway LR Clonase II Enzyme mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rifampicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>R3501-1G</td>
			<td>Rifampicin, powder, &#62;= 97% (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Shaking incubator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>SHKE4450</td>
			<td>MaxQ 4450 Benchtop Orbital Shakers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Soil mix</td>
			<td>Sun Gro</td>
			<td>SUN239223328CFLP</td>
			<td>Sun Gro Metro-Mix 360 Grower Mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spectinomycin</td>
			<td>VWR International, Radnor, PA</td>
			<td>IC15206705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile 50ml conical tubes</td>
			<td>USA Scientific, Ocala, FL</td>
			<td>1500-1811</td>
			<td>50 ml conical screw cap tubes, copolymer, racks, sterile</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sucrose</td>
			<td>VWR International, Radnor, PA</td>
			<td>57-50-1</td>
			<td>Sucrose, ACS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Surfactant solution</td>
			<td>Lehle seeds, Round Rock, TX</td>
			<td>VIS-02</td>
			<td>Silwet L-77</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Topoisomerase-based cloning kit</td>
			<td>Life Technologies, Carlsbad, CA</td>
			<td>K240020</td>
			<td>pENTR/D-TOPO Cloning Kit, with One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tryptone</td>
			<td>VWR International, Radnor, PA</td>
			<td>90000-282</td>
			<td>BD Bacto Tryptone, BD Biosciences</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast Extract</td>
			<td>VWR International, Radnor, PA</td>
			<td>90000-722&#160;</td>
			<td>BD Bacto Yeast Extract, BD Biosciences</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

plant growth and agrobacterium-mediated floral-dip transformation of the extremophyte schrenkiella parvula

Schrenkiella parvula bir extremophyte birden fazla iyon toksisite gerilmeler de dahil olmak üzere çeşitli abiyotik stres için adapte olduğunu. Rağmen yüksek kaliteli genomik kaynakları kullanılabilir nasıl bitkiler için çevre uyum çalışmaya vurguluyor, fonksiyonel genomik model olarak değerini ve aracı uygun dönüşüm sistemi eksikliği tarafından sınırlı. Bu protokol için biz nasıl istikrarlı transgenik S. parvula oluşturmak için raporu bir Agrobacterium aracılı çiçek daldırma yöntemiyle hatları. S. parvula, benzersiz özellikleri bir belirsiz çiçekli alışkanlık ve yapraklarda yüksek epicuticular balmumu içeriği gibi hesaba A. thaliana için kullanılan dönüştürme iletişim kuralını değiştiren. Kısaca, S. parvula tohum dikim önce beş gün boyunca 4 ° C'de tabakalı. Bitkiler bir photoperiod 14 h ışık ve 10 h karanlık ve bir 130 µmol m-2s-1 ışık şiddeti, 22 ° c ile 24 ° c de yetiştirilmiştir Sekiz dokuz haftalık bitkiler birden fazla çiçek ile dönüşüm için seçildi. Bu çiçek pMP90RK plazmid taşıyan bir infiltrasyon çözümde Agrobacterium tumefaciens GV3101, daldırma. Çiçek üç ila dört hafta dönüşüm verimliliği artırmak için zaman aralığı ile daldırma iki tur gerçekleştirilen. T1 tohum toplanmış ve çimlenme için aday ekran satırları dönüşüm önce dört hafta için bir konteyner Nem Çekiciler ile kurutulmuş. BASTA direnç T1 bitkiler ekran için kullanıldı. BASTA çözüm üç kez üç gün yanlış pozitif azaltmak için iki haftalık bitkiler başlangıç aralığı ile püskürtülür. BASTA damla test gerçek pozitif transformants tanımlamak için bireysel bitkiler kalan gerçekleştirildi. Dönüşüm verimliliği %0.033 3-4 transgenik bitkiler başına 10.000 T1 tohumları yayılır verimli oldu.

Geliştirdiğimiz T0 tohumları 150 gün içinde hasat sağlayan dönüştürme protokol bundan A. thalianaiçin değiştirilmiş bir çiçek daldırma yöntemiyle. Şekil 1 zaman çizelgesi ve dönüşümü daldırma çiçek üzerinden yürütmek için en iyi sahne temsil S. parvula bitkiler bir özetini gösterir. 60-80 gün sonra dönüştürme için hedef sahne olarak çimlenme sırasında birden fazla çiçek S. parvula</...

Watch this Scientific Journal Video about Plant Growth and Agrobacterium-mediated Floral-dip Transformation of the Extremophyte Schrenkiella parvula at JoVE.com

Plant Growth and Agrobacterium-mediated Floral-dip Transformation of the Extremophyte Schrenkiella parvula

Bitki büyüme ve Floral daldırma dönüşümün Agrobacterium aracılı Extremophyte Schrenkiella parvula

Agrobacterium aracılı dönüşümü daldırma çiçek yöntemini kullanarak başarılı bir şekilde Schrenkiella parvulaextremophyte modelinin kararlı transgenik satırları oluşturmak için istihdam edilebilir. Biz bundan farklı büyüme alışkanlıkları ve extremophyte fizyolojik özellikleri dikkate alınarak Arabidopsis thalianaiçin değiştirilmiş bir iletişim kuralı mevcut.

