Name: visualizing and tracking endogenous mrnas in live drosophila melanogaster egg chambers
Uploaded: 2019-06-04T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers at JoVE.com

نشكر سلفاتوري أ. إ. ماتراس (مركز معهد بحوث الصحة العامة، جامعة روتجرز) على تركيب ووسم وتنقية منارات جزيئية، ودانيال سانت جونستون (معهد غوردون، جامعة كامبريدج) على أوسكار-MS2/ MCP-GFP الأسهم ذبابة المعدلة وراثيا. وقد تم دعم هذا العمل من قبل جائزة المؤسسة الوطنية للعلوم الوظيفي 1149738 وجائزة مؤتمر الموظفين الفنيين - CUNY إلى DPB.

1. تصميم MBs لتصوير الخلايا الحية
<ol><li>
طي تسلسل RNA الهدف للتنبؤ بالبنية الثانوية لهدف mRNA باستخدام "نموذج RNA" من خادم mfold (http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/RNA-Folding-Form).
	<ol>
<li>لصق /تحميل التسلسل المستهدف في شكل FASTA، حدد 5 أو 10٪ دون الأمثل (هياكل مع طاقة مجانية للطي في غضون 5 أو 10٪ من قيمة MFE، على التو...

<ol>
	<li>Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+RNA+distribution+and+dynamics+in+living+cells.">Imaging intracellular RNA distribution and dynamics in living cells.</a> Nature Methods. 6 (5), 331-338 (2009).</li><li>Bao, G., Rhee, W. J., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+probes+for+live-cell+RNA+detection.">Fluorescent probes for live-cell RNA detection.</a> Annual Reviews of Biomedical Engineering. 11, 25-47 (2009).</li><li>Mannack, L. V., Eising, S., Rentmeister, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+techniques+for+visualizing+RNA+in+cells.">Current techniques for visualizing RNA in cells.</a> F1000Research. 5, (2016).</li><li>Larson, D. R., Zenklusen, D., Wu, B., Chao, J. A., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+observation+of+transcription+initiation+and+elongation+on+an+endogenous+yeast+gene.">Real-time observation of transcription initiation and elongation on an endogenous yeast gene.</a> Science. 332 (6028), 475-478 (2011).</li><li>Bertrand, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+ASH1+mRNA+particles+in+living+yeast.">Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast.</a> Molecular Cell. 2 (4), 437-445 (1998).</li><li>Garcia, J. F., Parker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MS2+coat+proteins+bound+to+yeast+mRNAs+block+5'+to+3'+degradation+and+trap+mRNA+decay+products:+implications+for+the+localization+of+mRNAs+by+MS2-MCP+system.">MS2 coat proteins bound to yeast mRNAs block 5' to 3' degradation and trap mRNA decay products: implications for the localization of mRNAs by MS2-MCP system.</a> RNA. 21 (8), 1393-1395 (2015).</li><li>Bratu, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+beacons:+Fluorescent+probes+for+detection+of+endogenous+mRNAs+in+living+cells.">Molecular beacons: Fluorescent probes for detection of endogenous mRNAs in living cells.</a> Methods in Molecular Biology. 319, 1-14 (2006).</li><li>Bratu, D. P., Cha, B. J., Mhlanga, M. M., Kramer, F. R., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+the+distribution+and+transport+of+mRNAs+in+living+cells.">Visualizing the distribution and transport of mRNAs in living cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 100 (23), 13308-13313 (2003).</li><li>Tyagi, S., Kramer, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+beacons:+probes+that+fluoresce+upon+hybridization.">Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization.</a> Nature Biotechnology. 14 (3), 303-308 (1996).</li><li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+beacon-based+approach+for+live-cell+imaging+of+RNA+transcripts+with+minimal+target+engineering+at+the+single-molecule+level.">A molecular beacon-based approach for live-cell imaging of RNA transcripts with minimal target engineering at the single-molecule level.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1550 (2017).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+detection+of+microRNAs+by+combining+molecular+beacon+probes+with+T7+exonuclease-assisted+cyclic+amplification+reaction.">Multiplex detection of microRNAs by combining molecular beacon probes with T7 exonuclease-assisted cyclic amplification reaction.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (1), 107-114 (2017).