Name: visualizing and tracking endogenous mrnas in live drosophila melanogaster egg chambers
Uploaded: 2019-06-04T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers at JoVE.com

Ringraziamo Salvatore A.E. Marras (Public Health Research Institute Center, Rutgers University) per la sintesi, l'etichettatura e la purificazione dei fari molecolari, e Daniel St Johnston (The Gurdon Institute, Università di Cambridge) per l'oskar-MS2/ Stock di mosca transgenico MCP-GFP. Questo lavoro è stato sostenuto da un National Science Foundation CAREER Award 1149738 e da un Professional Staff Congress-CUNY Award al DPB.

1. Progettazione di MB per Live Cell Imaging
<ol><li>
Piegare la sequenza di RNA bersaglio per prevedere la struttura secondaria del bersaglio mRNA utilizzando la "forma RNA" dal server mfold (http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/RNA-Folding-Form).
	<ol>
<li>Incollare/caricare la sequenza di destinazione in formato FASTA, selezionare 5 o 10% di sub-optimality (strutture con un'energia libera di ripiegamento entro il 5 o 10% del valore MFE, rispettivamente) e regolare il numero massimo di pie...

<ol>
	<li>Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+RNA+distribution+and+dynamics+in+living+cells.">Imaging intracellular RNA distribution and dynamics in living cells.</a> Nature Methods. 6 (5), 331-338 (2009).</li><li>Bao, G., Rhee, W. J., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+probes+for+live-cell+RNA+detection.">Fluorescent probes for live-cell RNA detection.</a> Annual Reviews of Biomedical Engineering. 11, 25-47 (2009).</li><li>Mannack, L. V., Eising, S., Rentmeister, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+techniques+for+visualizing+RNA+in+cells.">Current techniques for visualizing RNA in cells.</a> F1000Research. 5, (2016).</li><li>Larson, D. R., Zenklusen, D., Wu, B., Chao, J. A., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+observation+of+transcription+initiation+and+elongation+on+an+endogenous+yeast+gene.">Real-time observation of transcription initiation and elongation on an endogenous yeast gene.</a> Science. 332 (6028), 475-478 (2011).</li><li>Bertrand, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+ASH1+mRNA+particles+in+living+yeast.">Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast.</a> Molecular Cell. 2 (4), 437-445 (1998).</li><li>Garcia, J. F., Parker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MS2+coat+proteins+bound+to+yeast+mRNAs+block+5'+to+3'+degradation+and+trap+mRNA+decay+products:+implications+for+the+localization+of+mRNAs+by+MS2-MCP+system.">MS2 coat proteins bound to yeast mRNAs block 5' to 3' degradation and trap mRNA decay products: implications for the localization of mRNAs by MS2-MCP system.</a> RNA. 21 (8), 1393-1395 (2015).</li><li>Bratu, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+beacons:+Fluorescent+probes+for+detection+of+endogenous+mRNAs+in+living+cells.">Molecular beacons: Fluorescent probes for detection of endogenous mRNAs in living cells.</a> Methods in Molecular Biology. 319, 1-14 (2006).</li><li>Bratu, D. P., Cha, B. J., Mhlanga, M. M., Kramer, F. R., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+the+distribution+and+transport+of+mRNAs+in+living+cells.">Visualizing the distribution and transport of mRNAs in living cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 100 (23), 13308-13313 (2003).</li><li>Tyagi, S., Kramer, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+beacons:+probes+that+fluoresce+upon+hybridization.">Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization.</a> Nature Biotechnology. 14 (3), 303-308 (1996).</li><li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+beacon-based+approach+for+live-cell+imaging+of+RNA+transcripts+with+minimal+target+engineering+at+the+single-molecule+level.">A molecular beacon-based approach for live-cell imaging of RNA transcripts with minimal target engineering at the single-molecule level.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1550 (2017).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+detection+of+microRNAs+by+combining+molecular+beacon+probes+with+T7+exonuclease-assisted+cyclic+amplification+reaction.">Multiplex detection of microRNAs by combining molecular beacon probes with T7 exonuclease-assisted cyclic amplification reaction.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (1), 107-114 (2017).