Name: visualizing and tracking endogenous mrnas in live drosophila melanogaster egg chambers
Uploaded: 2019-06-04T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers at JoVE.com

サルヴァトーレA.E.マラス(ラトガース大学公衆衛生研究所センター)が分子ビーコンの合成、標識、精製を行い、ダニエル・セント・ジョンストン(ケンブリッジ大学ガードン研究所)がオスカー-MS2/ MCP-GFPトランスジェニックフライストック。この作品は、国立科学財団キャリア賞1149738とDPBに専門スタッフ会議-CUNY賞によってサポートされました。

1. 生細胞イメージング用MBの設計
<ol><li>
ターゲットRNA配列を折りたたみ、mfoldサーバからの「RNA形態」を用いてmRNAターゲットの二次構造を予測する(http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/RNA-Folding-Form)。
	<ol>
<li>FASTA形式でターゲットシーケンスを貼り付け/アップロードし、5%または10%のサブ最適性(MFE値の5%または10%以内の自由エネルギーを持つ構造)を選択し、それに応じて計算さ?...

<ol>
	<li>Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+RNA+distribution+and+dynamics+in+living+cells.">Imaging intracellular RNA distribution and dynamics in living cells.</a> Nature Methods. 6 (5), 331-338 (2009).</li><li>Bao, G., Rhee, W. J., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+probes+for+live-cell+RNA+detection.">Fluorescent probes for live-cell RNA detection.</a> Annual Reviews of Biomedical Engineering. 11, 25-47 (2009).</li><li>Mannack, L. V., Eising, S., Rentmeister, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+techniques+for+visualizing+RNA+in+cells.">Current techniques for visualizing RNA in cells.</a> F1000Research. 5, (2016).</li><li>Larson, D. R., Zenklusen, D., Wu, B., Chao, J. A., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+observation+of+transcription+initiation+and+elongation+on+an+endogenous+yeast+gene.">Real-time observation of transcription initiation and elongation on an endogenous yeast gene.</a> Science. 332 (6028), 475-478 (2011).</li><li>Bertrand, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+ASH1+mRNA+particles+in+living+yeast.">Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast.</a> Molecular Cell. 2 (4), 437-445 (1998).</li><li>Garcia, J. F., Parker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MS2+coat+proteins+bound+to+yeast+mRNAs+block+5'+to+3'+degradation+and+trap+mRNA+decay+products:+implications+for+the+localization+of+mRNAs+by+MS2-MCP+system.">MS2 coat proteins bound to yeast mRNAs block 5' to 3' degradation and trap mRNA decay products: implications for the localization of mRNAs by MS2-MCP system.</a> RNA. 21 (8), 1393-1395 (2015).</li><li>Bratu, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+beacons:+Fluorescent+probes+for+detection+of+endogenous+mRNAs+in+living+cells.">Molecular beacons: Fluorescent probes for detection of endogenous mRNAs in living cells.</a> Methods in Molecular Biology. 319, 1-14 (2006).</li><li>Bratu, D. P., Cha, B. J., Mhlanga, M. M., Kramer, F. R., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+the+distribution+and+transport+of+mRNAs+in+living+cells.">Visualizing the distribution and transport of mRNAs in living cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 100 (23), 13308-13313 (2003).</li><li>Tyagi, S., Kramer, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+beacons:+probes+that+fluoresce+upon+hybridization.">Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization.</a> Nature Biotechnology. 14 (3), 303-308 (1996).</li><li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+beacon-based+approach+for+live-cell+imaging+of+RNA+transcripts+with+minimal+target+engineering+at+the+single-molecule+level.">A molecular beacon-based approach for live-cell imaging of RNA transcripts with minimal target engineering at the single-molecule level.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1550 (2017).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+detection+of+microRNAs+by+combining+molecular+beacon+probes+with+T7+exonuclease-assisted+cyclic+amplification+reaction.">Multiplex detection of microRNAs by combining molecular beacon probes with T7 exonuclease-assisted cyclic amplification reaction.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (1), 107-114 (2017).</li><li>Baker, M. B., Bao, G., Searles, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+quantification+of+specific+microRNA+using+molecular+beacons.">In vitro quantification of specific microRNA using molecular beacons.</a> Nucleic Acids Research. 40 (2), e13 (2012).</li><li>Ko, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+color-tunable+molecular+beacon+to+sense+miRNA-9+expression+during+neurogenesis.">A color-tunable molecular beacon to sense miRNA-9 expression during neurogenesis.