</li><li>Baker, M. B., Bao, G., Searles, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+quantification+of+specific+microRNA+using+molecular+beacons.">In vitro quantification of specific microRNA using molecular beacons.</a> Nucleic Acids Research. 40 (2), e13 (2012).</li><li>Ko, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+color-tunable+molecular+beacon+to+sense+miRNA-9+expression+during+neurogenesis.">A color-tunable molecular beacon to sense miRNA-9 expression during neurogenesis.</a> Scientific Reports. 4, 4626 (2014).</li><li>Vet, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+detection+of+four+pathogenic+retroviruses+using+molecular+beacons.">Multiplex detection of four pathogenic retroviruses using molecular beacons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 96 (11), 6394-6399 (1999).</li><li>Li, J., Cao, Z. C., Tang, Z., Wang, K., Tan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+beacons+for+protein-DNA+interaction+studies.">Molecular beacons for protein-DNA interaction studies.</a> Methods in Molecular Biology. 429, 209-224 (2008).</li><li>Li, W. M., Chan, C. M., Miller, A. L., Lee, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+Functional+Roles+of+Molecular+Beacon+as+a+MicroRNA+Detector+and+Inhibitor.">Dual Functional Roles of Molecular Beacon as a MicroRNA Detector and Inhibitor.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (9), 3568-3580 (2017).</li><li>Kuang, T., Chang, L., Peng, X., Hu, X., Gallego-Perez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Beacon+Nano-Sensors+for+Probing+Living+Cancer+Cells.">Molecular Beacon Nano-Sensors for Probing Living Cancer Cells.</a> Trends in Biotechnology. 35 (4), 347-359 (2017).</li><li>Ban, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-genetic+Purification+of+Ventricular+Cardiomyocytes+from+Differentiating+Embryonic+Stem+Cells+through+Molecular+Beacons+Targeting+IRX-4.">Non-genetic Purification of Ventricular Cardiomyocytes from Differentiating Embryonic Stem Cells through Molecular Beacons Targeting IRX-4.</a> Stem Cell Reports. 5 (6), 1239-1249 (2015).</li><li>Hadjinicolaou, A. V., Demetriou, V. L., Emmanuel, M. A., Kakoyiannis, C. K., Kostrikis, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+beacon-based+real-time+PCR+detection+of+primary+isolates+of+Salmonella+Typhimurium+and+Salmonella+Enteritidis+in+environmental+and+clinical+samples.">Molecular beacon-based real-time PCR detection of primary isolates of Salmonella Typhimurium and Salmonella Enteritidis in environmental and clinical samples.</a> BMC Microbiology. 9, 97 (2009).</li><li>McLaughlin, J. M., Bratu, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+melanogaster+Oogenesis:+An+Overview.">Drosophila melanogaster Oogenesis: An Overview.</a> Methods in Molecular Biology. 1328, 1-20 (2015).</li><li>Bastock, R., St Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+oogenesis.">Drosophila oogenesis.</a> Current Biology. 18 (23), R1082-R1087 (2008).</li><li>Rongo, C., Gavis, E. R., Lehmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+oskar+RNA+regulates+oskar+translation+and+requires+Oskar+protein.">Localization of oskar RNA regulates oskar translation and requires Oskar protein.</a> Development. 121 (9), 2737-2746 (1995).</li><li>Mhlanga, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+colocalisation+of+oskar+mRNA+and+trans-acting+proteins+revealed+by+quantitative+imaging+of+the+Drosophila+oocyte.">In vivo colocalisation of oskar mRNA and trans-acting proteins revealed by quantitative imaging of the Drosophila oocyte.</a> PLoS One. 4 (7), e6241 (2009).</li><li>Bayer, L. V., Omar, O. S., Bratu, D. P., Catrina, I. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PinMol:+Python+application+for+designing+molecular+beacons+for+live+cell+imaging+of+endogenous+mRNAs.">PinMol: Python application for designing molecular beacons for live cell imaging of endogenous mRNAs.</a> bioRxiv. , (2018).</li><li>Marras, S. A., Kramer, F. R., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiencies+of+fluorescence+resonance+energy+transfer+and+contact-mediated+quenching+in+oligonucleotide+probes.">Efficiencies of fluorescence resonance energy transfer and contact-mediated quenching in oligonucleotide probes.