Name: visualizing and tracking endogenous mrnas in live drosophila melanogaster egg chambers
Uploaded: 2019-06-04T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers at JoVE.com

Vi takker Salvatore A.E. Marras (Public Health Research Institute Center, Rutgers University) for syntese, mærkning og rensning af molekylære beacons, og Daniel St Johnston (Gurdon Institute, University of Cambridge) for Oskar-MS2/ MCP-GFP transgene flyve bestand. Dette arbejde blev støttet af en National Science Foundation CAREER Award 1149738 og en professionel personale kongres-CUNY Award til DPB.

1. design af MBs til live Cell Imaging
<ol><li>
Fold MÅLRNA-sekvensen for at forudsige mRNA-målets sekundære struktur ved hjælp af "RNA-formen" fra mfold -serveren (http://unafold.RNA.Albany.edu/?q=mfold/RNA-Folding-form).
	<ol>
<li>Indsæt/upload målsekvensen i fasta format, Vælg 5 eller 10% sub-Optimality (strukturer med en fri energi til at folde inden for 5 eller 10% af MFE værdi, henholdsvis), og justere det maksimale antal af beregnede foldninger i overensstemmelse hermed (f. eks ...

<ol>
	<li>Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+RNA+distribution+and+dynamics+in+living+cells.">Imaging intracellular RNA distribution and dynamics in living cells.</a> Nature Methods. 6 (5), 331-338 (2009).</li><li>Bao, G., Rhee, W. J., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+probes+for+live-cell+RNA+detection.">Fluorescent probes for live-cell RNA detection.</a> Annual Reviews of Biomedical Engineering. 11, 25-47 (2009).</li><li>Mannack, L. V., Eising, S., Rentmeister, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+techniques+for+visualizing+RNA+in+cells.">Current techniques for visualizing RNA in cells.</a> F1000Research. 5, (2016).</li><li>Larson, D. R., Zenklusen, D., Wu, B., Chao, J. A., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+observation+of+transcription+initiation+and+elongation+on+an+endogenous+yeast+gene.">Real-time observation of transcription initiation and elongation on an endogenous yeast gene.</a> Science. 332 (6028), 475-478 (2011).</li><li>Bertrand, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+ASH1+mRNA+particles+in+living+yeast.">Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast.</a> Molecular Cell. 2 (4), 437-445 (1998).</li><li>Garcia, J. F., Parker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MS2+coat+proteins+bound+to+yeast+mRNAs+block+5'+to+3'+degradation+and+trap+mRNA+decay+products:+implications+for+the+localization+of+mRNAs+by+MS2-MCP+system.">MS2 coat proteins bound to yeast mRNAs block 5' to 3' degradation and trap mRNA decay products: implications for the localization of mRNAs by MS2-MCP system.</a> RNA. 21 (8), 1393-1395 (2015).</li><li>Bratu, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+beacons:+Fluorescent+probes+for+detection+of+endogenous+mRNAs+in+living+cells.">Molecular beacons: Fluorescent probes for detection of endogenous mRNAs in living cells.</a> Methods in Molecular Biology. 319, 1-14 (2006).</li><li>Bratu, D. P., Cha, B. J., Mhlanga, M. M., Kramer, F. R., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+the+distribution+and+transport+of+mRNAs+in+living+cells.">Visualizing the distribution and transport of mRNAs in living cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 100 (23), 13308-13313 (2003).</li><li>Tyagi, S., Kramer, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+beacons:+probes+that+fluoresce+upon+hybridization.">Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization.</a> Nature Biotechnology. 14 (3), 303-308 (1996).</li><li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+beacon-based+approach+for+live-cell+imaging+of+RNA+transcripts+with+minimal+target+engineering+at+the+single-molecule+level.">A molecular beacon-based approach for live-cell imaging of RNA transcripts with minimal target engineering at the single-molecule level.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1550 (2017).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+detection+of+microRNAs+by+combining+molecular+beacon+probes+with+T7+exonuclease-assisted+cyclic+amplification+reaction.">Multiplex detection of microRNAs by combining molecular beacon probes with T7 exonuclease-assisted cyclic amplification reaction.