</a> Scientific Reports. 4, 4626 (2014).</li><li>Vet, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+detection+of+four+pathogenic+retroviruses+using+molecular+beacons.">Multiplex detection of four pathogenic retroviruses using molecular beacons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 96 (11), 6394-6399 (1999).</li><li>Li, J., Cao, Z. C., Tang, Z., Wang, K., Tan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+beacons+for+protein-DNA+interaction+studies.">Molecular beacons for protein-DNA interaction studies.</a> Methods in Molecular Biology. 429, 209-224 (2008).</li><li>Li, W. M., Chan, C. M., Miller, A. L., Lee, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+Functional+Roles+of+Molecular+Beacon+as+a+MicroRNA+Detector+and+Inhibitor.">Dual Functional Roles of Molecular Beacon as a MicroRNA Detector and Inhibitor.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (9), 3568-3580 (2017).</li><li>Kuang, T., Chang, L., Peng, X., Hu, X., Gallego-Perez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Beacon+Nano-Sensors+for+Probing+Living+Cancer+Cells.">Molecular Beacon Nano-Sensors for Probing Living Cancer Cells.</a> Trends in Biotechnology. 35 (4), 347-359 (2017).</li><li>Ban, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-genetic+Purification+of+Ventricular+Cardiomyocytes+from+Differentiating+Embryonic+Stem+Cells+through+Molecular+Beacons+Targeting+IRX-4.">Non-genetic Purification of Ventricular Cardiomyocytes from Differentiating Embryonic Stem Cells through Molecular Beacons Targeting IRX-4.</a> Stem Cell Reports. 5 (6), 1239-1249 (2015).</li><li>Hadjinicolaou, A. V., Demetriou, V. L., Emmanuel, M. A., Kakoyiannis, C. K., Kostrikis, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+beacon-based+real-time+PCR+detection+of+primary+isolates+of+Salmonella+Typhimurium+and+Salmonella+Enteritidis+in+environmental+and+clinical+samples.">Molecular beacon-based real-time PCR detection of primary isolates of Salmonella Typhimurium and Salmonella Enteritidis in environmental and clinical samples.</a> BMC Microbiology. 9, 97 (2009).</li><li>McLaughlin, J. M., Bratu, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+melanogaster+Oogenesis:+An+Overview.">Drosophila melanogaster Oogenesis: An Overview.</a> Methods in Molecular Biology. 1328, 1-20 (2015).</li><li>Bastock, R., St Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+oogenesis.">Drosophila oogenesis.</a> Current Biology. 18 (23), R1082-R1087 (2008).</li><li>Rongo, C., Gavis, E. R., Lehmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+oskar+RNA+regulates+oskar+translation+and+requires+Oskar+protein.">Localization of oskar RNA regulates oskar translation and requires Oskar protein.</a> Development. 121 (9), 2737-2746 (1995).</li><li>Mhlanga, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+colocalisation+of+oskar+mRNA+and+trans-acting+proteins+revealed+by+quantitative+imaging+of+the+Drosophila+oocyte.">In vivo colocalisation of oskar mRNA and trans-acting proteins revealed by quantitative imaging of the Drosophila oocyte.</a> PLoS One. 4 (7), e6241 (2009).</li><li>Bayer, L. V., Omar, O. S., Bratu, D. P., Catrina, I. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PinMol:+Python+application+for+designing+molecular+beacons+for+live+cell+imaging+of+endogenous+mRNAs.">PinMol: Python application for designing molecular beacons for live cell imaging of endogenous mRNAs.</a> bioRxiv. , (2018).</li><li>Marras, S. A., Kramer, F. R., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiencies+of+fluorescence+resonance+energy+transfer+and+contact-mediated+quenching+in+oligonucleotide+probes.">Efficiencies of fluorescence resonance energy transfer and contact-mediated quenching in oligonucleotide probes.</a> Nucleic Acids Research. 30 (21), e122 (2002).</li><li>Bratu, D. P., Catrina, I. E., Marras, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tiny+molecular+beacons+for+in+vivo+mRNA+detection.">Tiny molecular beacons for in vivo mRNA detection.</a> Methods in Molecular Biology. 714, 141-157 (2011).</li><li>Dean, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+(pulling)+of+needles+for+gene+delivery+by+microinjection.">Preparation (pulling) of needles for gene delivery by microinjection.</a> Cold Spring Harbor. 2006 (7), (2006).</li><li>Alami, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+transport+of+TDP-43+mRNA+granules+is+impaired+by+ALS-causing+mutations.">Axonal transport of TDP-43 mRNA granules is impaired by ALS-causing mutations.