Name: visualizing and tracking endogenous mrnas in live drosophila melanogaster egg chambers
Uploaded: 2019-06-04T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers at JoVE.com

Nous remercions Salvatore A.E. Marras (Public Health Research Institute Center, Rutgers University) pour la synthèse, l'étiquetage et la purification des balises moléculaires, et Daniel St Johnston (The Gurdon Institute, Université de Cambridge) pour l'oskar -MS2/ Stock de mouches transgéniques MCP-GFP. Ce travail a été soutenu par un prix CARRIÈRE de la National Science Foundation 1149738 et un Prix du Congrès du personnel professionnel-CUNY à DPB.

1. Conception de MBs pour l'imagerie cellulaire en direct
<ol><li>
Pliez la séquence d'ARN cible pour prédire la structure secondaire de la cible de l'ARNm à l'aide de la « forme d'ARN » du serveur mfold (http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/RNA-Folding-Form).
	<ol>
<li>Coller/télécharger la séquence cible en format FASTA, sélectionner 5 ou 10% de sous-optimalité (structures avec une énergie libre de pliage dans 5 ou 10% de la valeur MFE, respectivement), et ajuster le nombre maxi...

<ol>
	<li>Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+RNA+distribution+and+dynamics+in+living+cells.">Imaging intracellular RNA distribution and dynamics in living cells.</a> Nature Methods. 6 (5), 331-338 (2009).</li><li>Bao, G., Rhee, W. J., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+probes+for+live-cell+RNA+detection.">Fluorescent probes for live-cell RNA detection.</a> Annual Reviews of Biomedical Engineering. 11, 25-47 (2009).</li><li>Mannack, L. V., Eising, S., Rentmeister, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+techniques+for+visualizing+RNA+in+cells.">Current techniques for visualizing RNA in cells.</a> F1000Research. 5, (2016).</li><li>Larson, D. R., Zenklusen, D., Wu, B., Chao, J. A., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+observation+of+transcription+initiation+and+elongation+on+an+endogenous+yeast+gene.">Real-time observation of transcription initiation and elongation on an endogenous yeast gene.</a> Science. 332 (6028), 475-478 (2011).</li><li>Bertrand, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+ASH1+mRNA+particles+in+living+yeast.">Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast.</a> Molecular Cell. 2 (4), 437-445 (1998).</li><li>Garcia, J. F., Parker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MS2+coat+proteins+bound+to+yeast+mRNAs+block+5'+to+3'+degradation+and+trap+mRNA+decay+products:+implications+for+the+localization+of+mRNAs+by+MS2-MCP+system.">MS2 coat proteins bound to yeast mRNAs block 5' to 3' degradation and trap mRNA decay products: implications for the localization of mRNAs by MS2-MCP system.</a> RNA. 21 (8), 1393-1395 (2015).</li><li>Bratu, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+beacons:+Fluorescent+probes+for+detection+of+endogenous+mRNAs+in+living+cells.">Molecular beacons: Fluorescent probes for detection of endogenous mRNAs in living cells.</a> Methods in Molecular Biology. 319, 1-14 (2006).</li><li>Bratu, D. P., Cha, B. J., Mhlanga, M. M., Kramer, F. R., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+the+distribution+and+transport+of+mRNAs+in+living+cells.">Visualizing the distribution and transport of mRNAs in living cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 100 (23), 13308-13313 (2003).</li><li>Tyagi, S., Kramer, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+beacons:+probes+that+fluoresce+upon+hybridization.">Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization.</a> Nature Biotechnology. 14 (3), 303-308 (1996).</li><li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+beacon-based+approach+for+live-cell+imaging+of+RNA+transcripts+with+minimal+target+engineering+at+the+single-molecule+level.">A molecular beacon-based approach for live-cell imaging of RNA transcripts with minimal target engineering at the single-molecule level.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1550 (2017).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+detection+of+microRNAs+by+combining+molecular+beacon+probes+with+T7+exonuclease-assisted+cyclic+amplification+reaction.">Multiplex detection of microRNAs by combining molecular beacon probes with T7 exonuclease-assisted cyclic amplification reaction.