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (1), 107-114 (2017).</li><li>Baker, M. B., Bao, G., Searles, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+quantification+of+specific+microRNA+using+molecular+beacons.">In vitro quantification of specific microRNA using molecular beacons.</a> Nucleic Acids Research. 40 (2), e13 (2012).</li><li>Ko, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+color-tunable+molecular+beacon+to+sense+miRNA-9+expression+during+neurogenesis.">A color-tunable molecular beacon to sense miRNA-9 expression during neurogenesis.</a> Scientific Reports. 4, 4626 (2014).</li><li>Vet, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+detection+of+four+pathogenic+retroviruses+using+molecular+beacons.">Multiplex detection of four pathogenic retroviruses using molecular beacons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 96 (11), 6394-6399 (1999).</li><li>Li, J., Cao, Z. C., Tang, Z., Wang, K., Tan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+beacons+for+protein-DNA+interaction+studies.">Molecular beacons for protein-DNA interaction studies.</a> Methods in Molecular Biology. 429, 209-224 (2008).</li><li>Li, W. M., Chan, C. M., Miller, A. L., Lee, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+Functional+Roles+of+Molecular+Beacon+as+a+MicroRNA+Detector+and+Inhibitor.">Dual Functional Roles of Molecular Beacon as a MicroRNA Detector and Inhibitor.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (9), 3568-3580 (2017).</li><li>Kuang, T., Chang, L., Peng, X., Hu, X., Gallego-Perez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Beacon+Nano-Sensors+for+Probing+Living+Cancer+Cells.">Molecular Beacon Nano-Sensors for Probing Living Cancer Cells.</a> Trends in Biotechnology. 35 (4), 347-359 (2017).</li><li>Ban, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-genetic+Purification+of+Ventricular+Cardiomyocytes+from+Differentiating+Embryonic+Stem+Cells+through+Molecular+Beacons+Targeting+IRX-4.">Non-genetic Purification of Ventricular Cardiomyocytes from Differentiating Embryonic Stem Cells through Molecular Beacons Targeting IRX-4.</a> Stem Cell Reports. 5 (6), 1239-1249 (2015).</li><li>Hadjinicolaou, A. V., Demetriou, V. L., Emmanuel, M. A., Kakoyiannis, C. K., Kostrikis, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+beacon-based+real-time+PCR+detection+of+primary+isolates+of+Salmonella+Typhimurium+and+Salmonella+Enteritidis+in+environmental+and+clinical+samples.">Molecular beacon-based real-time PCR detection of primary isolates of Salmonella Typhimurium and Salmonella Enteritidis in environmental and clinical samples.</a> BMC Microbiology. 9, 97 (2009).</li><li>McLaughlin, J. M., Bratu, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+melanogaster+Oogenesis:+An+Overview.">Drosophila melanogaster Oogenesis: An Overview.</a> Methods in Molecular Biology. 1328, 1-20 (2015).</li><li>Bastock, R., St Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+oogenesis.">Drosophila oogenesis.</a> Current Biology. 18 (23), R1082-R1087 (2008).</li><li>Rongo, C., Gavis, E. R., Lehmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+oskar+RNA+regulates+oskar+translation+and+requires+Oskar+protein.">Localization of oskar RNA regulates oskar translation and requires Oskar protein.</a> Development. 121 (9), 2737-2746 (1995).</li><li>Mhlanga, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+colocalisation+of+oskar+mRNA+and+trans-acting+proteins+revealed+by+quantitative+imaging+of+the+Drosophila+oocyte.">In vivo colocalisation of oskar mRNA and trans-acting proteins revealed by quantitative imaging of the Drosophila oocyte.</a> PLoS One. 4 (7), e6241 (2009).</li><li>Bayer, L. V., Omar, O. S., Bratu, D. P., Catrina, I. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PinMol:+Python+application+for+designing+molecular+beacons+for+live+cell+imaging+of+endogenous+mRNAs.">PinMol: Python application for designing molecular beacons for live cell imaging of endogenous mRNAs.</a> bioRxiv. , (2018).