</li><li>Baker, M. B., Bao, G., Searles, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+quantification+of+specific+microRNA+using+molecular+beacons.">In vitro quantification of specific microRNA using molecular beacons.</a> Nucleic Acids Research. 40 (2), e13 (2012).</li><li>Ko, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+color-tunable+molecular+beacon+to+sense+miRNA-9+expression+during+neurogenesis.">A color-tunable molecular beacon to sense miRNA-9 expression during neurogenesis.</a> Scientific Reports. 4, 4626 (2014).</li><li>Vet, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+detection+of+four+pathogenic+retroviruses+using+molecular+beacons.">Multiplex detection of four pathogenic retroviruses using molecular beacons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 96 (11), 6394-6399 (1999).</li><li>Li, J., Cao, Z. C., Tang, Z., Wang, K., Tan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+beacons+for+protein-DNA+interaction+studies.">Molecular beacons for protein-DNA interaction studies.</a> Methods in Molecular Biology. 429, 209-224 (2008).</li><li>Li, W. M., Chan, C. M., Miller, A. L., Lee, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+Functional+Roles+of+Molecular+Beacon+as+a+MicroRNA+Detector+and+Inhibitor.">Dual Functional Roles of Molecular Beacon as a MicroRNA Detector and Inhibitor.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (9), 3568-3580 (2017).</li><li>Kuang, T., Chang, L., Peng, X., Hu, X., Gallego-Perez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Beacon+Nano-Sensors+for+Probing+Living+Cancer+Cells.">Molecular Beacon Nano-Sensors for Probing Living Cancer Cells.</a> Trends in Biotechnology. 35 (4), 347-359 (2017).</li><li>Ban, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-genetic+Purification+of+Ventricular+Cardiomyocytes+from+Differentiating+Embryonic+Stem+Cells+through+Molecular+Beacons+Targeting+IRX-4.">Non-genetic Purification of Ventricular Cardiomyocytes from Differentiating Embryonic Stem Cells through Molecular Beacons Targeting IRX-4.</a> Stem Cell Reports. 5 (6), 1239-1249 (2015).</li><li>Hadjinicolaou, A. V., Demetriou, V. L., Emmanuel, M. A., Kakoyiannis, C. K., Kostrikis, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+beacon-based+real-time+PCR+detection+of+primary+isolates+of+Salmonella+Typhimurium+and+Salmonella+Enteritidis+in+environmental+and+clinical+samples.">Molecular beacon-based real-time PCR detection of primary isolates of Salmonella Typhimurium and Salmonella Enteritidis in environmental and clinical samples.</a> BMC Microbiology. 9, 97 (2009).</li><li>McLaughlin, J. M., Bratu, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+melanogaster+Oogenesis:+An+Overview.">Drosophila melanogaster Oogenesis: An Overview.</a> Methods in Molecular Biology. 1328, 1-20 (2015).</li><li>Bastock, R., St Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+oogenesis.">Drosophila oogenesis.</a> Current Biology. 18 (23), R1082-R1087 (2008).</li><li>Rongo, C., Gavis, E. R., Lehmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+oskar+RNA+regulates+oskar+translation+and+requires+Oskar+protein.">Localization of oskar RNA regulates oskar translation and requires Oskar protein.</a> Development. 121 (9), 2737-2746 (1995).</li><li>Mhlanga, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+colocalisation+of+oskar+mRNA+and+trans-acting+proteins+revealed+by+quantitative+imaging+of+the+Drosophila+oocyte.">In vivo colocalisation of oskar mRNA and trans-acting proteins revealed by quantitative imaging of the Drosophila oocyte.</a> PLoS One. 4 (7), e6241 (2009).</li><li>Bayer, L. V., Omar, O. S., Bratu, D. P., Catrina, I. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PinMol:+Python+application+for+designing+molecular+beacons+for+live+cell+imaging+of+endogenous+mRNAs.">PinMol: Python application for designing molecular beacons for live cell imaging of endogenous mRNAs.</a> bioRxiv. , (2018).</li><li>Marras, S. A., Kramer, F. R., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiencies+of+fluorescence+resonance+energy+transfer+and+contact-mediated+quenching+in+oligonucleotide+probes.">Efficiencies of fluorescence resonance energy transfer and contact-mediated quenching in oligonucleotide probes.</a> Nucleic Acids Research. 30 (21), e122 (2002).