Name: visualizing and tracking endogenous mrnas in live drosophila melanogaster egg chambers
Uploaded: 2019-06-04T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers at JoVE.com

אנו מודים סלווטורה A.E. Marras (מרכז מחקר בריאות הציבור, באוניברסיטת רטגרס) לסינתזה, תיוג וטיהור של משואות מולקולרית, דניאל St ג'ונסטון (מכון גורדון, אוניברסיטת קיימברידג ') עבור אוסקר-MS2/ מניות לטיסה. עבודה זו היתה נתמכת על ידי פרס לאומי של קרן המדע בשנת 1149738 ופרס צוות מקצועי לקונגרס-CUNY ל DPB.

1. עיצוב של MBs לדימות תאים חיים
<ol><li>
מקפלים את היעד ברצף RNA כדי לחזות את המבנה המשני של היעד mRNA באמצעות "הטופס RNA" מהשרת mfold (http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/RNA-Folding-Form).
	<ol>
<li>הדבק/העלה את רצף היעד בפורמט FASTA, בחר 5 או 10% משנה את הצורה (מבנים עם אנרגיה חופשית של קיפול בתוך 5 או 10% של ערך MFE, בהתאמה), ...

<ol>
	<li>Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+RNA+distribution+and+dynamics+in+living+cells.">Imaging intracellular RNA distribution and dynamics in living cells.</a> Nature Methods. 6 (5), 331-338 (2009).</li><li>Bao, G., Rhee, W. J., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+probes+for+live-cell+RNA+detection.">Fluorescent probes for live-cell RNA detection.</a> Annual Reviews of Biomedical Engineering. 11, 25-47 (2009).</li><li>Mannack, L. V., Eising, S., Rentmeister, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+techniques+for+visualizing+RNA+in+cells.">Current techniques for visualizing RNA in cells.</a> F1000Research. 5, (2016).</li><li>Larson, D. R., Zenklusen, D., Wu, B., Chao, J. A., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+observation+of+transcription+initiation+and+elongation+on+an+endogenous+yeast+gene.">Real-time observation of transcription initiation and elongation on an endogenous yeast gene.</a> Science. 332 (6028), 475-478 (2011).</li><li>Bertrand, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+ASH1+mRNA+particles+in+living+yeast.">Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast.</a> Molecular Cell. 2 (4), 437-445 (1998).</li><li>Garcia, J. F., Parker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MS2+coat+proteins+bound+to+yeast+mRNAs+block+5'+to+3'+degradation+and+trap+mRNA+decay+products:+implications+for+the+localization+of+mRNAs+by+MS2-MCP+system.">MS2 coat proteins bound to yeast mRNAs block 5' to 3' degradation and trap mRNA decay products: implications for the localization of mRNAs by MS2-MCP system.</a> RNA. 21 (8), 1393-1395 (2015).</li><li>Bratu, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+beacons:+Fluorescent+probes+for+detection+of+endogenous+mRNAs+in+living+cells.">Molecular beacons: Fluorescent probes for detection of endogenous mRNAs in living cells.</a> Methods in Molecular Biology. 319, 1-14 (2006).</li><li>Bratu, D. P., Cha, B. J., Mhlanga, M. M., Kramer, F. R., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+the+distribution+and+transport+of+mRNAs+in+living+cells.">Visualizing the distribution and transport of mRNAs in living cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 100 (23), 13308-13313 (2003).</li><li>Tyagi, S., Kramer, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+beacons:+probes+that+fluoresce+upon+hybridization.">Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization.</a> Nature Biotechnology. 14 (3), 303-308 (1996).</li><li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+beacon-based+approach+for+live-cell+imaging+of+RNA+transcripts+with+minimal+target+engineering+at+the+single-molecule+level.">A molecular beacon-based approach for live-cell imaging of RNA transcripts with minimal target engineering at the single-molecule level.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1550 (2017).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+detection+of+microRNAs+by+combining+molecular+beacon+probes+with+T7+exonuclease-assisted+cyclic+amplification+reaction.">Multiplex detection of microRNAs by combining molecular beacon probes with T7 exonuclease-assisted cyclic amplification reaction.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (1), 107-114 (2017).