</li><li>Marras, S. A., Kramer, F. R., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiencies+of+fluorescence+resonance+energy+transfer+and+contact-mediated+quenching+in+oligonucleotide+probes.">Efficiencies of fluorescence resonance energy transfer and contact-mediated quenching in oligonucleotide probes.</a> Nucleic Acids Research. 30 (21), e122 (2002).</li><li>Bratu, D. P., Catrina, I. E., Marras, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tiny+molecular+beacons+for+in+vivo+mRNA+detection.">Tiny molecular beacons for in vivo mRNA detection.</a> Methods in Molecular Biology. 714, 141-157 (2011).</li><li>Dean, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+(pulling)+of+needles+for+gene+delivery+by+microinjection.">Preparation (pulling) of needles for gene delivery by microinjection.</a> Cold Spring Harbor. 2006 (7), (2006).</li><li>Alami, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+transport+of+TDP-43+mRNA+granules+is+impaired+by+ALS-causing+mutations.">Axonal transport of TDP-43 mRNA granules is impaired by ALS-causing mutations.</a> Neuron. 81 (3), 536-543 (2014).</li><li>Jackson, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+Hairpin+DNA-Functionalized+Gold+Nanoparticles+for+Imaging+mRNA+in+Living+Cells.">Applications of Hairpin DNA-Functionalized Gold Nanoparticles for Imaging mRNA in Living Cells.</a> Methods in Enzymology. 572, 87-103 (2016).</li><li>Zimyanin, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+oskar+mRNA+transport+reveals+the+mechanism+of+posterior+localization.">In vivo imaging of oskar mRNA transport reveals the mechanism of posterior localization.</a> Cell. 134 (5), 843-853 (2008).</li><li>Catrina, I. E., Marras, S. A., Bratu, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tiny+molecular+beacons:+LNA/2'-O-methyl+RNA+chimeric+probes+for+imaging+dynamic+mRNA+processes+in+living+cells.">Tiny molecular beacons: LNA/2'-O-methyl RNA chimeric probes for imaging dynamic mRNA processes in living cells.</a> ACS Chemical Biology. 7 (9), 1586-1595 (2012).</li><li>Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+cytosolic+delivery+of+molecular+beacon+conjugates+and+flow+cytometric+analysis+of+target+RNA.">Efficient cytosolic delivery of molecular beacon conjugates and flow cytometric analysis of target RNA.</a> Nucleic Acids Research. 36 (12), e69 (2008).</li><li>Nitin, N., Santangelo, P. J., Kim, G., Nie, S., Bao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide-linked+molecular+beacons+for+efficient+delivery+and+rapid+mRNA+detection+in+living+cells.">Peptide-linked molecular beacons for efficient delivery and rapid mRNA detection in living cells.</a> Nucleic Acids Research. 32 (6), e58 (2004).</li><li>Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avoiding+false-positive+signals+with+nuclease-vulnerable+molecular+beacons+in+single+living+cells.">Avoiding false-positive signals with nuclease-vulnerable molecular beacons in single living cells.</a> Nucleic Acids Research. 35 (16), e105 (2007).</li><li>Bevilacqua, P. C., Ritchey, L. E., Su, Z., Assmann, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+Analysis+of+RNA+Secondary+Structure.">Genome-Wide Analysis of RNA Secondary Structure.</a> Annual Review of Genetics. 50, 235-266 (2016).</li><li>Mhlanga, M. M., Vargas, D. Y., Fung, C. W., Kramer, F. R., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=tRNA-linked+molecular+beacons+for+imaging+mRNAs+in+the+cytoplasm+of+living+cells.">tRNA-linked molecular beacons for imaging mRNAs in the cytoplasm of living cells.</a> Nucleic Acids Research. 33 (6), 1902-1912 (2005).</li><li>Eliceiri, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+imaging+software+tools.">Biological imaging software tools.</a> Nature Methods. 9 (7), 697-710 (2012).</li><li>Bolte, S., Cordelieres, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guided+tour+into+subcellular+colocalization+analysis+in+light+microscopy.">A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy.</a> Journal of Microscopy. 224 (Pt 3), 213-232 (2006).</li><li>Trcek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+germ+granules+are+structured+and+contain+homotypic+mRNA+clusters.">Drosophila germ granules are structured and contain homotypic mRNA clusters.</a> Nature Commununications. 6, 7962 (2015).</li></ol>