</a> Nucleic Acids Research. 30 (21), e122 (2002).</li><li>Bratu, D. P., Catrina, I. E., Marras, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tiny+molecular+beacons+for+in+vivo+mRNA+detection.">Tiny molecular beacons for in vivo mRNA detection.</a> Methods in Molecular Biology. 714, 141-157 (2011).</li><li>Dean, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+(pulling)+of+needles+for+gene+delivery+by+microinjection.">Preparation (pulling) of needles for gene delivery by microinjection.</a> Cold Spring Harbor. 2006 (7), (2006).</li><li>Alami, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+transport+of+TDP-43+mRNA+granules+is+impaired+by+ALS-causing+mutations.">Axonal transport of TDP-43 mRNA granules is impaired by ALS-causing mutations.</a> Neuron. 81 (3), 536-543 (2014).</li><li>Jackson, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+Hairpin+DNA-Functionalized+Gold+Nanoparticles+for+Imaging+mRNA+in+Living+Cells.">Applications of Hairpin DNA-Functionalized Gold Nanoparticles for Imaging mRNA in Living Cells.</a> Methods in Enzymology. 572, 87-103 (2016).</li><li>Zimyanin, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+oskar+mRNA+transport+reveals+the+mechanism+of+posterior+localization.">In vivo imaging of oskar mRNA transport reveals the mechanism of posterior localization.</a> Cell. 134 (5), 843-853 (2008).</li><li>Catrina, I. E., Marras, S. A., Bratu, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tiny+molecular+beacons:+LNA/2'-O-methyl+RNA+chimeric+probes+for+imaging+dynamic+mRNA+processes+in+living+cells.">Tiny molecular beacons: LNA/2'-O-methyl RNA chimeric probes for imaging dynamic mRNA processes in living cells.</a> ACS Chemical Biology. 7 (9), 1586-1595 (2012).</li><li>Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+cytosolic+delivery+of+molecular+beacon+conjugates+and+flow+cytometric+analysis+of+target+RNA.">Efficient cytosolic delivery of molecular beacon conjugates and flow cytometric analysis of target RNA.</a> Nucleic Acids Research. 36 (12), e69 (2008).</li><li>Nitin, N., Santangelo, P. J., Kim, G., Nie, S., Bao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide-linked+molecular+beacons+for+efficient+delivery+and+rapid+mRNA+detection+in+living+cells.">Peptide-linked molecular beacons for efficient delivery and rapid mRNA detection in living cells.</a> Nucleic Acids Research. 32 (6), e58 (2004).</li><li>Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avoiding+false-positive+signals+with+nuclease-vulnerable+molecular+beacons+in+single+living+cells.">Avoiding false-positive signals with nuclease-vulnerable molecular beacons in single living cells.</a> Nucleic Acids Research. 35 (16), e105 (2007).</li><li>Bevilacqua, P. C., Ritchey, L. E., Su, Z., Assmann, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+Analysis+of+RNA+Secondary+Structure.">Genome-Wide Analysis of RNA Secondary Structure.</a> Annual Review of Genetics. 50, 235-266 (2016).</li><li>Mhlanga, M. M., Vargas, D. Y., Fung, C. W., Kramer, F. R., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=tRNA-linked+molecular+beacons+for+imaging+mRNAs+in+the+cytoplasm+of+living+cells.">tRNA-linked molecular beacons for imaging mRNAs in the cytoplasm of living cells.</a> Nucleic Acids Research. 33 (6), 1902-1912 (2005).</li><li>Eliceiri, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+imaging+software+tools.">Biological imaging software tools.</a> Nature Methods. 9 (7), 697-710 (2012).</li><li>Bolte, S., Cordelieres, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guided+tour+into+subcellular+colocalization+analysis+in+light+microscopy.">A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy.</a> Journal of Microscopy. 224 (Pt 3), 213-232 (2006).</li><li>Trcek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+germ+granules+are+structured+and+contain+homotypic+mRNA+clusters.">Drosophila germ granules are structured and contain homotypic mRNA clusters.</a> Nature Commununications. 6, 7962 (2015).</li></ol>