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (1), 107-114 (2017).</li><li>Baker, M. B., Bao, G., Searles, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+quantification+of+specific+microRNA+using+molecular+beacons.">In vitro quantification of specific microRNA using molecular beacons.</a> Nucleic Acids Research. 40 (2), e13 (2012).</li><li>Ko, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+color-tunable+molecular+beacon+to+sense+miRNA-9+expression+during+neurogenesis.">A color-tunable molecular beacon to sense miRNA-9 expression during neurogenesis.</a> Scientific Reports. 4, 4626 (2014).</li><li>Vet, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+detection+of+four+pathogenic+retroviruses+using+molecular+beacons.">Multiplex detection of four pathogenic retroviruses using molecular beacons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 96 (11), 6394-6399 (1999).</li><li>Li, J., Cao, Z. C., Tang, Z., Wang, K., Tan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+beacons+for+protein-DNA+interaction+studies.">Molecular beacons for protein-DNA interaction studies.</a> Methods in Molecular Biology. 429, 209-224 (2008).</li><li>Li, W. M., Chan, C. M., Miller, A. L., Lee, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+Functional+Roles+of+Molecular+Beacon+as+a+MicroRNA+Detector+and+Inhibitor.">Dual Functional Roles of Molecular Beacon as a MicroRNA Detector and Inhibitor.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (9), 3568-3580 (2017).</li><li>Kuang, T., Chang, L., Peng, X., Hu, X., Gallego-Perez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Beacon+Nano-Sensors+for+Probing+Living+Cancer+Cells.">Molecular Beacon Nano-Sensors for Probing Living Cancer Cells.</a> Trends in Biotechnology. 35 (4), 347-359 (2017).</li><li>Ban, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-genetic+Purification+of+Ventricular+Cardiomyocytes+from+Differentiating+Embryonic+Stem+Cells+through+Molecular+Beacons+Targeting+IRX-4.">Non-genetic Purification of Ventricular Cardiomyocytes from Differentiating Embryonic Stem Cells through Molecular Beacons Targeting IRX-4.</a> Stem Cell Reports. 5 (6), 1239-1249 (2015).</li><li>Hadjinicolaou, A. V., Demetriou, V. L., Emmanuel, M. A., Kakoyiannis, C. K., Kostrikis, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+beacon-based+real-time+PCR+detection+of+primary+isolates+of+Salmonella+Typhimurium+and+Salmonella+Enteritidis+in+environmental+and+clinical+samples.">Molecular beacon-based real-time PCR detection of primary isolates of Salmonella Typhimurium and Salmonella Enteritidis in environmental and clinical samples.</a> BMC Microbiology. 9, 97 (2009).</li><li>McLaughlin, J. M., Bratu, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+melanogaster+Oogenesis:+An+Overview.">Drosophila melanogaster Oogenesis: An Overview.</a> Methods in Molecular Biology. 1328, 1-20 (2015).</li><li>Bastock, R., St Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+oogenesis.">Drosophila oogenesis.</a> Current Biology. 18 (23), R1082-R1087 (2008).</li><li>Rongo, C., Gavis, E. R., Lehmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+oskar+RNA+regulates+oskar+translation+and+requires+Oskar+protein.">Localization of oskar RNA regulates oskar translation and requires Oskar protein.</a> Development. 121 (9), 2737-2746 (1995).</li><li>Mhlanga, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+colocalisation+of+oskar+mRNA+and+trans-acting+proteins+revealed+by+quantitative+imaging+of+the+Drosophila+oocyte.">In vivo colocalisation of oskar mRNA and trans-acting proteins revealed by quantitative imaging of the Drosophila oocyte.</a> PLoS One. 4 (7), e6241 (2009).</li><li>Bayer, L. V., Omar, O. S., Bratu, D. P., Catrina, I. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PinMol:+Python+application+for+designing+molecular+beacons+for+live+cell+imaging+of+endogenous+mRNAs.">PinMol: Python application for designing molecular beacons for live cell imaging of endogenous mRNAs.</a> bioRxiv. , (2018).