Live visualisering af endogene mRNA-handel i Drosophila Egg Chambers er afhængig af brugen af specifikke, effektive og nukleaseresistente MBS, som nu let kan designes med pinmol -software. MBs er specifikke sonder designet til at detektere unikke sekvenser inden for et mål mRNA (fortrinsvis regioner fri for sekundær struktur), hvilket gør det muligt meget løst påvisning af en udskrift. Den eneste begrænsning, når der vedtages denne teknik/protokol for andre væv/celletyper er effektiviteten af M...

Cellebiologi undersøgelser, der visualiserer dynamiske hændelser med rumlig og tidsmæssig opløsning, er blevet muliggjort af udviklingen af fluorescens baserede Live Cell Imaging teknikker. I øjeblikket, in vivo mRNA visualisering opnås via teknologier, der er baseret på RNA aptamer-protein interaktioner, RNA aptamer-induceret fluorescens af organiske farvestoffer og nukleinsyre sonde udglødning1,2, 3. de alle tilbyder høj specificitet, følsomhed og signal-til-baggrund ratio. Men RNA aptamer-centrerede tilgange kræver omfattende genetisk manipulation, hvor en transgene er konstrueret til at udtrykke et RNA med kunstige strukturelle motiver, der er nødvendige for protein eller organisk farvestof binding. For eksempel kræver MS2/MCP-systemet Co-ekspression af et transgen, der udtrykker en RNA-konstruktion, som indeholder flere tandem gentagelser af bindings sekvensen for bakteriophage MS2 coat-proteinet (MCP), og et andet transgen, som indkoder et fluorescerende protein smeltet til MCP4,5. Tilføjelsen af sådanne sekundære strukturelle motiver til RNA, sammen med en voluminøse fluorescently Tagged protein, har rejst bekymring for, at indfødte RNA processer kan blive påvirket6. En teknologi, der behandler denne bekymring og tilbyder yderligere unikke fordele er den nukleinsyre-baserede tilgang, molekyle beacons (MBs). MBS giver mulighed for multiplex påvisning af endogene mRNAs, diskrimination af enkelt nukleotid variationer, og hurtig kinetik af hybridisering med mål mRNA7,8. MBs er oligonukleotidprober, der forbliver i en slukket hårnål fold, før de gennemgår en fluorogen konformationel ændring, når de hybridiserer til deres mål (figur 1c)9. Flere grupper har haft succes med at bruge MBS til at detektere både ikke-kodning RNAs (micrornas og lncrnas)10,11,12,13, RNA retrovira14 og dynamisk DNA-protein interaktioner15. De er blevet anvendt med succes til billeddannelse i forskellige organismer og væv, såsom Zebra embryoner16, neuroner13, tumor væv17, differentiere kardiomyocytter18, og salmonella 19.
Her beskriver vi design, levering og detektion tilgang til endogene mRNAs i Living D. melanogaster ægge kamre kombineret med en mikroskopi set-up, der er hurtig nok til at fange den dynamiske række af aktive molekyle transport. D. melanogaster Egg Chamber har fungeret som et ideelt flercellet model system til en bred vifte af udviklingsmæssige undersøgelser, fra tidlig kimcelle stamcelle division og maternel genekspression til generationen af segmental Body plan20, 21. Ægge kamre er let isolerede, store og gennemsigtige, og i stand til at modstå timer af ex vivo analyse, hvilket gør dem meget modtagelig for billeddannelse eksperimenter. Meget arbejde har fokuseret på den asymmetriske lokalisering af mødres udskrifter til diskrete subcellulære regioner forud for at blive aktivt oversat. Især skal Oskar mRNA lokalisering og den efterfølgende oversættelse til oocyte posterior pole ske på en stramt reguleret måde for at undgå et dødbringende, bicaudal embryo fænotype22. Oskar mRNA er transkriberet i de 15 kimcelle celler, kaldet sygeplejerske celler, og aktivt transporteres gennem cytoplasmiske broer, kaldet ring kanaler, i oocyte, den kimcelle celle, der bliver den modne æg og er i sidste ende befrugtet (figur 1a ). Den betydelige mængde oplysninger, der allerede er til rådighed om den dynamiske rekruttering og udveksling af protein faktorer til og fra Oskar mRNP, samt dens langtrækkende intracellulære rejse, gør Oskar til en foretrukken kandidat til at studere de mange processer i mRNA livscyklus. MBs har været medvirkende til at afsløre detaljer om processen med mRNA lokalisering og dechifrere regulering og funktion af protein faktorer, der styrer mRNA transport under Drosophila oogenesis. Især ved mikroindsprøjtning af MBS i sygeplejerske celler og udfører levende celle billeddannelse eksperimenter, sporing af endogene mRNAs er muligt8,23.
Den køreplan, der præsenteres her, indeholder trinnene i en komplet proces, fra udførelse af et live Cell Imaging-eksperiment ved hjælp af MBs, erhvervelse af billeddata, til at udføre dataanalyse for at spore endogene mRNA i dets oprindelige cellulære miljø. Trinene kan ændres og yderligere optimeret til at opfylde behovene hos forskere, der arbejder med andre væv/celletyper inden for deres egen Lab indstilling.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Spectrofluorometer</td>
			<td>Fluoromax-4 Horiba-Jobin Yvon</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Photon counting spectrofluorometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz cuvette</td>
			<td>Fireflysci (former Precision Cells Inc.)</td>
			<td>701MFL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 tweezer</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501985</td>
			<td>Thin tweezers are very important to separate out the individual egg chambers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 700</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slip No.1 22 x 40mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Leica MZ6 Leica Microsystems Inc.</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 fruit fly anesthesia pad</td>
			<td>Genesee Scienific</td>
			<td>59-114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCL pH7.5</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1185-53-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning disc confocal microscope</td>
			<td>Leica DMI-4000B inverted microscope equipped with Yokogawa CSU 10 spinning disc Leica Microsystems Inc.</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamamatsu C9100-13 ImagEM EMCCD camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PatchMan NP 2 Micromanipulator</td>
			<td>Eppendorf Inc.</td>
			<td>920000037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FemtoJet Microinjector</td>
			<td>Eppendorf Inc.</td>
			<td>920010504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection needle: Femtotips II</td>
			<td>Eppendorf Inc.</td>
			<td>930000043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading tip: 20ul Microloader</td>
			<td>Eppendorf Inc.</td>
			<td>930001007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Cover glasses no. 1 or 1.5, 22x40mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-026; 48393-172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry yeast</td>
			<td>Any grocery store</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer, &#62; 20 GB RAM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Although processing can be carried out on most computers, higher capabilities will increase the speed of the processing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing and tracking endogenous mrnas in live drosophila melanogaster egg chambers