يعتمد التصور المباشر للاتجار بالحمض النووي الريبي المحلي في غرف البيض Drosophila على استخدام MBs محددة وفعالة ومقاومة للنوكل، والتي يمكن الآن تصميمها بسهولة مع برنامج PinMol. MBs هي تحقيقات محددة مصممة للكشف عن تسلسل فريد ة داخل mRNA الهدف (ويفضل المناطق خالية من الهيكل الثانوي)، مما يجعل من ...

وقد أصبحت دراسات بيولوجيا الخلايا التي تصور الأحداث الدينامية ذات الاستبانة المكانية والزمنية ممكنة من خلال تطوير تقنيات التصوير بالخلايا الحية القائمة على الفلورة. في الوقت الحاضر، في التصور mRNA الجسم الحي يتحقق من خلال التكنولوجيات التي تقوم على التفاعلات الحمض النووي الريبي aptamer البروتين، RNA aptamer الناجمة عن الفلورة من الأصباغ العضوية والحمض النووي التحقيق الصلب1،2، 3.أنها توفر كل خصوصية عالية، والحساسية ونسبة الإشارة إلى الخلفية. ومع ذلك، تتطلب النُهج التي تركز على الحمض النووي الريبي معالجة جينية واسعة النطاق، حيث يتم تصميم الترانسجين للتعبير عن الحمض النووي الريبي مع الزخارف الهيكلية الاصطناعية المطلوبة لربط البروتين أو الصبغالعضوي. على سبيل المثال، يتطلب نظام MS2/MCP التعبير المشترك عن ترانسجين يعبر عن بنية RNA تحتوي على تكرارات متعددة جنبا إلى جنب من تسلسل ملزم للبروتين معطف MS2 البكتيريا (MCP)، وترميز آخر transgene بروتين الفلورسنت تنصهر إلىMCP 4،5. إضافة مثل هذه الزخارف الهيكلية الثانوية إلى الحمض النووي الريبي، جنبا إلى جنب مع بروتين الفلورسنت ضخمة الموسومة، أثارت مخاوف من أن عمليات الحمض النووي الريبي الأصلي قد تتأثر6. ومن التقنيات التي تعالج هذا الشاغل وتقدم مزايا فريدة إضافية هي النهج القائم على الحمض النووي، ومنارات الجزيئية (MBs). تسمح الـ MBs للكشف المتعدد عن mRNAs الذاتية، والتمييز في الاختلافات النيوكليوتيدات واحدة، وحركية سريعة للتهجين مع الهدف mRNA7،8. MBs هي تحقيقات oligonucleotide التي لا تزال في أضعاف دبوس الشعر المبردة قبل أن تمر بتغيير التشوه الفلورية بمجرد أن تهجين إلى أهدافها (الشكل1C)9. وقد حققت عدة مجموعات نجاحا في استخدام MBs للكشف عن كل من RNAs غير الترميز (microRNAs وlncRNAs)10،11،12،13،RNA الفيروسات الرجعية14 ودينامية الحمض النووي البروتين التفاعلات15. وقد تم استخدامها بنجاح للتصوير في مختلف الكائنات الحية والأنسجة، مثل أجنة حمار وحشي16، الخلايا العصبية13، أنسجة الورم17، التمييز بين خلايا القلب18، والسالمونيلا 19.
هنا نقوم بوصف نهج التصميم والتسليم والكشف عن mRNAs الذاتية في غرف البيض الحية D. melanogaster إلى جانب إعداد المجهرية التي هي سريعة بما فيه الكفاية لالتقاط مجموعة ديناميكية من النقل الجزيئي النشط. وقد عملت غرفة البيض D. melanogaster كنظام نموذج متعدد الخلايا مثالية لمجموعة واسعة من الدراسات التنموية، من تقسيم الخلايا الجذعية الجرثومية في وقت مبكر والتعبير الجيني الأمومي لتوليد خطة الجسم القطاعية20، 21. غرف البيض معزولة بسهولة، كبيرة وشفافة، وقادرة على تحمل ساعات من تحليل الجسم الحي السابق، مما يجعلها قابلة للغاية لتجارب التصوير. وقد ركز الكثير من العمل على توطين النصوص النفاسية غير المتماثلة في المناطق الفرعية المنفصلة قبل ترجمتها بنشاط. على وجه الخصوص، يجب أن يحدث توطين >أوسكار ميرنا« وترجمته اللاحقة في القطب الخلفي للبويطانة بطريقة منظمة بإحكام لتجنب النمط الظاهري الجنيني الثلاثي القاتل22. يتم نسخ oskar mRNA في 15 خلية جرثومية، وتسمى خلايا الممرضة، ويتم نقلها بنشاط من خلال الجسور السيتوبلازمية، وتسمى القنوات الدائرية، إلى البويضة، والخلية الجرثومية التي تصبح البويضة الناضجة ويتم إخصابها في نهاية المطاف (الشكل1A ). إن الكم الكبير من المعلومات المتاحة بالفعل فيما يتعلق بالتوظيف الدينامي وتبادل عوامل البروتين من وإلى أوسكار mRNP، إلى جانب سفره بعيد المدى داخل الخلايا، يجعل أوسكار مرشحاً مفضلاً للدراسة العديد من العمليات من دورة حياة mRNA. وقد لعبت MBs دوراً أساسياً في الكشف عن تفاصيل حول عملية توطين الحمض النووي الريبي وفك رموز تنظيم ووظيفة عوامل البروتين التي تتحكم في نقل الحمض النووي الريبي خلال Drosophila oogenesis. على وجه الخصوص ، عن طريق حقن الـ MBs الدقيقة في خلايا الممرضة وإجراء تجارب تصوير الخلايا الحية ، من الممكن تتبع mRNAs الذاتية8،23.
تقدم خارطة الطريق المعروضة هنا خطوات عملية كاملة، من إجراء تجربة تصوير الخلايا الحية باستخدام MBs، والحصول على بيانات التصوير، إلى إجراء تحليل البيانات لتتبع الحمض النووي الريبي المحلي في بيئته الخلوية الأصلية. ويمكن تعديل الخطوات وتحسينها لتلبية احتياجات الباحثين الذين يعملون مع الأنسجة/أنواع الخلايا الأخرى داخل إعداد المختبر الخاص بهم.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Spectrofluorometer</td>
			<td>Fluoromax-4 Horiba-Jobin Yvon</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Photon counting spectrofluorometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz cuvette</td>
			<td>Fireflysci (former Precision Cells Inc.)</td>
			<td>701MFL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 tweezer</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501985</td>
			<td>Thin tweezers are very important to separate out the individual egg chambers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 700</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slip No.1 22 x 40mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Leica MZ6 Leica Microsystems Inc.</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 fruit fly anesthesia pad</td>
			<td>Genesee Scienific</td>
			<td>59-114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCL pH7.5</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1185-53-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning disc confocal microscope</td>
			<td>Leica DMI-4000B inverted microscope equipped with Yokogawa CSU 10 spinning disc Leica Microsystems Inc.</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamamatsu C9100-13 ImagEM EMCCD camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PatchMan NP 2 Micromanipulator</td>
			<td>Eppendorf Inc.</td>
			<td>920000037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FemtoJet Microinjector</td>
			<td>Eppendorf Inc.</td>
			<td>920010504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection needle: Femtotips II</td>
			<td>Eppendorf Inc.</td>
			<td>930000043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading tip: 20ul Microloader</td>
			<td>Eppendorf Inc.</td>
			<td>930001007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Cover glasses no. 1 or 1.5, 22x40mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-026; 48393-172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry yeast</td>
			<td>Any grocery store</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer, &#62; 20 GB RAM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Although processing can be carried out on most computers, higher capabilities will increase the speed of the processing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing and tracking endogenous mrnas in live drosophila melanogaster egg chambers