Schrenkiella parvula is an extremophyte adapted to various abiotic stresses, including multiple ion toxicity stresses. Despite high-quality genomic ...

Schrenkiella parvula için tekrarlanabilir bir dönüşüm protokolü olan bu yöntem, özellikle sert ortamlara bitki adaptasyonlarını araştıran çalışmalar olmak üzere, bitki karşılaştırmalı ve fonksiyonel genomlama alanındaki soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu teknik, schrenkiella parvula'da çoklu iyon tuz gerilmelerine uyarlanmış ekstremofit üzerindeki rutin fonksiyonların araştırılmasını sağlar. Aynı zamanda yakın akrabası, anne ebeveyn Aribidopsis Thaliana bakar karşılaştırmalı çalışmalar sağlar.Schrenkiella Parvula'nın Aribidopsis Thaliana ile karşılaştırılması, Schrenkiella parvulanın benzersiz adaptasyonunu sağlayan gen regülasyonu ve fonksiyonundaki varyanslar hakkında fikir verebilir. Arabidopsis Thaliana için dönüşüm protokolü zaten iyi kurulmuş. Yöntem şimdi transgenik Schrenkiella Parvula bitkileri kullanarak karşılaştırmalı çalışmalar sağlar.Genellikle bu yönteme yeni araştırmacılar çiçekli alışkanlığı ve bir flora daldırma kullanarak etkili dönüşüm yapmak Schrenkiella Parvula bitkilerin yaprak morfolojisi yanı sıra gerçek dönüştürücülerin seçimi zor nedeniyle mücadele edecek. Başlamak için, ıslak toprak üzerine yaklaşık 20-25 S.Parvula tohumu aktarmak için ıslak bir kürdan kullanın. Sonra beş ila yedi gün boyunca dört derece santigrat tohumları tabakalı.Tabakalaşmadan sonra tohumları 7-10 gün boyunca büyüme odasına geri döndürün. Tüm fideler çimlendikten sonra, her dört köşede ve tencerenin ortasına sadece bir fide bırakın. Onlar çiçek kadar büyüme odasında sekiz ila 10 hafta boyunca bitkiler büyümek.Dönüşüm gününde, metin protokolüne göre S.Parvula tesislerini seçin. Zaten siliques içine gelişmekte olan herhangi bir tozlaşmış çiçeklenme kaldırmak için forceps ve küçük makas kullanın. Bitkiler hazır olduktan sonra, bir agrobacterium infiltrasyon çözeltisi hazırlayın.Bundan sonra, S.Parvula çiçeklenmesini 20 saniye boyunca agrobacterium infiltrasyon çözeltisi içine daldırın. Burada gösterilen dönüşüm için kullanılabilecek bitkilerin en erken aşamasıdır, sürece zaten gelişmiş siliques dönüşüm önce kaldırılır, daha fazla çiçek ile eski bitkiler kullanılabilir. Dönüşümden sonra, çiçekleri yatay olarak kubbeli temiz tepsilere koyarak bitkileri kaplayın.Sonra bir ila iki gün için karanlık bir büyüme odasında bitkiler yerleştirin. Dik bir konuma bitkiler dönün ve büyüme odasına aktarın. Takip eden hafta, daldırma çiçeklenmeleri izleyin.İlk çiçek daldırma on gün sonra, S.Parvula bitkiler yeni çiçeklenme ve siliques üretmeye devam edecektir. Çiçek daldırma ikinci bir tur daha yeni ortaya çıkan çiçeklenme dönüştürmek için yapılabilir. Tohumlar olgunlanıncaya kadar bitkileri büyütün ve tohumları yaklaşık 21 hafta hasat edin.Kurutucularla dolu hava geçirmez bir kapta oda sıcaklığında tohumları 2-3 hafta kurulayın. Metin protokolüne göre T bir tohumlarını ekin. İlk 2-3 gerçek yaprakları geliştirmek kadar bitkiler büyümek.Herbisit direnci için ilk seçimi gerçekleştirmek için, seyreltmek glufosinat amonyum herbisit ve fideler üzerine sprey. Fidelerin üzerini bir gecede kubbelerle kaplayın. Tepsileri büyüme odasına geri koy ve kubbeyi çıkar.Fidelerin çoğu herbisit tarafından seçilene kadar bekleyin. İkinci seçime başlamak için, BASTA çözeltisi ile üç ila dört kez püskürtülen bitkilerin belirlenmesi. Iki ila üç hafta daha bitkiler büyüdükten sonra, her bitki üzerinde en büyük olgun yaprak seçin.Sonraki balmumu tabakası kaldırmak için bir parmak ile yavaşça yaprak yüzeyine ovmak. Daha sonra yaprak üzerine seyreltilmiş BASTA çözeltisi bir damla yerleştirin. Bir haftaya kadar solma belirtileri için BASTA çözeltisi ile tedavi edilen yaprakları izleyin.Son olarak daha fazla analiz için BASTA damla etkilenmemiş yaprakları ile bitkiler seçin. Bu protokolde S.Parvula çiçek daldırma yöntemi ile agrobacterium ile dönüştürülmüştür. Agrobacterium ile enfeksiyon bazı çiçekler kürtaj ile sonuçlandı.Ancak S.Parvula bitkileri ilk çiçek daldırma sonra yeni çiçekler üretmeye devam etti ve tekrar dönüştürülebilir. BASTA sprey ve damla testleri kullanılarak, gerçek pozitif transformatanlar doğru bir şekilde tanımlanabilir. PCR onayı kullanılarak test edilen numune sayısı azaltılabilir.Bu yöntem Arabidopsis Thaliana dönüşümüne benzer olsa da, Schrenkiella Parvula'nın büyüme ve morfolojisindeki farklılıkları hatırlamak önemlidir. Protokolün bu farklılıkları yansıtacak şekilde değiştirilmesi, başarılı dönüşüm için çok önemlidir. Bu teknik, araştırmacıların ekstremofit modeli Schrenkiella Parvula'da birden fazla tuz stresi adaptasyonuna yol açan genomik varyasyonların evrimini keşfetmelerine yardımcı olabilir.Aradopsis Thaliana, schrenkiella Parvula ile yakından ilgili başka bir bitki fonksiyonları hakkında bilgi ile bu tekniği birleştirerek. Araştırmacılar, bu iki tür arasında iki farklı yapı olduğunu yönetmelik ve işlevleri varyasyonları inceleyebilirsiniz. Dönüşüm işlemi sırasında, otoklavlanabilir kaplarda tüm agrobacterium infiltrasyon çözümiçeren önemlidir.Eldivenler, makro pipet uçları ve kağıt havlular da dahil olmak üzere agrobacterium ile temas eden tüm malzemeleri sterilize edin ve güvenli bir şekilde atın.