</li><li>Bratu, D. P., Catrina, I. E., Marras, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tiny+molecular+beacons+for+in+vivo+mRNA+detection.">Tiny molecular beacons for in vivo mRNA detection.</a> Methods in Molecular Biology. 714, 141-157 (2011).</li><li>Dean, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+(pulling)+of+needles+for+gene+delivery+by+microinjection.">Preparation (pulling) of needles for gene delivery by microinjection.</a> Cold Spring Harbor. 2006 (7), (2006).</li><li>Alami, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+transport+of+TDP-43+mRNA+granules+is+impaired+by+ALS-causing+mutations.">Axonal transport of TDP-43 mRNA granules is impaired by ALS-causing mutations.</a> Neuron. 81 (3), 536-543 (2014).</li><li>Jackson, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+Hairpin+DNA-Functionalized+Gold+Nanoparticles+for+Imaging+mRNA+in+Living+Cells.">Applications of Hairpin DNA-Functionalized Gold Nanoparticles for Imaging mRNA in Living Cells.</a> Methods in Enzymology. 572, 87-103 (2016).</li><li>Zimyanin, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+oskar+mRNA+transport+reveals+the+mechanism+of+posterior+localization.">In vivo imaging of oskar mRNA transport reveals the mechanism of posterior localization.</a> Cell. 134 (5), 843-853 (2008).</li><li>Catrina, I. E., Marras, S. A., Bratu, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tiny+molecular+beacons:+LNA/2'-O-methyl+RNA+chimeric+probes+for+imaging+dynamic+mRNA+processes+in+living+cells.">Tiny molecular beacons: LNA/2'-O-methyl RNA chimeric probes for imaging dynamic mRNA processes in living cells.</a> ACS Chemical Biology. 7 (9), 1586-1595 (2012).</li><li>Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+cytosolic+delivery+of+molecular+beacon+conjugates+and+flow+cytometric+analysis+of+target+RNA.">Efficient cytosolic delivery of molecular beacon conjugates and flow cytometric analysis of target RNA.</a> Nucleic Acids Research. 36 (12), e69 (2008).</li><li>Nitin, N., Santangelo, P. J., Kim, G., Nie, S., Bao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide-linked+molecular+beacons+for+efficient+delivery+and+rapid+mRNA+detection+in+living+cells.">Peptide-linked molecular beacons for efficient delivery and rapid mRNA detection in living cells.</a> Nucleic Acids Research. 32 (6), e58 (2004).</li><li>Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avoiding+false-positive+signals+with+nuclease-vulnerable+molecular+beacons+in+single+living+cells.">Avoiding false-positive signals with nuclease-vulnerable molecular beacons in single living cells.</a> Nucleic Acids Research. 35 (16), e105 (2007).</li><li>Bevilacqua, P. C., Ritchey, L. E., Su, Z., Assmann, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+Analysis+of+RNA+Secondary+Structure.">Genome-Wide Analysis of RNA Secondary Structure.</a> Annual Review of Genetics. 50, 235-266 (2016).</li><li>Mhlanga, M. M., Vargas, D. Y., Fung, C. W., Kramer, F. R., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=tRNA-linked+molecular+beacons+for+imaging+mRNAs+in+the+cytoplasm+of+living+cells.">tRNA-linked molecular beacons for imaging mRNAs in the cytoplasm of living cells.</a> Nucleic Acids Research. 33 (6), 1902-1912 (2005).</li><li>Eliceiri, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+imaging+software+tools.">Biological imaging software tools.</a> Nature Methods. 9 (7), 697-710 (2012).</li><li>Bolte, S., Cordelieres, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guided+tour+into+subcellular+colocalization+analysis+in+light+microscopy.">A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy.</a> Journal of Microscopy. 224 (Pt 3), 213-232 (2006).</li><li>Trcek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+germ+granules+are+structured+and+contain+homotypic+mRNA+clusters.">Drosophila germ granules are structured and contain homotypic mRNA clusters.</a> Nature Commununications. 6, 7962 (2015).</li></ol>

La visualizzazione dal vivo del traffico endogeno di mRNA nelle camere delle uova della Drosophila si basa sull'uso di MB specifici, efficienti e resistenti alla nucasiera, che ora possono essere facilmente progettati con il software PinMol. Gli MB sono sonde specifiche progettate per rilevare sequenze univoche all'interno di un mRNA bersaglio (preferibilmente regioni prive di struttura secondaria), rendendo possibile il rilevamento altamente risolto di una trascrizione. L'unica limitazione quando si ad...