وقد أحدثت تقنيات التصوير القائمة على الفلورة، بالاقتران مع التطورات في الفحص المجهري الضوئي، ثورة في كيفية قيام علماء الأحياء الخلوية بإجراء دراسات تصوير الخلايا الحية. وقد اتسع نطاق أساليب الكشف عن الـ RNAs بشكل كبير منذ أن ربطت الدراسات الجوهرية بين توطين الحمض النووي الريبي الخاص بالموقع وتنظيم التعبير الجيني. يمكن الآن تصور عمليات mRNA الديناميكية من خلال النهج التي تكشف عن mRNAs، إلى جانب إعداد المجهرية التي هي سريعة بما فيه الكفاية لالتقاط النطاق الديناميكي للسلوك الجزيئي. تكنولوجيا المنارة الجزيئية هي نهج قائم على التهجين قادر على الكشف المباشر عن النصوص الذاتية في الخلايا الحية. منارات جزيئيّة [هيربين-شبد], داخليّا يروي, [سنغل-نوكليوتيد] يميّز [نوكليك سد] تحقيقات, أيّ [فلورسّ] فقط على تهجين إلى تسلسل فريدة هدف. عندما يقترن مع المجهرية الفلورية المتقدمة والتصوير عالية الدقة، فإنها تمكن المرء من إجراء تتبع المكانية والزمانية للحركة داخل الخلايا من mRNAs. على الرغم من أن هذه التكنولوجيا هي الطريقة الوحيدة القادرة على الكشف عن النصوص الذاتية، علماء الأحياء الخلية لم تحتضن بعد تماما هذه التكنولوجيا بسبب صعوبات في تصميم مثل هذه التحقيقات لتصوير الخلايا الحية. تطبيق برنامج جديد، PinMol،يسمح لتصميم محسنوسريع من تحقيقات الأنسب لتهجين بكفاءة إلى المناطق المستهدفة mRNA داخل خلية حية. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الحصول على الصور عالية الدقة في الوقت الحقيقي والبرمجيات الحالية المفتوحة المصدر لتحليل الصور يسمح بإخراج بيانات محسنة، مما يؤدي إلى تقييم أدق للتعقيد الكامن وراء العمليات الدينامية التي تنطوي عليها دورة حياة mRNA.
هنا نقدم بروتوكول شامل لتصميم وتسليم منارات الجزيئية في غرف البيض Drosophila melanogaster. يتم إجراء الكشف المباشر والمحدد للغاية والتصور من mRNAs الأمومية الذاتية عن طريق قرص الغزل المجهرية البؤرية. تتم معالجة بيانات التصوير وتحليلها باستخدام الكشف عن الأجسام وتتبعها في البرامج الجليدية للحصول على تفاصيل حول الحركة الديناميكية للmRNAs، والتي يتم نقلها وتوطينها إلى مناطق متخصصة داخل البويضة.