</a> Neuron. 81 (3), 536-543 (2014).</li><li>Jackson, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+Hairpin+DNA-Functionalized+Gold+Nanoparticles+for+Imaging+mRNA+in+Living+Cells.">Applications of Hairpin DNA-Functionalized Gold Nanoparticles for Imaging mRNA in Living Cells.</a> Methods in Enzymology. 572, 87-103 (2016).</li><li>Zimyanin, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+oskar+mRNA+transport+reveals+the+mechanism+of+posterior+localization.">In vivo imaging of oskar mRNA transport reveals the mechanism of posterior localization.</a> Cell. 134 (5), 843-853 (2008).</li><li>Catrina, I. E., Marras, S. A., Bratu, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tiny+molecular+beacons:+LNA/2'-O-methyl+RNA+chimeric+probes+for+imaging+dynamic+mRNA+processes+in+living+cells.">Tiny molecular beacons: LNA/2'-O-methyl RNA chimeric probes for imaging dynamic mRNA processes in living cells.</a> ACS Chemical Biology. 7 (9), 1586-1595 (2012).</li><li>Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+cytosolic+delivery+of+molecular+beacon+conjugates+and+flow+cytometric+analysis+of+target+RNA.">Efficient cytosolic delivery of molecular beacon conjugates and flow cytometric analysis of target RNA.</a> Nucleic Acids Research. 36 (12), e69 (2008).</li><li>Nitin, N., Santangelo, P. J., Kim, G., Nie, S., Bao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide-linked+molecular+beacons+for+efficient+delivery+and+rapid+mRNA+detection+in+living+cells.">Peptide-linked molecular beacons for efficient delivery and rapid mRNA detection in living cells.</a> Nucleic Acids Research. 32 (6), e58 (2004).</li><li>Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avoiding+false-positive+signals+with+nuclease-vulnerable+molecular+beacons+in+single+living+cells.">Avoiding false-positive signals with nuclease-vulnerable molecular beacons in single living cells.</a> Nucleic Acids Research. 35 (16), e105 (2007).</li><li>Bevilacqua, P. C., Ritchey, L. E., Su, Z., Assmann, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+Analysis+of+RNA+Secondary+Structure.">Genome-Wide Analysis of RNA Secondary Structure.</a> Annual Review of Genetics. 50, 235-266 (2016).</li><li>Mhlanga, M. M., Vargas, D. Y., Fung, C. W., Kramer, F. R., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=tRNA-linked+molecular+beacons+for+imaging+mRNAs+in+the+cytoplasm+of+living+cells.">tRNA-linked molecular beacons for imaging mRNAs in the cytoplasm of living cells.</a> Nucleic Acids Research. 33 (6), 1902-1912 (2005).</li><li>Eliceiri, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+imaging+software+tools.">Biological imaging software tools.</a> Nature Methods. 9 (7), 697-710 (2012).</li><li>Bolte, S., Cordelieres, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guided+tour+into+subcellular+colocalization+analysis+in+light+microscopy.">A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy.</a> Journal of Microscopy. 224 (Pt 3), 213-232 (2006).</li><li>Trcek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+germ+granules+are+structured+and+contain+homotypic+mRNA+clusters.">Drosophila germ granules are structured and contain homotypic mRNA clusters.</a> Nature Commununications. 6, 7962 (2015).</li></ol>

ショウジョウバエの卵室における内因性mRNAの密有性のライブ可視化は、PinMolソフトウェアを使用して簡単に設計できる特定の、効率的な、ヌクレアーゼ耐性MBの使用に依存しています。MBは、標的mRNA内の一意の配列(好ましくは二次構造のない領域)を検出するように設計された特定のプローブであり、転写物の高度に解決された検出を可能にする。他の組織/細胞タイプにこの技?...

空間的および時間的分解能で動的事象を可視化する細胞生物学研究は、蛍光ベースのライブ細胞イメージング技術の開発によって可能になった。現在、生体内mRNAビジュアライゼーションは、RNAアプタマータンパク質相互作用、有機色素および核酸プローブのRNAアプタマー誘導蛍光1、2に基づく技術を介して達成される。3.それらはすべて高い特異性、感度および信号対バックグラウンド比を提供する。しかし、RNAアプタマー中心のアプローチは広範な遺伝子操作を必要とし、トランスジーンはタンパク質または有機色素結合に必要な人工構造モチーフを持つRNAを発現するように設計される。例えば、MS2/MCPシステムは、バクテリオファージMS2コートタンパク質(MCP)に対する結合配列の複数のタンデム反復を含むRNA構築物を発現するトランスジーンの同時発現と、蛍光タンパク質をコードする別のトランスジーンを必要とする。MCP 4に融合,5.このような二次構造モチーフをRNAに添加することは、かさばる蛍光タンパク質と共に、天然RNAプロセスが6に影響を与えるかもしれないという懸念を提起している。この懸念に対処し、追加のユニークな利点を提供する技術は、核酸ベースのアプローチ、分子ビーコン(MB)です。MBは、内因性mRNAの多重検出、単一ヌクレオチド変動の判分、および標的mRNA7,8とのハイブリダイゼーションの高速運動学を可能にする。MBは、標的にハイブリダイズした後に蛍動体形成的な立体構造変化を受ける前に、クエンチングヘアピンフォールドに残るオリゴヌクレオチドプローブである(図1C)9。いくつかのグループは、非コードRNA(マイクロRNAおよびlncRNA)10、11、12、13、RNAレトロウイルス14および動的DNAタンパク質の両方を検出するためにMBを使用することに成功しました。インタラクション15.ゼブラフィッシュ胚16、ニューロン13、腫瘍組織17、心筋細胞18、サルモネラ菌など、様々な生物や組織でのイメージングに成功しています。19.