</li><li>Baker, M. B., Bao, G., Searles, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+quantification+of+specific+microRNA+using+molecular+beacons.">In vitro quantification of specific microRNA using molecular beacons.</a> Nucleic Acids Research. 40 (2), e13 (2012).</li><li>Ko, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+color-tunable+molecular+beacon+to+sense+miRNA-9+expression+during+neurogenesis.">A color-tunable molecular beacon to sense miRNA-9 expression during neurogenesis.</a> Scientific Reports. 4, 4626 (2014).</li><li>Vet, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+detection+of+four+pathogenic+retroviruses+using+molecular+beacons.">Multiplex detection of four pathogenic retroviruses using molecular beacons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 96 (11), 6394-6399 (1999).</li><li>Li, J., Cao, Z. C., Tang, Z., Wang, K., Tan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+beacons+for+protein-DNA+interaction+studies.">Molecular beacons for protein-DNA interaction studies.</a> Methods in Molecular Biology. 429, 209-224 (2008).</li><li>Li, W. M., Chan, C. M., Miller, A. L., Lee, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+Functional+Roles+of+Molecular+Beacon+as+a+MicroRNA+Detector+and+Inhibitor.">Dual Functional Roles of Molecular Beacon as a MicroRNA Detector and Inhibitor.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (9), 3568-3580 (2017).</li><li>Kuang, T., Chang, L., Peng, X., Hu, X., Gallego-Perez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Beacon+Nano-Sensors+for+Probing+Living+Cancer+Cells.">Molecular Beacon Nano-Sensors for Probing Living Cancer Cells.</a> Trends in Biotechnology. 35 (4), 347-359 (2017).</li><li>Ban, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-genetic+Purification+of+Ventricular+Cardiomyocytes+from+Differentiating+Embryonic+Stem+Cells+through+Molecular+Beacons+Targeting+IRX-4.">Non-genetic Purification of Ventricular Cardiomyocytes from Differentiating Embryonic Stem Cells through Molecular Beacons Targeting IRX-4.</a> Stem Cell Reports. 5 (6), 1239-1249 (2015).</li><li>Hadjinicolaou, A. V., Demetriou, V. L., Emmanuel, M. A., Kakoyiannis, C. K., Kostrikis, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+beacon-based+real-time+PCR+detection+of+primary+isolates+of+Salmonella+Typhimurium+and+Salmonella+Enteritidis+in+environmental+and+clinical+samples.">Molecular beacon-based real-time PCR detection of primary isolates of Salmonella Typhimurium and Salmonella Enteritidis in environmental and clinical samples.</a> BMC Microbiology. 9, 97 (2009).</li><li>McLaughlin, J. M., Bratu, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+melanogaster+Oogenesis:+An+Overview.">Drosophila melanogaster Oogenesis: An Overview.</a> Methods in Molecular Biology. 1328, 1-20 (2015).</li><li>Bastock, R., St Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+oogenesis.">Drosophila oogenesis.</a> Current Biology. 18 (23), R1082-R1087 (2008).</li><li>Rongo, C., Gavis, E. R., Lehmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+oskar+RNA+regulates+oskar+translation+and+requires+Oskar+protein.">Localization of oskar RNA regulates oskar translation and requires Oskar protein.</a> Development. 121 (9), 2737-2746 (1995).</li><li>Mhlanga, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+colocalisation+of+oskar+mRNA+and+trans-acting+proteins+revealed+by+quantitative+imaging+of+the+Drosophila+oocyte.">In vivo colocalisation of oskar mRNA and trans-acting proteins revealed by quantitative imaging of the Drosophila oocyte.</a> PLoS One. 4 (7), e6241 (2009).</li><li>Bayer, L. V., Omar, O. S., Bratu, D. P., Catrina, I. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PinMol:+Python+application+for+designing+molecular+beacons+for+live+cell+imaging+of+endogenous+mRNAs.">PinMol: Python application for designing molecular beacons for live cell imaging of endogenous mRNAs.</a> bioRxiv. , (2018).</li><li>Marras, S. A., Kramer, F. R., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiencies+of+fluorescence+resonance+energy+transfer+and+contact-mediated+quenching+in+oligonucleotide+probes.">Efficiencies of fluorescence resonance energy transfer and contact-mediated quenching in oligonucleotide probes.