Fluorescens baserede billedbehandlings teknikker har i kombination med udviklingen i let mikroskopi revolutioneret, hvordan celle biologer gennemfører levende celle billedbehandlings undersøgelser. Metoder til påvisning af RNAs er vokset betydeligt, siden skelsættende studier har kædet den stedspecifikke mRNA-lokalisering sammen med forordningen om genekspression. Dynamiske mRNA-processer kan nu visualiseres via tilgange, der registrerer mRNAs, kombineret med mikroskopi-opsætninger, der er hurtige nok til at fange det dynamiske område af Molekylær opførsel. Molekylær Beacon-teknologien er en hybridiserings baseret tilgang, der er i stand til direkte at påvise endogene udskrifter i levende celler. Molekylære beacons er hårnål-formet, internt quenched, enkelt-nukleotid diskriminerende nukleinsyre sonder, som fluorescerer kun ved hybridisering til en unik Target sekvens. Når det kombineres med avanceret Fluorescens mikroskopi og høj opløsning billeddannelse, de gør det muligt for en til at udføre rumlig og tidsmæssig sporing af intracellulære bevægelse af mRNAs. Selv om denne teknologi er den eneste metode, der er i stand til at afsløre endogene udskrifter, har celle biologer endnu ikke fuldt ud omfavnet denne teknologi på grund af vanskeligheder med at designe sådanne sonder til live Cell Imaging. En ny software applikation, pinmol, giver mulighed for forbedret og hurtig design af sonder bedst egnet til effektivt hybridisere til mRNA mål regioner i en levende celle. Hertil kommer, at høj opløsning, real-time image erhvervelse og nuværende, open source billedanalyse software giver mulighed for en raffineret data output, hvilket fører til en finere vurdering af kompleksiteten underliggende de dynamiske processer, der er involveret i Mrna's livscyklus.
Her præsenterer vi en omfattende protokol til design og levering af molekylære beacons til Drosophila melanogaster ægge kamre. Direkte og meget specifik detektion og visualisering af endogene maternel mRNAs udføres via spinning Disc confokal mikroskopi. Billeddata behandles og analyseres ved hjælp af objekt detektering og sporing i isnende software for at indhente oplysninger om den dynamiske bevægelse af mRNAs, som transporteres og lokaliserede til specialiserede områder inden for oocyte.