Research

JoVE Journal

Genetics

Plant Growth and Agrobacterium-mediated Floral-dip Transformation of the Extremophyte Schrenkiella parvula

A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation

Yüksek verim Protoplast İzolasyonu ve Dönüşüm için Robotik Platformu

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal ...

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Bitki patojeni olarak genetik manipülasyonu<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; Mantar Biyoloji ve Bitki Mikrop Etkileşimleri Eğitim için

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

The Use of Induced Somatic Sector Analysis (ISSA) for Studying Genes and Promoters Involved in Wood Formation and Secondary Stem Development

The Use of Induced Somatic Sector Analysis ISSA for Studying Genes and Promoters Involved in Wood Formation and Secondary Stem Development

Ahşap Formasyonu ve İkincil Kök Gelişimi ile ilgilendim Genler ve Promoters incelenmesi için Kaynaklı Somatik Sektör Analizi (ISSA) Kullanımı

Secondary stem growth in trees and associated wood formation are significant both from biological and commercial perspectives. However, relatively little ...

Rapid Deletion Production in Fungi via Agrobacterium Mediated Transformation of OSCAR Deletion Constructs

Rapid Deletion Production in Fungi via Agrobacterium Mediated Transformation of OSCAR Deletion Constructs

Yoluyla mantarlarda hızlı Silme Üretimi<em&gt; Agrobacterium</em&gt; OSCAR Silme Yapılarının Aracı Dönüştürülmesi

Precise deletion of gene(s) of interest, while leaving the rest of the genome unchanged, provides the ideal product to determine that particular ...

Assessment of DNA Contamination in RNA Samples Based on Ribosomal DNA

DNA kirlenme ribozomal DNA tabanlı RNA örneklerinde değerlendirilmesi

One method extensively used for the quantification of gene expression changes and transcript abundances is reverse-transcription quantitative real-time ...

Purification of High Molecular Weight Genomic DNA from Powdery Mildew for Long-Read Sequencing

Uzun Okuma Dizi Yapmak İçin Küllemesi Yüksek Moleküler Ağırlık Genomik DNA saflaştırılması

The powdery mildew fungi are a group of economically important fungal plant pathogens. Relatively little is known about the molecular biology and genetics ...

Optimization and Comparative Analysis of Plant Organellar DNA Enrichment Methods Suitable for Next-generation Sequencing

Yeni nesil Sıralama için Uygun Bitki Organelleri DNA Zenginleştirme Yöntemlerinin Optimizasyonu ve Karşılaştırmalı Analizi

Plant organellar genomes contain large, repetitive elements that may undergo pairing or recombination to form complex structures and/or sub-genomic ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Sağlam DNA izolasyon ve yüksek işlem hacmi sıralama kitaplığı inşaat sulak numuneler için

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

Kök Microbiome keşfetmek: toprak, rizosferde ve kök Endosphere bakteriyel topluluk verileri ayıklama

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

Discrimintion and Mapping of the Primary and Processed Transcripts in Maize Mitochondrion Using a Circular RT-PCR-based Strategy

Dairesel bir RT-PCR tabanlı strateji kullanarak Maize mitochondrion 'da primer ve Işlenmiş transkriptlerin ayrımcılık ve haritalama

In plant mitochondria, some steady-state transcripts have 5&#39; triphosphate derived from transcription initiation (primary transcripts), while the ...