</a> Nucleic Acids Research. 30 (21), e122 (2002).</li><li>Bratu, D. P., Catrina, I. E., Marras, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tiny+molecular+beacons+for+in+vivo+mRNA+detection.">Tiny molecular beacons for in vivo mRNA detection.</a> Methods in Molecular Biology. 714, 141-157 (2011).</li><li>Dean, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+(pulling)+of+needles+for+gene+delivery+by+microinjection.">Preparation (pulling) of needles for gene delivery by microinjection.</a> Cold Spring Harbor. 2006 (7), (2006).</li><li>Alami, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+transport+of+TDP-43+mRNA+granules+is+impaired+by+ALS-causing+mutations.">Axonal transport of TDP-43 mRNA granules is impaired by ALS-causing mutations.</a> Neuron. 81 (3), 536-543 (2014).</li><li>Jackson, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+Hairpin+DNA-Functionalized+Gold+Nanoparticles+for+Imaging+mRNA+in+Living+Cells.">Applications of Hairpin DNA-Functionalized Gold Nanoparticles for Imaging mRNA in Living Cells.</a> Methods in Enzymology. 572, 87-103 (2016).</li><li>Zimyanin, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+oskar+mRNA+transport+reveals+the+mechanism+of+posterior+localization.">In vivo imaging of oskar mRNA transport reveals the mechanism of posterior localization.</a> Cell. 134 (5), 843-853 (2008).</li><li>Catrina, I. E., Marras, S. A., Bratu, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tiny+molecular+beacons:+LNA/2'-O-methyl+RNA+chimeric+probes+for+imaging+dynamic+mRNA+processes+in+living+cells.">Tiny molecular beacons: LNA/2'-O-methyl RNA chimeric probes for imaging dynamic mRNA processes in living cells.</a> ACS Chemical Biology. 7 (9), 1586-1595 (2012).</li><li>Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+cytosolic+delivery+of+molecular+beacon+conjugates+and+flow+cytometric+analysis+of+target+RNA.">Efficient cytosolic delivery of molecular beacon conjugates and flow cytometric analysis of target RNA.</a> Nucleic Acids Research. 36 (12), e69 (2008).</li><li>Nitin, N., Santangelo, P. J., Kim, G., Nie, S., Bao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide-linked+molecular+beacons+for+efficient+delivery+and+rapid+mRNA+detection+in+living+cells.">Peptide-linked molecular beacons for efficient delivery and rapid mRNA detection in living cells.</a> Nucleic Acids Research. 32 (6), e58 (2004).</li><li>Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avoiding+false-positive+signals+with+nuclease-vulnerable+molecular+beacons+in+single+living+cells.">Avoiding false-positive signals with nuclease-vulnerable molecular beacons in single living cells.</a> Nucleic Acids Research. 35 (16), e105 (2007).</li><li>Bevilacqua, P. C., Ritchey, L. E., Su, Z., Assmann, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+Analysis+of+RNA+Secondary+Structure.">Genome-Wide Analysis of RNA Secondary Structure.</a> Annual Review of Genetics. 50, 235-266 (2016).</li><li>Mhlanga, M. M., Vargas, D. Y., Fung, C. W., Kramer, F. R., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=tRNA-linked+molecular+beacons+for+imaging+mRNAs+in+the+cytoplasm+of+living+cells.">tRNA-linked molecular beacons for imaging mRNAs in the cytoplasm of living cells.</a> Nucleic Acids Research. 33 (6), 1902-1912 (2005).</li><li>Eliceiri, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+imaging+software+tools.">Biological imaging software tools.</a> Nature Methods. 9 (7), 697-710 (2012).</li><li>Bolte, S., Cordelieres, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guided+tour+into+subcellular+colocalization+analysis+in+light+microscopy.">A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy.</a> Journal of Microscopy. 224 (Pt 3), 213-232 (2006).</li><li>Trcek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+germ+granules+are+structured+and+contain+homotypic+mRNA+clusters.">Drosophila germ granules are structured and contain homotypic mRNA clusters.</a> Nature Commununications. 6, 7962 (2015).</li></ol>