باستخدام PinMol،يمكن تصميم العديد من MBs لهدف واحد mRNA (الشكل 1B-C). بعد التوليف والتنقية، تتميز MBs المختارة وتقارن باستخدام التحليل في المختبر.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58545/58545fig1.jpg"> الشكل 1: وصف التقنية ...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers at JoVE.com

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

هنا، نقدم بروتوكول للتصور، والكشف، وتحليل وتتبع الاتجار بالحمض النووي الريبي في غرفة البيض الحية Drosophila melanogaster باستخدام منارات الجزيئية، وقرص الغزل المجهرية البؤرية، وتحليل مفتوح المصدر البرمجيات.

تصور وتتبع mRNAs الذاتية في غرف البيض الحية Drosophila الميلانوجاستر البيض

Fluorescence-based imaging techniques, in combination with developments in light microscopy, have revolutionized how cell biologists conduct live cell ...

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال البيولوجيا RNA حول آلية ووظيفة تعريب الحمض النووي الريبي المستقطب. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بالتصور في الوقت الحقيقي للاتجار بالرنا الداخلي في الأنسجة الحية. الآثار المترتبة على هذه التقنية تمتد نحو العلاج من الأمراض ذات الصلة بالرنا لأنه لديه القدرة على الكشف عن أهداف علاجية جديدة.على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة في عمليات الحمض النووي الريبي في غرفة بيض ذبابة الفاكهة ، فإنه يمكن أيضا أن تطبق على أنظمة أخرى مثل في حمار وحشي أو الخلايا الثقافية. عموما، سوف الأفراد الجدد لهذه الطريقة النضال بسبب التحديات المرتبطة تصميم وتسليم الدعائم منارة الجزيئية. بالنسبة للضنان المجهري للناارة الجزيئية، حدد هدف الزيت 40X وقم بتركيب غطاء مع غرفة البيض التشريحية على مرحلة المجهر.حدد مكان غرفة البيض في مرحلة التطوير منتصف إلى وقت متأخر التي يتم توجيهها بشكل صحيح للضين الدقيق. ثم اقامة حاقن صغير مع الحقن المناسبة والضغوط التعويض. باستخدام عصا التحكم المتلاعبة الصغيرة ، قم بخفض إبرة محملة برفق بمتجر صغير واحد من محلول المنارة الجزيئي في قطرة الزيت.جلب تلميح في التركيز نحو محيط مجال الرؤية. قم بإجراء وظيفة نظيفة لإزالة الهواء من طرف الإبرة وضمان تدفق الإبرة من الإبرة وإحضار الإبرة إلى موضع المنزل. التركيز على غرفة البيض أن microinjected وجلب الإبرة مرة أخرى إلى التركيز بالقرب من حافة غرفة البيض.إجراء تعديل دقيق من موضع ض من الهدف بحيث الغشاء الذي يفصل الخلايا المسامية من الخلايا ممرضة هو في التركيز. أدخل الإبرة في خلية ممرضة لحقن المنارات الجزيئية على مدى فترة من ثانيتين إلى خمس ثوان. لضمان نجاح الحقن المجهري القابل للتكاثر ، ركز بعناية على الغشاء الذي يفصل خلايا الجريب وخلايا الممرضة التي سيتم حقنها أثناء التركيز على طرف الإبرة مع المتلاعب الصغير.عندما تم حقن جميع منارات الجزيئية، وإزالة بلطف الإبرة والتراجع عنها إلى موقف المنزل. تغيير الهدف إلى التكبير المطلوب للحصول على صورة. ثم التركيز على غرفة البيض تحت الهدف الجديد والبدء في الحصول على صورة.للكشف عن بقعة من منارات الجزيئية، فتح الصور في J.استخدام صورة تحويل إلى ICY أداة لتحويل الصور مرة أخرى إلى ICY. سيتم تلقائياً تراكب شريط مقياس على المكدس. قم بتحرير شريط المقياس عبر نافذة المفتش حسب الضرورة.