Gli studi di biologia cellulare che visualizzano eventi dinamici con risoluzione spaziale e temporale sono stati resi possibili dallo sviluppo di tecniche di imaging delle cellule vive basate sulla fluorescenza. Attualmente, la visualizzazione mRNA in vivo si ottiene tramite tecnologie che si basano su interazioni RNA aptamer-proteina, fluorescenza indotta dall'RNA di coloranti organici e sonda dell'acido nucleico annealing1,2, 3. Tutti offrono un'elevata specificità, sensibilità e rapporto segnale-sfondo. Tuttavia, gli approcci centrati sull'RNA aptamer richiedono un'ampia manipolazione genetica, in cui un transgene è progettato per esprimere un RNA con motivi strutturali artificiali necessari per il legame di proteine o coloranti organici. Ad esempio, il sistema MS2/MCP richiede la co-espressione di un transgene che esprime un costrutto di RNA contenente più ripetizioni tandem della sequenza di legame per la proteina del pelo di batterifafo maMS2 (MCP) e un altro transgene che codifica una proteina fluorescente fusa in MCP4,5. L'aggiunta di tali motivi strutturali secondari all'RNA, insieme a una ingombrante proteina fluorescente, ha sollevato preoccupazioni sul fatto che i processi dell'RNA nativo possano essere influenzati6. Una tecnologia che affronta questa preoccupazione e offre ulteriori vantaggi unici è l'approccio basato sull'acido nucleico, i fari molecolari (MB). Gli MB consentono il rilevamento multiplex di mRNA endogeni, la discriminazione delle variazioni dei singoli nucleotidi e la cinetica veloce dell'ibridazione con mRNA bersaglio7,8. Gli MB sono sonde oligonucleotidi che rimangono in una prua spenta prima di subire un cambiamento conformazionale fluorogenico una volta ibridati ai loro obiettivi (Figura 1C)9. Diversi gruppi hanno avuto successo nell'utilizzo di MB per rilevare sia RNA non codificanti (microRNA e lncRNA)10,11,12,13, retrovirus RNA14 e DNA-protein dinamico interazioni15. Sono stati impiegati con successo per l'imaging in vari organismi e tessuti, come gli embrioni di pesce zebra16, i neuroni13, il tessuto tumorale17, differenziando i cardiomiociti18e la Salmonella 19.
Qui descriviamo l'approccio di progettazione, consegna e rilevamento per mRNA endogeni nelle camere d'uovo D. melanogaster viventi accoppiate con un set-up di microscopia che è abbastanza veloce per catturare la gamma dinamica del trasporto molecolare attivo. La camera d. melanogaster è servita come un sistema modello multicellulare ideale per una vasta gamma di studi sullo sviluppo, dalla divisione precoce delle cellule staminali germinali e l'espressione genica materna alla generazione del piano settoriale segmentale20, 21. Le camere delle uova sono facilmente isolate, grandi e traslucide e sono in grado di sopportare ore di analisi ex vivo, rendendole altamente suscettibili agli esperimenti di imaging. Molto lavoro si è concentrato sulla localizzazione asimmetrica delle trascrizioni materne in regioni subcellulari discrete prima di essere tradotte attivamente. In particolare, la localizzazione dell'oskar mRNA e la sua successiva traduzione al polo posteriore degli ovociti devono avvenire in modo strettamente regolamentato per evitare un fenotipo22di embrione biacaudale letale. oskar mRNA è trascritto nelle 15 cellule germinali, chiamate cellule infermiere, e trasportato attivamente attraverso ponti citoplasmici, chiamati ponti ad anello, nell'ovocita, la cellula germinale che diventa l'uovo maturo e viene infine fecondata (Figura 1A ). La notevole quantità di informazioni già disponibili per quanto riguarda il reclutamento dinamico e lo scambio di fattori proteici da e verso oskar mRNP, insieme ai suoi viaggi intracellulari a lungo raggio, rendono oskar un candidato preferito per studiare i numerosi processi del ciclo di vita dell'mRNA. Gli MB sono stati fondamentali per rivelare dettagli sul processo di localizzazione dell'mRNA e decifrare la regolazione e la funzione dei fattori proteici che controllano il trasporto dell'mRNA durante l'oogenesi della Drosophila. In particolare, microiniettando MB nelle cellule dell'infermiera ed eseguendo esperimenti di imaging in cellule vive, è possibile il monitoraggio degli mRNA endogeni8,23.