ויזואליזציה בשידור חי של סחר הנשים האנסוגני ב- Drosophila ילה תאי ביצה מסתמך על שימוש ספציפי, יעיל, ו nuclease עמידים לשימוש, אשר כעת ניתן לתכנן בקלות עם תוכנת pinmol . MBs הם רגשים ספציפיים שנועדו לזהות רצפים ייחודיים בתוך mRNA היעד (רצוי אזורים ללא מבנה משני), מה שמאפשר זיהוי מאוד מוחלט של תעתיק. ?...

ביולוגיה של התא מחקרים להמחיש אירועים דינמיים עם רזולוציה מרחבית וזמני התאפשרה על ידי פיתוח של טכניקות הדמיה של תאים בעלי מבוססי-זריחה חי. כיום, ב vivo mrna הדמיה מושגת באמצעות טכנולוגיות המבוססות על rna aptamer-חלבון אינטראקציות, רנ א aptamer אלף המושרה של צבעים אורגניים וחומצה גרעין בדיקה ריפוי1,2, 3. כולם מציעים שיעור גבוה, רגישות ויחס אות לרקע. עם זאת, הגישות במרכז RNA aptamer-ממורכז דורשות מניפולציה גנטית נרחבת, שם מתוכנן לבטא רנ א עם מוטיבים מבניים מלאכותיים הדרושים עבור חלבון או מחייב צבע אורגני. לדוגמה, מערכת MS2/MCP מחייבת את הביטוי המשותף של הרשת המביעה מבנה RNA המכיל מספר חזרות דו-מושביים של רצף הכריכה עבור החלבון בקטביאג MS2 מעיל (MCP), והצפנה נוספת של חלבון פלורסנט . התמזגו ל-MCP4,5 התוספת של מוטיבים מבניים כגון ל-RNA, יחד עם חלבון מתויג מגושם, העלה חששות כי תהליכי RNA הילידים עשויים להיות מושפעים6. טכנולוגיה המטפלת בדאגה זו ומציעה יתרונות ייחודיים נוספים היא הגישה המבוססת על חומצות גרעין, משואות מולקולריות (MBs). MBs לאפשר זיהוי מולטידוגני של החומרים האנדוגניים, אפליה של נוקלאוטיד יחיד וריאציות, ו קינטיקה מהירה של הכלאה עם mrnas המטרה7,8. ב-MBs משתנים בדיקה שנותרו בקיפול מכופף לפני שעברו שינוי של fluorogenic ברגע שהם hybridize ליעדים שלהם (איור 1C)9. מספר קבוצות הצליחו להשתמש ב-MBs כדי לזהות שניהם rnas שאינם קידוד (מיקרורונאס ו-lncrnas)10,11,12,13, RNA רטרווירוסים14 ו-DNA דינאמי-חלבון אינטראקציות15. הם כבר מועסק בהצלחה עבור הדמיה באורגניזמים שונים ורקמות, כגון עוברי דג העוברים16, נוירונים13, רקמות הגידול17, ההבחנה הקרדיוציטים18, סלמונלה . בן 19
כאן אנו מתארים את העיצוב, המסירה ואת הגישה לגילוי עבור mRNAs האנדוגניים בחיים D. מלאנוגסטר חדרי ביצה בשילוב עם הגדרת מיקרוסקופ מספיק מהר כדי ללכוד את טווח דינמי של הובלה מולקולרית פעיל. תא ביצת D. melanogaster שימש מערכת המודל האידיאלי מרובת תאים עבור מגוון רחב של מחקרים התפתחותיים, מ-germline מוקדם גזע התא וביטוי גנים אימהית לדור של הגוף מגזרי20, . עשריםואחד תאי ביצה מבודדים בקלות, גדול שקוף, ומסוגל לעמוד שעות של ניתוח vivo ex , מה שהופך אותם קל מאוד ניסויים הדמיה. עבודה רבה התמקדה לוקליזציה אסימטרית של תעתיקים אימהי לאזורים בדידים משנה דיסקרטית לפני שהוא מתורגם באופן פעיל. במיוחד, לוקליזציה של אוסקר mrna ואת התרגום העוקב שלה בקוטב האחורי של oocyte חייב להתרחש בצורה מוסדר היטב כדי למנוע העובר הקטלני בלאודל היום22. אוסקר mrna משועתק בתאים 15 germline, שנקרא תאים האחות, ומועברים באופן פעיל דרך גשרים cytoplasmic, קרא תעלות הטבעת, לתוך oocyte, התא germline הופך ביצה בוגרת מופרית בסופו של דבר (איור 1a ). כמות ניכרת של מידע זמין כבר לגבי גיוס דינמי וחילופי חלבונים של גורמי חלבון מ- אוסקר mrnp, יחד עם נסיעות הארוך שלה תאיים שלה, להפוך את אוסקר למועמד המועדף ללמוד תהליכים רבים של מחזור החיים mRNA. MBs כבר אינסטרומנטלי לחשוף פרטים על תהליך הלוקליזציה של mRNA ופענוח הרגולציה והתפקוד של גורמי חלבון השולטים בתחבורה mRNA במהלך Drosophila ילה oogenesis. במיוחד, על ידי מיקרו הזרקת MBs לתוך התאים האחות וביצוע ניסויים הדמיה תא חי, המעקב אחר mrnas מעקב אפשרי8,23.
מפת הדרכים המוצגת כאן מציעה את השלבים של תהליך שלם, החל בביצוע ניסוי הדמיה של תא חי באמצעות MBs, רכישת נתוני הדמיה, כדי לבצע ניתוח נתונים כדי לעקוב אחר mRNA אנדוגניים בסביבה הסלולרית הטבעית שלה. השלבים יכולים להיות שונה וממוטב נוסף כדי לענות על הצרכים של חוקרים לעבוד עם רקמות אחרות/סוגי תאים בתוך הגדרת המעבדה שלהם.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Spectrofluorometer</td>
			<td>Fluoromax-4 Horiba-Jobin Yvon</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Photon counting spectrofluorometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz cuvette</td>
			<td>Fireflysci (former Precision Cells Inc.)</td>
			<td>701MFL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 tweezer</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501985</td>
			<td>Thin tweezers are very important to separate out the individual egg chambers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 700</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slip No.1 22 x 40mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Leica MZ6 Leica Microsystems Inc.</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 fruit fly anesthesia pad</td>
			<td>Genesee Scienific</td>
			<td>59-114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCL pH7.5</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1185-53-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning disc confocal microscope</td>
			<td>Leica DMI-4000B inverted microscope equipped with Yokogawa CSU 10 spinning disc Leica Microsystems Inc.</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamamatsu C9100-13 ImagEM EMCCD camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PatchMan NP 2 Micromanipulator</td>
			<td>Eppendorf Inc.</td>
			<td>920000037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FemtoJet Microinjector</td>
			<td>Eppendorf Inc.</td>
			<td>920010504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection needle: Femtotips II</td>
			<td>Eppendorf Inc.</td>
			<td>930000043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading tip: 20ul Microloader</td>
			<td>Eppendorf Inc.</td>
			<td>930001007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Cover glasses no. 1 or 1.5, 22x40mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-026; 48393-172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry yeast</td>
			<td>Any grocery store</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer, &#62; 20 GB RAM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Although processing can be carried out on most computers, higher capabilities will increase the speed of the processing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing and tracking endogenous mrnas in live drosophila melanogaster egg chambers