</li><li>Marras, S. A., Kramer, F. R., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiencies+of+fluorescence+resonance+energy+transfer+and+contact-mediated+quenching+in+oligonucleotide+probes.">Efficiencies of fluorescence resonance energy transfer and contact-mediated quenching in oligonucleotide probes.</a> Nucleic Acids Research. 30 (21), e122 (2002).</li><li>Bratu, D. P., Catrina, I. E., Marras, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tiny+molecular+beacons+for+in+vivo+mRNA+detection.">Tiny molecular beacons for in vivo mRNA detection.</a> Methods in Molecular Biology. 714, 141-157 (2011).</li><li>Dean, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+(pulling)+of+needles+for+gene+delivery+by+microinjection.">Preparation (pulling) of needles for gene delivery by microinjection.</a> Cold Spring Harbor. 2006 (7), (2006).</li><li>Alami, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+transport+of+TDP-43+mRNA+granules+is+impaired+by+ALS-causing+mutations.">Axonal transport of TDP-43 mRNA granules is impaired by ALS-causing mutations.</a> Neuron. 81 (3), 536-543 (2014).</li><li>Jackson, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+Hairpin+DNA-Functionalized+Gold+Nanoparticles+for+Imaging+mRNA+in+Living+Cells.">Applications of Hairpin DNA-Functionalized Gold Nanoparticles for Imaging mRNA in Living Cells.</a> Methods in Enzymology. 572, 87-103 (2016).</li><li>Zimyanin, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+oskar+mRNA+transport+reveals+the+mechanism+of+posterior+localization.">In vivo imaging of oskar mRNA transport reveals the mechanism of posterior localization.</a> Cell. 134 (5), 843-853 (2008).</li><li>Catrina, I. E., Marras, S. A., Bratu, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tiny+molecular+beacons:+LNA/2'-O-methyl+RNA+chimeric+probes+for+imaging+dynamic+mRNA+processes+in+living+cells.">Tiny molecular beacons: LNA/2'-O-methyl RNA chimeric probes for imaging dynamic mRNA processes in living cells.</a> ACS Chemical Biology. 7 (9), 1586-1595 (2012).</li><li>Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+cytosolic+delivery+of+molecular+beacon+conjugates+and+flow+cytometric+analysis+of+target+RNA.">Efficient cytosolic delivery of molecular beacon conjugates and flow cytometric analysis of target RNA.</a> Nucleic Acids Research. 36 (12), e69 (2008).</li><li>Nitin, N., Santangelo, P. J., Kim, G., Nie, S., Bao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide-linked+molecular+beacons+for+efficient+delivery+and+rapid+mRNA+detection+in+living+cells.">Peptide-linked molecular beacons for efficient delivery and rapid mRNA detection in living cells.</a> Nucleic Acids Research. 32 (6), e58 (2004).</li><li>Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avoiding+false-positive+signals+with+nuclease-vulnerable+molecular+beacons+in+single+living+cells.">Avoiding false-positive signals with nuclease-vulnerable molecular beacons in single living cells.</a> Nucleic Acids Research. 35 (16), e105 (2007).</li><li>Bevilacqua, P. C., Ritchey, L. E., Su, Z., Assmann, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+Analysis+of+RNA+Secondary+Structure.">Genome-Wide Analysis of RNA Secondary Structure.</a> Annual Review of Genetics. 50, 235-266 (2016).</li><li>Mhlanga, M. M., Vargas, D. Y., Fung, C. W., Kramer, F. R., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=tRNA-linked+molecular+beacons+for+imaging+mRNAs+in+the+cytoplasm+of+living+cells.">tRNA-linked molecular beacons for imaging mRNAs in the cytoplasm of living cells.</a> Nucleic Acids Research. 33 (6), 1902-1912 (2005).</li><li>Eliceiri, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+imaging+software+tools.">Biological imaging software tools.</a> Nature Methods. 9 (7), 697-710 (2012).</li><li>Bolte, S., Cordelieres, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guided+tour+into+subcellular+colocalization+analysis+in+light+microscopy.">A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy.</a> Journal of Microscopy. 224 (Pt 3), 213-232 (2006).</li><li>Trcek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+germ+granules+are+structured+and+contain+homotypic+mRNA+clusters.">Drosophila germ granules are structured and contain homotypic mRNA clusters.</a> Nature Commununications. 6, 7962 (2015).</li></ol>