La tabella di marcia qui presentata offre le fasi di un processo completo, dall'esecuzione di un esperimento di imaging a cellule vive con manzi, acquisizione di dati di imaging, all'esecuzione di analisi dei dati per monitorare l'mRNA endogeno nel suo ambiente cellulare nativo. I passaggi possono essere modificati e ulteriormente ottimizzati per soddisfare le esigenze dei ricercatori che lavorano con altri tessuti / tipi di cellule all'interno del proprio ambiente di laboratorio.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Spectrofluorometer</td>
			<td>Fluoromax-4 Horiba-Jobin Yvon</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Photon counting spectrofluorometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz cuvette</td>
			<td>Fireflysci (former Precision Cells Inc.)</td>
			<td>701MFL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 tweezer</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501985</td>
			<td>Thin tweezers are very important to separate out the individual egg chambers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 700</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slip No.1 22 x 40mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Leica MZ6 Leica Microsystems Inc.</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 fruit fly anesthesia pad</td>
			<td>Genesee Scienific</td>
			<td>59-114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCL pH7.5</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1185-53-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning disc confocal microscope</td>
			<td>Leica DMI-4000B inverted microscope equipped with Yokogawa CSU 10 spinning disc Leica Microsystems Inc.</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamamatsu C9100-13 ImagEM EMCCD camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PatchMan NP 2 Micromanipulator</td>
			<td>Eppendorf Inc.</td>
			<td>920000037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FemtoJet Microinjector</td>
			<td>Eppendorf Inc.</td>
			<td>920010504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection needle: Femtotips II</td>
			<td>Eppendorf Inc.</td>
			<td>930000043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading tip: 20ul Microloader</td>
			<td>Eppendorf Inc.</td>
			<td>930001007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Cover glasses no. 1 or 1.5, 22x40mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-026; 48393-172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry yeast</td>
			<td>Any grocery store</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer, &#62; 20 GB RAM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Although processing can be carried out on most computers, higher capabilities will increase the speed of the processing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing and tracking endogenous mrnas in live drosophila melanogaster egg chambers

Le tecniche di imaging basate sulla fluorescenza, in combinazione con gli sviluppi della microscopia luminosa, hanno rivoluzionato il modo in cui i biologi cellulari conducono studi di imaging a cellule vive. I metodi per rilevare gli RNA si sono notevolmente espansi a partire dagli studi seminali collegati alla localizzazione dell'mRNA specifico del sito alla regolazione dell'espressione genica. I processi dinamici dell'mRNA possono ora essere visualizzati tramite approcci che rilevano gli mRNA, associati a set-up di microscopia abbastanza veloci da catturare la gamma dinamica del comportamento molecolare. La tecnologia dei fari molecolari è un approccio basato sull'ibridazione in grado di rilevare direttamente le trascrizioni endogene nelle cellule viventi. I fari molecolari sono sonde di acido nucleico a forma di tornante, accoltellato internamente, mononucleotide, che fluoresce solo dall'ibridazione in una sequenza bersaglio unica. Quando accoppiati con la microscopia a fluorescenza avanzata e l'imaging ad alta risoluzione, consentono di eseguire il monitoraggio spaziale e temporale del movimento intracellulare degli mRNA. Anche se questa tecnologia è l'unico metodo in grado di rilevare le trascrizioni endogene, i biologi cellulari non hanno ancora pienamente abbracciato questa tecnologia a causa delle difficoltà nella progettazione di tali sonde per l'imaging delle cellule vive. Una nuova applicazione software, PinMol, consente una progettazione avanzata e rapida delle sonde più adatte per ibridarsi in modo efficiente alle regioni bersaglio mRNA all'interno di una cellula vivente. Inoltre, l'acquisizione di immagini ad alta risoluzione e in tempo reale e l'attuale software di analisi delle immagini open source consentono un output di dati raffinato, portando a una valutazione più fine della complessità alla base dei processi dinamici coinvolti nel ciclo di vita del mRNA.