שיטות הדמיה מבוססות-פלואורסצנטית, בשילוב עם התפתחויות במיקרוסקופיה קלה, יש מהפכה כיצד ביולוגים תא לנהל לימודי הדמיה של תאים חיים. שיטות זיהוי RNAs התרחבו מאוד מאז לימודי הזרע מקושרים לוקליזציה mRNA ספציפי לאתר לתקנות ביטוי גנים. תהליכי mRNA דינאמי יכול כעת להיות מדמיין באמצעות גישות המאתרות Mrna, בשילוב עם set-ups מיקרוסקופ כי הם מהירים מספיק כדי ללכוד את טווח דינמי של התנהגות מולקולרית. מסוגל לגילוי ישיר של תעתיקים. של התאים החיים משואות מולקולריות הן בצורת ראש, מנותת פנימי, יחיד-נוקלאוטיד להפלות בדיקה חומצות גרעין, אשר זרוח, רק על הכלאה לרצף יעד ייחודי. כאשר מצמידים עם מיקרוסקופ פלואורסצנטית מתקדם הדמיה ברזולוציה גבוהה, הם מאפשרים אחד לבצע מעקב מרחבי וזמני של תנועה תאיים של mRNAs. למרות טכנולוגיה זו היא השיטה היחידה המסוגלת לזהות תעתיקים אנדוגניים, ביולוגים תא עדיין לא חיבק באופן מלא בטכנולוגיה זו בשל קשיים בעיצוב בדיקות כאלה עבור הדמיה תא חי. יישום תוכנה חדש, Pinmol, מאפשר עיצוב משופר ומהיר של הגששים המתאימים ביותר לhybridize ביעילות אזורים היעד mrna בתוך תא חי. בנוסף, ברזולוציה גבוהה, רכישת תמונה בזמן אמת, הנוכחי, ניתוח תמונה קוד פתוח תוכנה לאפשר פלט נתונים מעודן, המוביל הערכה עדינה יותר של המורכבות הבסיסית של תהליכים דינמיים המעורבים במחזור החיים של mRNA.
כאן אנו מציגים פרוטוקול מקיף לעיצוב ושליחת משואות מולקולריות לתוך מלאנוזופרסטר תאי ביצה. הזיהוי וההדמיה הישירה והייחודית ביותר של מיקרו-האמדוגני מבוצעת באמצעות מיקרוסקופ מסתובב הדיסק. נתוני הדמיה מעובדים ומנותח באמצעות זיהוי אובייקטים ומעקב בתוכנה קרח כדי לקבל פרטים על התנועה הדינמית של mRNAs, אשר מועברים ומקומי לאזורים מיוחדים בתוך oocyte.