Ved hjælp af Pinmolkan flere mb'er designes til ét mRNA-mål (figur 1b-C). Efter syntese og rensning er de valgte MBs karakteriseret og sammenlignet ved hjælp af in vitro-analyse.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58545/58545fig1.jpg"> Figur 1: Beskrivelse af teknik og væv til levende celle billeder af endogene Mrna'er. (<str...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers at JoVE.com

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Her præsenterer vi en protokol for visualisering, afsløring, analyse og sporing af endogene mRNA handel i levende Drosophila melanogaster æg kammer ved hjælp af molekylære beacons, spinning Disc confokal mikroskopi, og open source-analyse Software.

Visualisering og sporing endogene mRNAs i levende Drosophila melanogaster ægge kamre

Fluorescence-based imaging techniques, in combination with developments in light microscopy, have revolutionized how cell biologists conduct live cell ...

Denne metode kan hjælpe med at besvare centrale spørgsmål i RNA biologi området om mekanismen og funktionen af polariseret RNA lokalisering. Den største fordel ved denne teknik er, at det giver mulighed for realtid visualisering af endogene RNA handel med levende væv. Konsekvenserne af denne teknik strækker sig mod behandling af RNA-relaterede sygdomme, fordi det har potentiale til at afdække nye terapeutiske mål.Selvom denne metode kan give indsigt i RNA-processer i frugtflueægkammeret, kan den også anvendes på andre systemer som i zebrafisk eller kulturceller. Generelt vil personer nye til denne metode kæmpe på grund af de udfordringer, der er forbundet med design og levering af de molekylære beacon rekvisitter. For molekylær beacon mikroinjektion, skal du vælge 40X olie mål og montere en coverslip med de dissekerede æg kammer på mikroskopet fase.Find et æg kammer i midten til slutningen af udviklingsmæssige fase, der er korrekt orienteret for mikroinjektion. Derefter oprettes en mikroinjektor med det relevante injektions- og kompensationstryk. Brug mikromanipulatorens joystick, sænk forsigtigt en nål fyldt med en mikroliter molekylær beacon-opløsning i oliedråben.Bring spidsen i fokus mod periferien af synsfeltet. Udfør en ren funktion for at fjerne luften fra nålespidsen og for at sikre, at der er flow fra nålen, og før nålen til hjemmet. Fokus på æggekammeret, der skal mikroindsprøjtes og bringe nålen tilbage i fokus nær kanten af æggekammeret.Udfør en fin justering af z-positionen af målet, således at membranen adskiller follikelcellerne fra sygeplejerskecellerne er i fokus. Sæt nålen i en sygeplejerskecelle til injektion af de molekylære beacons over en periode på to til fem sekunder. For at sikre reproducerbar mikroinfektion succes, fokusere omhyggeligt på membranen adskiller follikelceller og sygeplejerske celler, der vil blive injiceret, samtidig med at spidsen af nålen i fokus med mikro manipulator.Når alle de molekylære beacons er blevet injiceret, forsigtigt fjerne nålen og trække den tilbage til hjemmet position. Skift målsætningen til den ønskede forstørrelse for billederhvervelse. Derefter fokusere på æggekammeret under det nye mål og begynde billedet erhvervelse.For spot detektion af de molekylære beacons, åbne billederne i Billede J.Brug konvertere til ICY værktøj til at konvertere billederne tilbage til IV. En skala bar vil automatisk blive overlejret på stakken. Rediger skalalinjen via kontrollørens vindue efter behov.Aktivér derefter øjeikonet for skalalinjen under lagfanen for at fjerne skalalinjen fra den oprindelige stak. Vælg registrering og sporing, registrering og staffagedetektor, og bekræft, at den aktuelle sekvensinputdetektering og kanalnul vælges for henholdsvis input- og forbehandlingsparametrene. For detektor, skal du vælge opdage lyspunkt over mørk baggrund ved hjælp af magt brug af 2D bølgelængder til 3D, hvis der ikke er nok z-skiver i stakkene til at udføre analysen.Vælg skaler og følsomhed for hver skala, der tilføjer flere skalaer for større pletter, og bekræft, at området af interesse fra sekvens er indstillet til interesseområder. I tilfælde af filtrering skal du bekræfte, at der ikke er angivet nogen filtrering, og vælge det relevante filformat under output. Hvis spotdetektorresultaterne skal bruges til sporingsanalyse, skal du vælge eksport til svømmehal.Gentag spotregistreringen