La visualisation en direct du trafic d'ARNm endogène dans les chambres d'oeufs drosophila repose sur l'utilisation de MB spécifiques, efficaces et résistants aux nucléasmes, qui peuvent maintenant être facilement conçus avec le logiciel PinMol. Les MB sont des sondes spécifiques conçues pour détecter des séquences uniques au sein d'un ARNm cible (de préférence des régions exemptes de structure secondaire), ce qui rend possible la détection d'une transcription très résolue. La seule limit...

Les études de biologie cellulaire qui visualisent des événements dynamiques avec la résolution spatiale et temporelle ont été rendues possibles par le développement des techniques d'imagerie cellulaire vivante basées sur la fluorescence. Actuellement, la visualisation in vivo d'ARNm est réalisée par des technologies qui sont basées sur des interactions aptamer-protéine d'ARN, fluorescence aptamer-induite d'ARN des colorants organiques et sonde d'acide nucléique annealing1,2, 3. Ils offrent tous une grande spécificité, sensibilité et rapport signal-arrière. Cependant, les approches centrées sur l'aptamer d'ARN exigent la manipulation génétique étendue, où un transgène est conçu pour exprimer un ARN avec des motifs structurels artificiels qui sont exigés pour la liaison de protéine ou organique de colorant. Par exemple, le système MS2/MCP exige la coexpression d'un transgène exprimant une construction d'ARN contenant plusieurs répétitions en tandem de la séquence de liaison pour la protéine bactériophage MS2 (MCP), et un autre transgène codant une protéine fluorescente fusionné à MCP4,5. L'ajout de tels motifs structurels secondaires à l'ARN, ainsi qu'une protéine voilonée étiquetée fluorescente, a soulevé des préoccupations que les processus d'ARN indigènes peuvent être affectés6. Une technologie qui répond à cette préoccupation et offre d'autres avantages uniques est l'approche à base d'acide nucléique, les balises moléculaires (MBs). Les MB permettent la détection multiplexe des ARNm endogènes, la discrimination des variations nucléotides simples, et la cinétique rapide de l'hybridation avec l'ARNm cible7,8. Les MB sont des sondes oligonucléotides qui restent dans un pli d'épingle à cheveux éteint avant de subir un changement de conformationnel fluorogénique une fois qu'ils s'hybrident à leurs cibles (Figure 1C)9. Plusieurs groupes ont réussi à utiliser les MB pour détecter à la fois les ARN non codants (microARN et lncRNAs)10,11,12,13, les rétrovirus d'ARN14 et les dynamiques ADN-protéines interactions15. Ils ont été utilisés avec succès pour l'imagerie dans divers organismes et tissus, tels que les embryons de poissons zèbres16, neurones13, tissu tumoral17, différenciant cardiomyocytes18, et Salmonella 19.
Nous décrivons ici l'approche de conception, de livraison et de détection des ARNm endogènes dans les chambres d'œufs D. melanogaster vivantes couplée à une configuration de microscopie qui est assez rapide pour capturer la gamme dynamique du transport moléculaire actif. La chambre d'oeuf séminocytrale de D. melanogaster a servi de système modèle multicellulaire idéal pour un large éventail d'études développementales, de la division des cellules souches germinées précoces et de l'expression des gènes maternels à la génération du plan corporel segmentaire20, 21. Les chambres d'oeufs sont facilement isolées, grandes et translucides, et capables de résister à des heures d'analyse ex vivo, ce qui les rend très propices aux expériences d'imagerie. Beaucoup de travail a porté sur la localisation asymétrique des transcriptions maternelles aux régions subcellulaires discrètes avant d'être activement traduites. En particulier, la localisation de l'ARNm oskar et sa traduction ultérieure au pôle postérieur de l'ovocyte doivent se produire d'une manière étroitement réglementée pour éviter un phénotype d'embryon bicaudal mortel22. L'ARNm oskar est transcrit dans les 15 cellules germinales, appelées cellules d'infirmière, et activement transporté par des ponts cytoplasmiques, appelés canaux d'anneau, dans l'oocyte, la cellule germinale qui devient l'œuf mûr et est finalement fécondé (Figure 1A ). La quantité considérable d'informations déjà disponibles concernant le recrutement dynamique et l'échange de facteurs protéiques à destination et en provenance du mRNP oskar, ainsi que son voyage intracellulaire à longue portée, font d'oskar un candidat privilégié pour étudier les nombreux processus du cycle de vie de l'ARNm. Les MB ont joué un rôle déterminant dans la révélation de détails sur le processus de localisation de l'ARNm et le déchiffrement de la régulation et de la fonction des facteurs protéiques qui contrôlent le transport de l'ARNm pendant l'oogenèse de Drosophila. En particulier, en micro-injectant des MB dans les cellules d'infirmières et en effectuant des expériences d'imagerie cellulaire en direct, le suivi des ARNm endogènes est possible8,23.
La feuille de route présentée ici offre les étapes d'un processus complet, de la réalisation d'une expérience d'imagerie cellulaire en direct à l'aide de MBs, l'acquisition de données d'imagerie, à l'exécution de l'analyse des données pour suivre l'ARNm endogène dans son environnement cellulaire natif. Les étapes peuvent être modifiées et optimisées pour répondre aux besoins des chercheurs travaillant avec d'autres tissus/types de cellules dans leur propre laboratoire.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Spectrofluorometer</td>
			<td>Fluoromax-4 Horiba-Jobin Yvon</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Photon counting spectrofluorometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz cuvette</td>
			<td>Fireflysci (former Precision Cells Inc.)</td>
			<td>701MFL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 tweezer</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501985</td>
			<td>Thin tweezers are very important to separate out the individual egg chambers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 700</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slip No.1 22 x 40mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Leica MZ6 Leica Microsystems Inc.</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 fruit fly anesthesia pad</td>
			<td>Genesee Scienific</td>
			<td>59-114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCL pH7.5</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1185-53-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning disc confocal microscope</td>
			<td>Leica DMI-4000B inverted microscope equipped with Yokogawa CSU 10 spinning disc Leica Microsystems Inc.</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamamatsu C9100-13 ImagEM EMCCD camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PatchMan NP 2 Micromanipulator</td>
			<td>Eppendorf Inc.</td>
			<td>920000037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FemtoJet Microinjector</td>
			<td>Eppendorf Inc.</td>
			<td>920010504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection needle: Femtotips II</td>
			<td>Eppendorf Inc.</td>
			<td>930000043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading tip: 20ul Microloader</td>
			<td>Eppendorf Inc.</td>
			<td>930001007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Cover glasses no. 1 or 1.5, 22x40mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-026; 48393-172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry yeast</td>
			<td>Any grocery store</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer, &#62; 20 GB RAM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Although processing can be carried out on most computers, higher capabilities will increase the speed of the processing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing and tracking endogenous mrnas in live drosophila melanogaster egg chambers