באמצעות Pinmol, ניתן לתכנן מספר MBs עבור יעד mrna אחד (איור 1b-C). לאחר הסינתזה והטיהור, השימוש ב-MBs הנבחר מאופיין בניתוח חוץ-גופית.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58545/58545fig1.jpg"> איור 1: טכניקה ותיאור הרקמה עבור הדמ?...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers at JoVE.com

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור ויזואליזציה, זיהוי, ניתוח ומעקב של סחר האנטי-מסוגגני mRNA בחיים Drosophila ילה מלאנוסטר תא ביצה באמצעות משואות מולקולריות, מיקרוסקופיה דיסק מסתובב, וניתוח קוד פתוח תוכנה.

חזותי ומעקב אחר mRNAs בשידור חי דרוזוסופילה מלאנוגסטר צ'יימברס

Fluorescence-based imaging techniques, in combination with developments in light microscopy, have revolutionized how cell biologists conduct live cell ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה RNA על המנגנון והתפקוד של לוקליזציה RNA מקוטב. היתרון העיקרי של טכניקה זו היא שהיא מאפשרת הדמיה בזמן אמת של סחר RNA אנדוגני ברקמות חיות. ההשלכות של טכניקה זו להרחיב לכיוון הטיפול במחלות הקשורות RNA כי יש לו פוטנציאל לחשוף מטרות טיפוליות חדשות.למרות שיטה זו יכולה לספק תובנה לתהליכי RNA בתא הביצה זבוב פירות, זה יכול להיות מיושם גם על מערכות אחרות כגון זברה או תאי תרבות. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו ייאבקו בגלל האתגרים הקשורים לעיצוב ומסירה של אביזרי משואה מולקולרית. עבור microinjection משואה מולקולרית, בחר את המטרה שמן 40X ולהוות כיסוי עם תא ביצה ניתוח על שלב המיקרוסקופ.אתר תא ביצים בשלב ההתפתחותי הבינוני עד המאוחר המכוון כראוי למיקרו-ג'ינג'י. לאחר מכן להקים microinjector עם ההזרקה המתאימה ולחצים פיצוי. באמצעות ג'ויסטיק מיקרו מניפולטור, בעדינות להוריד מחט טעון עם מיקרוליטר אחד של פתרון משואה מולקולרית לתוך טיפת השמן.הכניסו את הקצה לפוקוס לכיוון הפריפריה של שדה המבט. בצע פונקציה נקייה כדי להסיר את האוויר מן קצה המחט כדי להבטיח כי יש זרימה מן המחט ולהביא את המחט למצב הבית. התמקדו בתא הביצים כדי להיות microinjected ולהביא את המחט בחזרה לפוקוס ליד קצה תא הביצה.בצע התאמה עדין של מיקום z של המטרה, כך הממברנה המפרידה בין תאי הזקיק מן התאים האחות הוא בפוקוס. הכנס את המחט לתא אחות להזרקה של משואות מולקולריות על פני תקופה של שתיים עד חמש שניות. כדי להבטיח הצלחה microinjection לשחזור, להתמקד בזהירות על הממברנה המפרידה בין תאי הזקיק ותאי האחות כי יוזרק תוך הבאת קצה המחט לפוקוס עם מניפולטור מיקרו.כאשר כל המשואות המולקולריות הוזרקו, בעדינות להסיר את המחט ולחזור בו למצב הבית. שנה את המטרה להגדלה הרצויה לרכישת תמונה. לאחר מכן התמקדו בתא הביצים תחת המטרה החדשה והתחלו ברכישת התמונה.לזיהוי ספוט של משואות מולקולריות, לפתוח את התמונות בתמונה J.Use להמיר לכלי ICY כדי להמיר את התמונות בחזרה ל- ICY. סרגל קנה מידה יגולל באופן אוטומטי על המחסנית. ערכו את סרגל קנה המידה דרך חלון המפקח לפי הצורך.