Qui presentiamo un protocollo completo per la progettazione e la consegna di fari molecolari nelle camere d'uovo della Drosophila melanogaster. Il rilevamento e la visualizzazione diretta e altamente specifica di mRNA materni endogeni avviene tramite la microscopia confocale del disco rotante. I dati di imaging vengono elaborati e analizzati utilizzando il rilevamento e il rilevamento degli oggetti nel software Icy per ottenere dettagli sul movimento dinamico degli mRNA, che vengono trasportati e localizzati in regioni specializzate all'interno dell'oocito.

Utilizzando PinMol, diversi MB possono essere progettati per un bersaglio mRNA (Figura 1B-C). Dopo la sintesi e la purificazione, i MB selezionati vengono caratterizzati e confrontati mediante l'analisi in vitro.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58545/58545fig1.jpg"> Figura 1: Tecnica e descrizione dei tessuti per l'imaging di cellule vi...

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Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Qui, presentiamo un protocollo per la visualizzazione, il rilevamento, l'analisi e il monitoraggio del traffico di mRNA endogeno nel vivo Drosophila melanogaster camera d'uovo utilizzando fari molecolari, microscopia confocale del disco rotante, e analisi open-source software.

Visualizzazione e monitoraggio di mRNA endogeni nelle camere uovo di Drosophila melanogaster dal vivo

Fluorescence-based imaging techniques, in combination with developments in light microscopy, have revolutionized how cell biologists conduct live cell ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia dell'RNA sul meccanismo e la funzione della localizzazione dell'RNA polarizzato. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente la visualizzazione in tempo reale del traffico endogeno di RNA nei tessuti vivi. Le implicazioni di questa tecnica si estendono verso la terapia delle malattie correlate all'RNA perché ha il potenziale per scoprire nuovi obiettivi terapeutici.Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sui processi di RNA nella camera delle uova di mosca della frutta, può anche essere applicato ad altri sistemi come il pesce zebra o le cellule di coltura. In generale, gli individui nuovi a questo metodo avranno difficoltà a causa delle sfide associate alla progettazione e consegna degli oggetti di scena faro molecolare. Per la microiniezione a faro molecolare, selezionare l'obiettivo dell'olio 40X e montare una coverlip con la camera dell'uovo sezionata sullo stadio del microscopio.Individuare una camera d'uovo nella fase di sviluppo medio-tardiva che sia correttamente orientata per la microiniezione. Quindi impostare un microiniettore con le pressioni di iniezione e compensazione appropriate. Utilizzando il joystick del micro manipolatore, abbassare delicatamente un ago caricato con un microlitro di soluzione di faro molecolare nella goccia d'olio.Mettere a fuoco la punta verso la periferia del campo visivo. Eseguire una funzione pulita per rimuovere l'aria dalla punta dell'ago e per assicurarsi che ci sia flusso dall'ago e portare l'ago nella posizione di casa. Concentrati sulla camera delle uova da microiniettare e riporta l'ago a fuoco vicino al bordo della camera delle uova.Eseguire una regolazione fine della posizione z dell'obiettivo in modo che la membrana che separa le cellule follicolari dalle cellule dell'infermiere sia a fuoco. Inserire l'ago in una cella di infermiere per l'iniezione dei fari molecolari per un periodo di due o cinque secondi. Per garantire il successo della microiniezione riproducibile, concentrarsi attentamente sulla membrana che separa le cellule follicolari e le cellule infermiere che verranno iniettate mentre si porta a fuoco la punta dell'ago con il micro manipolatore.Quando tutti i fari molecolari sono stati iniettati, rimuovere delicatamente l'ago e ritrarlo nella posizione di casa. Modificare l'obiettivo con l'ingrandimento desiderato per l'acquisizione dell'immagine. Quindi concentrati sulla camera delle uova sotto il nuovo obiettivo e inizia l'acquisizione dell'immagine.Per il rilevamento spot dei fari molecolari, aprire le immagini in Image J.Utilizzare lo strumento converti in ICY per convertire le immagini in ICY. Una barra di scala verrà automaticamente sovrapposta allo stack. Modificare la barra di scala tramite la finestra di ispezione in base alle esigenze.Quindi disattivare l'icona dell'occhio per la barra di scala sotto la linguetta del livello per rimuovere la barra di ridimensionamento dalla pila originale. Selezionare