ثم قم بإلغاء تنشيط رمز العين لشريط المقياس تحت علامة تبويب الطبقة لإزالة شريط المقياس من المكدس الأصلي. حدد الكشف والتتبع والكشف عن الكشف عن الموقع، وتأكيد الكشف عن مدخلات التسلسل الحالي والقناة صفر يتم تحديد لمعلمات الإدخال والمعالجة المسبقة على التوالي. بالنسبة للكشف، حدد اكتشاف النقطة المضيئة على خلفية داكنة باستخدام استخدام القوة لأطوال موجية 2D لـ 3D فقط إذا لم يكن هناك ما يكفي من شرائح z في المداخن لإجراء التحليل.حدد المقاييس والحساسية لكل مقياس إضافة المزيد من المقاييس للبقع الأكبر والتأكد من تعيين منطقة الاهتمام من التسلسل لمنطقة ذات أهمية. للتصفية، تأكد من أنه لم يتم تعيين أي تصفية وحدد تنسيق الملف المناسب ضمن الإخراج. إذا كان من المقرر استخدام نتائج الكشف الموضعي لتحليل التتبع، حدد التصدير إلى حمام السباحة.لتحليل التكلس، كرر الكشف عن البقعة للقناة الأخرى. لتتبع بقع المنارة الجزيئية، حدد الكشف والتتبع، والتتبع، والتتبع الموضعي، وتشغيل كاشف البقعة باستخدام نفس المعلمات كما بالنسبة للكشف عن البقعة. انقر فوق معلمات تقدير وحدد الحركة المستهدفة المطلوبة في نافذة منبثقة تقدير المعلمات.ثم انقر فوق تشغيل تتبع. لتصور المسارات، حدد الكشف عن وتعقب، وتتبع، وتتبع، ومدير المسار. بالنسبة لمعالج المسارات الملونة، حدد تمكين وحدد لونًا للمسارات.من إضافة معالج المسار، حدد المسار المسار المعالج مقطع الوقت. في إطار clipper الاختيار، أدخل عدد عمليات الكشف التي سيتم إظهارها قبل وبعد نقطة الوقت الحالية. احفظ معلومات المسار كملف مسار XML واستخدم رمز الكاميرا للحصول على لقطة شاشة للنتائج.لعرض المكدس على طول الاتجاه ي، استخدم شريط البحث للعثور على البرنامج المساعد وحدد الإسقاط الأقصى من القائمة المنسدلة. في نافذة المفتش، حدد علامة تبويب التسلسل، ولوحات القماش، والتدوير لضبط الصورة حسب الاتجاه المطلوب والحصول على لقطة شاشة للصورة المتناوبة. ثم حدد منطقة الاهتمام ، منطقة 2D من الفائدة ، واختيار منطقة من الشكل الفائدة ، وحدد المنطقة ذات الاهتمام على الصورة لاقتصاص.تثبيت البرنامج المساعد تراكب الطابع الزمني وإضافة الطابع الزمني التالية الإرشادات في النافذة المنبثقة للحصول على الاتجاهات حول كيفية وضع وتنسيق الطابع الزمني. لتغيير الفاصل الزمني أو إضافته، انقر فوق تحرير في إطار خصائص التسلسل. قم بتنشيط أيقونة العين لإضافة شريط المقياس مرة أخرى أسفل علامة تبويب الطبقة في نافذة المفتش.ثم الحصول على لقطة من النتائج المُستَدَنّة من وقت، واحفظ الصورة في كل من تنسيقات TIFF و AVI. وباستخدام هذه الطريقة كما هو موضح، يمكن تصور أنماط النقل والتوطين في الـ MRNAs الذاتية عن طريق المنارات الجزيئية في مراحل مختلفة من تكوين الخلايا التناسلية، ولا سيما عند منتصف تولد الخلايا العصبية وبعده. عندما حقن بشكل فردي في غرف البيض المرحلة نفسها، ومختلف منارات جزيئية محددة oskar تقديم نفس النمط من التعريب.المنارات الجزيئية حقن في سيتوبلاسم من خلية ممرضة سوف تنتشر بحرية في خلايا ممرضة المجاورة وكذلك في البويض. وهكذا، فإن المنارات قادرة على التهجين مع أهدافها وتوليد إشارات الفلورنس في مواقع أخرى غير موقع الحقن المجهري. في غرف البيض المعدلة وراثياً في منتصف تكوين الخلايا التناسلية، يظهر تحليل بيانات الاستحواذ تحللًا واسع النطاق لإشارة الفلوريسنس لـ GFP الموسومة وراثياً بعلامة أوسكار ميرنا مع إشارة الفلورسي التي تم اكتشافها باستخدام منارات جزيئية.وعلاوة على ذلك، يمكن تحليل مداخن 5D لتحديد مسارات ناسكا MRNA للنقل لمسافات طويلة في كل من خلية ممرضة وبويضة السيتوبلاسم. بعد تطورها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال بيولوجيا الحمض النووي الريبي لاستكشاف نقل الأمهات والأمهات والأمهات المحلية في غرفة البيض Drosophila.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Cell Biology