לאחר מכן בטלו את הפעלת סמל העין לסמל קנה המידה מתחת לטאב השכבה כדי להסיר את סרגל קנה המידה מהערימה המקורית. בחר איתור ומעקב, זיהוי וגלאי ספוט ואשר את זיהוי קלט הרצף הנוכחי ואפס ערוץ נבחרו עבור פרמטרי הקלט והעינווח המוקדם בהתאמה. לגלאי, בחרו 'זהה נקודה בהירה על רקע כהה' באמצעות שימוש בכוח באורכי גל תלת-מימדיים רק אם אין מספיק פרוסות z בערימות כדי לבצע את הניתוח.בחרו סולמות ורגישות לכל קנה מידה והוסיפו סולמות נוספים לנקודות גדולות יותר ואשרו שאזור העניין מהרצף מוגדר לאזור עניין. לסינון, ודא שלא נקבע סינון ובחר בתבנית הקובץ המתאימה תחת פלט. אם יש להשתמש בתוצאות גלאי הספוט לניתוח מעקב, בחר ייצוא לבריכת שחייה.לניתוח קולוקליזציה, חזור על זיהוי הספוט עבור הערוץ האחר. כדי לעקוב אחר נקודות המשואה המולקולרית, בחר איתור ומעקב, מעקב, מעקב אחר נקודות והפעל את גלאי הספוט באמצעות אותם פרמטרים כמו לגילוי הנקודה. לחץ על הערכת פרמטרים ובחר את תנועת היעד הרצויה בחלון המוקפץ של הערכת הפרמטרים.לאחר מכן לחץ על הפעל מעקב. כדי להמחיש את הרצועות, בחר איתור ומעקב, מעקב ומעקב אחר מנהל. עבור מעבד רצועת צבע, בחר הפוך לזמין ובחר צבע עבור הרצועות.מתוך הוספת מעבד מעקב, בחר עקוב אחר סרטון הזמן של המעבד. בחלון קוצץ הסימון, הזן את מספר הזיהויים שיוצגו לפני ואחרי נקודת הזמן הנוכחית. שמור את פרטי הרצועה כקובץ רצועת XML ולהשתמש בסמל המצלמה כדי להשיג צילום מסך של התוצאות.כדי להקרין את המחסנית לאורך כיוון z, השתמש בסגל החיפוש כדי למצוא את התוסף ובחר הקרנה מרבית מהתפריט הנפתח. בחלון המפקח, בחרו בכרטיסייה, בד הציור והסיבוב של הרצף כדי להתאים את התמונה לכיוון הרצוי ולקבל צילום מסך של התמונה המסובבת. לאחר מכן בחרו אזור עניין, אזור עניין הדו-מימדי, בחרו צורת אזור עניין ובחרו את אזור העניין בתמונה לחיתוך.התקן את תוסף שכבת-על של חותמת הזמן והוסף חותמת זמן בהתאם להוראות בחלון המוקפץ לקבלת הוראות כיצד למקם ולעצב את חותמת הזמן. כדי לשנות או להוסיף את מרווח הזמן, לחץ על ערוך בחלון מאפייני הרצף. הפעילו את סמל העין כדי להוסיף את סרגל קנה המידה מתחת לטאב השכבה בחלון המפקח.לאחר מכן להשיג צילום מסך של התוצאות חותמות זמן ולשמור את התמונה בפורמטים TIFF ו- AVI. באמצעות שיטה זו כפי שהוכח, ניתן לדמיין את דפוסי התחבורה והלוקליזציה של mRNAs אנדוגני באמצעות משואות מולקולריות בשלבים שונים של oogenesis ובמיוחד ב- oogenesis באמצע ואחרי. כאשר מוזרק בנפרד לתוך תאים ביצה באותו שלב, משואות מולקולריות ספציפיות אוסקר שונים להציג את אותו דפוס של לוקליזציה.משואות מולקולריות מוזרק לתוך הציטופלסמה של תא אחות יהיה להתפזר בחופשיות לתוך תאי אחות סמוכים, כמו גם לתוך oocyte. לכן, המשואות מסוגלים להכליל עם המטרות שלהם וליצור אותות פלואורסצנטיים באתרים אחרים מאשר באתר microinjection. בתאי ביצה מהונדסים GFP אוסקר באמצע oogenesis, ניתוח של נתוני הרכישה מראה colocalization נרחב עבור אות פלואורסצנטיות של GFP מהונדסים גנטית מתויג mRNA אוסקר עם אות פלואורסצנטיות זוהה באמצעות משואות מולקולריות.יתר על כן, ערימות 5D ניתן לנתח עוד יותר כדי לקבוע מסלולי mRNA אוסקר עבור הובלה למרחקים ארוכים הן תא אחות ציטופלסמה oocyte. לאחר התפתחותה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה של RNA לחקור הובלת mRNA אימהית אנדוגנית ולוקליזציה בתא הביצים Drosophila.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Cell Biology