Les techniques d'imagerie à base de fluorescence, combinées aux développements de la microscopie légère, ont révolutionné la façon dont les biologistes cellulaires mènent des études d'imagerie cellulaire vivante. Les méthodes de détection des ARN se sont considérablement développées depuis que les études séminales ont lié la localisation de l'ARNm spécifique au site à la régulation de l'expression génique. Les processus d'ARNm dynamique s'accompagnent désormais d'approches qui détectent les ARNm, couplées à des configurations de microscopie suffisamment rapides pour capturer la gamme dynamique du comportement moléculaire. La technologie de balise moléculaire est une approche basée sur l'hybridation capable de détecter directement les transcriptions endogènes dans les cellules vivantes. Les balises moléculaires sont en forme d'épingle à cheveux, étanchées à l'intérieur, un seul nucléotide discriminant les sondes d'acide nucléique, qui fluoresce seulement sur l'hybridation à une séquence cible unique. Lorsqu'ils sont couplés à la microscopie à fluorescence avancée et à la formation image à haute résolution, ils permettent d'effectuer un suivi spatial et temporel du mouvement intracellulaire des ARNM. Bien que cette technologie soit la seule méthode capable de détecter les transcriptions endogènes, les biologistes cellulaires n'ont pas encore pleinement adopté cette technologie en raison des difficultés dans la conception de telles sondes pour l'imagerie cellulaire vivante. Une nouvelle application logicielle, PinMol, permet une conception améliorée et rapide des sondes les mieux adaptées pour s'hybrider efficacement aux régions cibles de l'ARNm au sein d'une cellule vivante. En outre, l'acquisition d'images haute résolution et en temps réel et le logiciel actuel d'analyse d'images open source permettent une sortie de données affinée, ce qui permet une évaluation plus fine de la complexité qui sous-tend les processus dynamiques impliqués dans le cycle de vie de l'ARNm.
Nous présentons ici un protocole complet pour la conception et la livraison de balises moléculaires dans les chambres d'œufs Drosophila melanogaster. La détection et la visualisation directes et très spécifiques des ARNm maternels endogènes sont effectuées par microscopie confocale de disque tournant. Les données d'imagerie sont traitées et analysées à l'aide de la détection et du suivi d'objets dans le logiciel Icy afin d'obtenir des détails sur le mouvement dynamique des ARNM, qui sont transportés et localisés dans des régions spécialisées au sein de l'ovocyte.