Biology

Unit 1

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Control of Gene Expression

SCIENTISTS IN ACTION

Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

تشريح الجهاز العصبي المركزي اليرقات في Melanogaster ذبابة الفاكهة

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

عالية الدقة تعقب الفيديو للتنقل في الكبار ذبابة الفاكهة السوداء البطن

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes

Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes

تصور لايف ذبابة الفاكهة الدبقية العصبية والعضلية ، تقاطع مع الأصباغ نيون

Our project identified GFP labeled glial structures at the developing larval fly neuromuscular synapse. To look at development of live glial-nerve-muscle ...

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

تصور القلب النابض في ذبابة الفاكهة</em

The Drosophila heart has recently emerged as a good model system for examining the genetic, cellular, and molecular mechanisms underlying function in ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

يعيش تصوير ذبابة الفاكهة السوداء البطن هجرات كرية دموية الجنينية

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

عزلة ذبابة الفاكهة السوداء البطن الخصيات

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

إعداد فردية ذبابة الفاكهة البيض غرف للتصوير لايف

Live cell imaging is an important technique applied to a number of Drosophila tissues used as models to investigate topics such as axis specification, ...

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

قياس عمر في<em&gt; ذبابة الفاكهة الدروسوفيلا</em

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

يعيش التصوير من تخليص الخلية أفكارك أثناء<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; مرحلة التطور الجنيني

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

صيانة<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; عدد السكان قفص

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life ...