il rilevamento e il rilevamento, il rilevamento e il rilevatore di punti e confermare il rilevamento dell'input della sequenza corrente e lo zero del canale sono selezionati rispettivamente per i parametri di input e pre-elaborazione. Per il rilevatore, selezionare rileva punto luminoso su sfondo scuro utilizzando l'uso della forza delle lunghezze d'onda 2D per il 3D solo se non ci sono abbastanza z-slice nelle pile per eseguire l'analisi.Selezionare le scale e la sensibilità per ogni scala aggiungendo più scale per punti più grandi e verificare che l'area di interesse dalla sequenza sia impostata per l'area di interesse. Per il filtro, verificare che non sia stato impostato alcun filtro e selezionare il formato di file appropriato in output. Se i risultati del rilevatore spot devono essere utilizzati per l'analisi di tracciamento, selezionare esporta in piscina.Per l'analisi della colocalizzazione, ripetere il rilevamento spot per l'altro canale. Per tenere traccia delle macchie del faro molecolare, selezionare il rilevamento e il tracciamento, il tracciamento, il tracciamento spot ed eseguire il rilevatore di punti utilizzando gli stessi parametri del rilevamento dei punti. Fate clic su stima parametri (Estimate parameters) e selezionate il movimento di destinazione desiderato nella finestra popup di stima dei parametri.Quindi fare clic su Esegui rilevamento. Per visualizzare le tracce, selezionare rilevamento e tracciamento, tracciamento e gestione tracce. Per il processore di traccia a colori, selezionare Abilita e selezionare un colore per le tracce.In Aggiungi processore di traccia selezionare traccia del clip di tempo del processore. Nella finestra del clipper di controllo immettere il numero di rilevamenti da mostrarsi prima e dopo il punto di tempo corrente. Salvare le informazioni sulla traccia come file di traccia XML e utilizzare l'icona della fotocamera per ottenere uno screenshot dei risultati.Per proiettare lo stack lungo la direzione z, usate la barra di ricerca per trovare il plug-in e selezionate la proiezione massima dal menu a discesa. Nella finestra della finestra di ispezione selezionare la scheda sequenza, l'area di disegno e la rotazione per regolare l'immagine in base all'orientamento desiderato e ottenere uno screenshot dell'immagine ruotata. Quindi selezionare l'area di interesse, l'area di interesse 2D, scegliere la forma area di interesse e selezionare l'area di interesse nell'immagine per il ritaglio.Installare il plug-in di sovrapposizione timestamp e aggiungere un timestamp seguendo le istruzioni nella finestra popup per istruzioni su come posizionare e formattare il timestamp. Per modificare o aggiungere l'intervallo di tempo, fare clic su Modifica nella finestra delle proprietà della sequenza. Attivare l'icona dell'occhio per aggiungere di nuovo la barra di scala sotto la linguetta del livello nella finestra dell'ispettore.Quindi ottenere uno screenshot dei risultati timestamp e salvare l'immagine sia in formati TIFF che AVI. Utilizzando questo metodo come dimostrato, è possibile visualizzare i modelli di trasporto e localizzazione degli mRNA endogeni attraverso fari molecolari in varie fasi dell'oogenesi e in particolare a e dopo l'oogenesi media. Quando vengono iniettati individualmente nelle stesse camere di uova dello stadio, diversi fari molecolari specifici di Oskar presentano lo stesso modello di localizzazione.I fari molecolari iniettati nel citoplasma di una cellula infermiera si diffonderanno liberamente nelle cellule infermiere adiacenti e nell'ovociti. Così, i fari sono in grado di ibridarsi con i loro bersagli e generare segnali di fluorescenza in altri siti rispetto al sito di microiniezione. Nelle camere di uova transgeniche oskar GFP a metà oogenesi, l'analisi dei dati di acquisizione mostra un'ampia colocalizzazione per il segnale di fluorescenza dell'oskar mRNA taggato GFP geneticamente modificato con il segnale di fluorescenza rilevato utilizzando fari molecolari.Inoltre, le pile 5D possono essere ulteriormente analizzate per determinare le traiettorie dell'mRNA oskar per il trasporto a lunga distanza sia nella cellula infermiera che nel citoplasma degli ovocite. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nel campo della biologia dell'RNA per esplorare il trasporto e la localizzazione dell'mRNA materno endogeno nella camera delle uova di Drosophila.

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Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

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