À l'aide de PinMol, plusieurs MB peuvent être conçus pour une cible de l'ARNm (Figure 1B-C). Après synthèse et purification, les MB sélectionnés sont caractérisés et comparés à l'aide d'analyses in vitro.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58545/58545fig1.jpg"> Figure 1 : Technique et description des tissus pour l'imagerie cellu...

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Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Ici, nous présentons un protocole pour la visualisation, la détection, l'analyse et le suivi du trafic endogène d'ARNm dans la chambre d'oeufs de Melasophila melanogaster vivante utilisant des balises moléculaires, la microscopie confocale de disque spinning, et l'analyse open-source logiciel.

Visualisation et suivi des ARNm endogènes dans Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Fluorescence-based imaging techniques, in combination with developments in light microscopy, have revolutionized how cell biologists conduct live cell ...

Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans le domaine de la biologie de l’ARN sur le mécanisme et la fonction de localisation polarisée de l’ARN. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet la visualisation en temps réel du trafic d’ARN endogène dans les tissus vivants. Les implications de cette technique s’étendent vers la thérapie des maladies liées à l’ARN parce qu’elle a un potentiel pour découvrir de nouvelles cibles thérapeutiques.Bien que cette méthode puisse donner un aperçu des processus d’ARN dans la chambre d’oeufs de mouche des fruits, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes tels que dans le poisson zèbre ou les cellules de culture. En général, les personnes nouvelles à cette méthode auront du mal en raison des défis associés à la conception et la livraison des accessoires de balise moléculaire. Pour la microinjection moléculaire de balise, sélectionnez l’objectif d’huile de 40X et montez un coverslip avec la chambre disséquée d’oeuf sur l’étape de microscope.Localisez une chambre d’oeufs au stade de développement moyen à tardif qui est correctement orientée pour la microinjection. Ensuite, installez un microinjecteur avec les pressions d’injection et de compensation appropriées. À l’aide du joystick du micro manipulateur, abaissez doucement une aiguille chargée d’un microlitre de solution de balise moléculaire dans la chute d’huile.Concentrez la pointe vers la périphérie du champ de vision. Exécutez une fonction propre pour enlever l’air de la pointe de l’aiguille et pour s’assurer qu’il y a écoulement de l’aiguille et amener l’aiguille à la position de la maison. Concentrez-vous sur la chambre d’œuf à microinjecter et remettre l’aiguille au point près du bord de la chambre d’oeufs.Effectuer un ajustement fin de la position z de l’objectif de sorte que la membrane séparant les cellules follicules des cellules infirmières est au point. Insérez l’aiguille dans une cellule d’infirmière pour l’injection des balises moléculaires sur une période de deux à cinq secondes. Pour assurer le succès reproductible de la microinjection, concentrez-vous soigneusement sur la membrane séparant les cellules follicules et les cellules infirmières qui seront injectées tout en mettant la pointe de l’aiguille au point avec le micro manipulateur.Lorsque toutes les balises moléculaires ont été injectées, retirez doucement l’aiguille et rétractez-la à la position de la maison. Modifiez l’objectif au grossissement souhaité pour l’acquisition d’images. Ensuite, concentrez-vous sur la chambre d’oeufs sous le nouvel objectif et commencer l’acquisition de l’image.Pour la détection ponctuelle des balises moléculaires, ouvrez les images dans Image J.Utilisez l’outil convertir en ICY pour convertir les images en ICY. Une barre d’échelle sera automatiquement superposée sur la pile. Modifiez la barre d’échelle par l’intermédiaire de la fenêtre de l’inspecteur si nécessaire.Inactivez ensuite l’icône de l’œil pour la barre d’échelle sous l’onglet couche pour supprimer la barre d’échelle de la pile d’origine. Sélectionnez détection et suivi, détection et détecteur de taches, et confirmez que la détection d’entrée de séquence actuelle et le canal zéro sont sélectionnés pour les paramètres d’entrée et de prétraitement respectivement. Pour le détecteur, sélectionnez détecter les taches brillantes sur fond sombre en utilisant