Biology

Unit 1

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Control of Gene Expression

SCIENTISTS IN ACTION

Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

Dissection של מערכת העצבים המרכזית הזחל ב תסיסנית melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

וידאו ברזולוציה גבוהה של מעקב אחר תנועה של מבוגרים תסיסנית melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes

Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes

לדמיין את חיים תסיסנית גליה-neuromuscular צומת עם צבעי ניאון

Our project identified GFP labeled glial structures at the developing larval fly neuromuscular synapse. To look at development of live glial-nerve-muscle ...

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

לדמיין את הלב הפועם תסיסנית</em

The Drosophila heart has recently emerged as a good model system for examining the genetic, cellular, and molecular mechanisms underlying function in ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

הדמיה חיה של תסיסנית melanogaster Hemocyte נדידות עובריים

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

בידוד תסיסנית melanogaster האשכים

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

הכנת הפרט תסיסנית ביצה צ&#39;יימברס הדמיה חיים

Live cell imaging is an important technique applied to a number of Drosophila tissues used as models to investigate topics such as axis specification, ...

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

מדידה של תוחלת חיים ב<em&gt; דרוזופילה melanogaster</em

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

חי הדמיה של חיסול תאים אפופטוטיים במהלך<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עובר

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

תחזוקה של<em&gt; תסיסנית</em&gt; אוכלוסיית קייג

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life ...