for den anden kanal for at analysere farvekalkningsanalyse. For at spore de molekylære beacon pletter, skal du vælge detektion og sporing, sporing, spot tracking, og køre spotdetektoren ved hjælp af de samme parametre som for stedet afsløring. Klik på estimatparametre, og vælg den ønskede målbevægelse i pop op-vinduet til estimering af parametre.Klik derefter på kør sporing. Hvis du vil visualisere sporene, skal du vælge registrering og sporing, sporing og sporstyring. I tilfælde af farvesporsprocessor skal du vælge aktivér og vælge en farve til sporene.Vælg sporprocessortidsklip fra tilføj sporprocessor. I vinduet checkklipper skal du angive det antal registreringer, der skal vises før og efter det aktuelle tidspunkt. Gem sporoplysningerne som en XML-sporfil, og brug kameraikonet til at få et skærmbillede af resultaterne.Hvis du vil projicere stakken langs z-retningen, skal du bruge søgelinjen til at finde plug-in'et og vælge maksimal projektion i rullemenuen. Vælg sekvensfane, lærred og rotation i inspektørvinduet for at justere billedet til den ønskede retning og få et skærmbillede af det roterede billede. Vælg derefter interesseområde, 2D-område af interesse, vælg område af interesseform, og vælg det område, der er af interesse på billedet til beskæring.Installer tidsstempel overlay plugin og tilføje et tidsstempel følge instruktionerne i popup-vinduet for retninger om, hvordan du placerer og formatere tidsstemplet. Hvis du vil ændre eller tilføje tidsintervallet, skal du klikke på Rediger i vinduet med sekvensegenskaber. Aktivér øjeikonet for at tilføje skaleret tilbage under lagfanen i inspektørvinduet.Derefter få et skærmbillede af de tidsstemplede resultater og gemme billedet i både TIFF og AVI formater. Ved hjælp af denne metode som påvist er det muligt at visualisere transport- og lokaliseringsmønstrene for endogene mRNA'er via molekylære beacons på forskellige stadier af oogenese og især ved og efter midten af oogenese. Når individuelt injiceres i samme fase æg kamre, forskellige oskar specifikke molekylære beacons præsentere det samme mønster af lokalisering.Molekylære beacons sprøjtes ind i cytoplasmaet af en sygeplejerske celle vil frit diffuse i tilstødende sygeplejerske celler samt i oocyt. Således beacons er i stand til at hybridisere med deres mål og generere fluorescens signaler på andre steder end microinjection site. I oskar GFP transgene æg kamre i midten af oogenese, analyse af erhvervelse data viser omfattende colocalization for fluorescens signal af genetisk manipuleret GFP mærkede oskar mRNA med fluorescens signal opdaget ved hjælp af molekylære beacons.Desuden kan 5D stakke analyseres yderligere for at bestemme oskar mRNA baner til langdistancetransport i både sygeplejerske celle og oocyt cytoplasma. Efter sin udvikling banede denne teknik vejen for forskere inden for RNA-biologi til at udforske endogene mødre mRNA transport og lokalisering i Drosophila ægkammer.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Cell Biology

Biology

Unit 1

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Control of Gene Expression

SCIENTISTS IN ACTION

Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes

Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes

Our project identified GFP labeled glial structures at the developing larval fly neuromuscular synapse. To look at development of live glial-nerve-muscle ...

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

The Drosophila heart has recently emerged as a good model system for examining the genetic, cellular, and molecular mechanisms underlying function in ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

Forberedelse Individual Drosophila Egg Chambers til Live Imaging

Live cell imaging is an important technique applied to a number of Drosophila tissues used as models to investigate topics such as axis specification, ...

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Måling af Levetid i<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Levende Imaging af Apoptotisk Cell Clearance under<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenese

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

Vedligeholdelse af en<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Befolkning Cage

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life ...