l’utilisation de la force des longueurs d’onde 2D pour la 3D seulement s’il n’y a pas assez de tranches z dans les piles pour effectuer l’analyse.Sélectionnez les échelles et la sensibilité pour chaque échelle en ajoutant plus d’échelles pour les taches plus grandes et confirmez que la région d’intérêt de la séquence est définie pour la région d’intérêt. Pour le filtrage, confirmez qu’aucun filtrage n’a été défini et sélectionnez le format de fichier approprié sous sortie. Si les résultats du détecteur de taches doivent être utilisés pour l’analyse de suivi, sélectionnez l’exportation vers la piscine.Pour l’analyse de colocalisation, répétez la détection ponctuelle pour l’autre canal. Pour suivre les balises moléculaires, sélectionnez la détection et le suivi, le suivi, le suivi des taches et exécutez le détecteur de taches en utilisant les mêmes paramètres que pour la détection ponctuelle. Cliquez sur les paramètres d’estimation et sélectionnez le mouvement cible désiré dans la fenêtre popup d’estimation des paramètres.Cliquez ensuite sur exécuter le suivi. Pour visualiser les pistes, sélectionnez détection et suivi, suivi et gestionnaire de piste. Pour le processeur de piste couleur, sélectionnez activer et sélectionner une couleur pour les pistes.À partir d’ajouter le processeur de voie, sélectionnez le clip de temps de processeur de voie. Dans la fenêtre clipper de vérification, entrez le nombre de détections à montrer avant et après le point de temps actuel. Enregistrez les informations de la piste en tant que fichier de piste XML et utilisez l’icône de la caméra pour obtenir une capture d’écran des résultats.Pour projeter la pile le long de la direction z, utilisez la barre de recherche pour trouver le plugin et sélectionnez la projection maximale du menu dropdown. Dans la fenêtre de l’inspecteur, sélectionnez l’onglet séquence, la toile et la rotation pour ajuster l’image à l’orientation désirée et obtenir une capture d’écran de l’image tournée. Sélectionnez ensuite la région d’intérêt, la région d’intérêt 2D, choisissez la forme de la région d’intérêt et sélectionnez la région d’intérêt sur l’image à recadrage.Installez le plugin de superposition timestamp et ajoutez une lampe de temps suivant les instructions dans la fenêtre contextup pour les directions sur la façon de placer et de formater la lampe à temps. Pour modifier ou ajouter l’intervalle de temps, cliquez sur modifier la fenêtre propriétés de séquence. Activez l’icône de l’œil pour rajouter la barre d’échelle sous l’onglet couche dans la fenêtre de l’inspecteur.Ensuite, obtenez une capture d’écran des résultats timestamped et enregistrer l’image dans les deux formats TIFF et AVI. En utilisant cette méthode comme démontré, il est possible de visualiser les schémas de transport et de localisation des ARNH endogènes par l’intermédiaire de balises moléculaires à différents stades de l’œogenèse et en particulier à l’oogenèse moyenne et après. Lorsqu’elles sont injectées individuellement dans les mêmes chambres d’oeufs de stade, différentes balises moléculaires spécifiques à l’oskar présentent le même modèle de localisation.Les balises moléculaires injectées dans le cytoplasme d’une cellule infirmière se diffusent librement dans les cellules infirmières adjacentes ainsi que dans l’ovocyte. Ainsi, les balises sont capables de s’hybrider avec leurs cibles et de générer des signaux de fluorescence à d’autres sites que le site de microinjection. Dans les chambres d’oeufs transgéniques oskar GFP au milieu de l’oogenèse, l’analyse des données d’acquisition montre une colocalisation étendue pour le signal de fluorescence de l’ARNm oskar marqué oskar génétiquement modifié avec le signal de fluorescence détecté à l’aide de balises moléculaires.En outre, les piles 5D peuvent être analysées plus en détail pour déterminer les trajectoires de l’ARNm oskar pour le transport à longue distance dans le cytoplasme des cellules infirmières et des ovocytes. Après son développement, cette technique a ouvert la voie à des chercheurs dans le domaine de la biologie de l’ARN pour explorer le transport endogène de l’ARNm maternel et la localisation dans la chambre d’oeufs de Drosophila.

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Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Control of Gene Expression

SCIENTISTS IN ACTION

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