ここでは、生きているD.メラノガスター卵室における内因性mRNAの設計、送達および検出アプローチについて、活性分子輸送の動的範囲を捕捉するのに十分な速さである顕微鏡検査のセットアップと相まって説明する。D.メラノガスター卵室は、初期の生殖細胞分裂や母体遺伝子発現からセグメントボディプラン20の生成まで、幅広い発達研究のための理想的な多細胞モデルシステムとして機能してきました。 21.卵室は、簡単に単離され、大きく半透明であり、外生分析の時間に耐えることができるので、イメージング実験に非常に適しています。多くの研究は、積極的に翻訳される前に離散的な細胞領域への母体転写の非対称的な局在化に焦点を当ててきた。特に、オスカーmRNA局在化およびその後の卵母細胞の後極でのその後の翻訳は、致命的な二頭上胚表現型22を避けるために厳密に規制された方法で起こらなければならない。oskar mRNAは、ナース細胞と呼ばれる15個の生殖細胞に転写され、環管と呼ばれる細胞質の橋を通って積極的に卵母細胞に輸送され、成熟卵となり最終的に受精される生殖細胞(図1A)).オスカーmRNPとの間のタンパク質因子の動的な募集と交換に関して既に入手可能なかなりの量の情報は、その長距離細胞内旅行と共に、オスカーを研究する好ましい候補にするmRNAライフサイクルの多くのプロセス。MBは、mRNA局在化のプロセスに関する詳細を明らかにし、ショウジョウバエの発生時にmRNA輸送を制御するタンパク質因子の調節と機能を解読するのに役立ってきました。特に、看護師細胞にMBをマイクロ注入し、生細胞イメージング実験を行うことにより、内因性mRNAの追跡が可能である8,23。
ここで示すロードマップは、MBを用いてライブ細胞イメージング実験を行うことから、イメージングデータを取得すること、そのネイティブ細胞環境で内因性mRNAを追跡するためのデータ分析を実行することまで、完全なプロセスのステップを提供します。ステップは、独自のラボ設定内で他の組織/細胞タイプを扱う研究者のニーズを満たすために変更し、さらに最適化することができます。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Spectrofluorometer</td>
			<td>Fluoromax-4 Horiba-Jobin Yvon</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Photon counting spectrofluorometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz cuvette</td>
			<td>Fireflysci (former Precision Cells Inc.)</td>
			<td>701MFL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 tweezer</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501985</td>
			<td>Thin tweezers are very important to separate out the individual egg chambers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 700</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slip No.1 22 x 40mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Leica MZ6 Leica Microsystems Inc.</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 fruit fly anesthesia pad</td>
			<td>Genesee Scienific</td>
			<td>59-114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCL pH7.5</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1185-53-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning disc confocal microscope</td>
			<td>Leica DMI-4000B inverted microscope equipped with Yokogawa CSU 10 spinning disc Leica Microsystems Inc.</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamamatsu C9100-13 ImagEM EMCCD camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PatchMan NP 2 Micromanipulator</td>
			<td>Eppendorf Inc.</td>
			<td>920000037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FemtoJet Microinjector</td>
			<td>Eppendorf Inc.</td>
			<td>920010504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection needle: Femtotips II</td>
			<td>Eppendorf Inc.</td>
			<td>930000043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading tip: 20ul Microloader</td>
			<td>Eppendorf Inc.</td>
			<td>930001007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Cover glasses no. 1 or 1.5, 22x40mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-026; 48393-172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry yeast</td>
			<td>Any grocery store</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer, &#62; 20 GB RAM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Although processing can be carried out on most computers, higher capabilities will increase the speed of the processing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing and tracking endogenous mrnas in live drosophila melanogaster egg chambers

蛍光ベースのイメージング技術は、光顕微鏡の開発と組み合わせることで、細胞生物学者が生細胞イメージング研究を行う方法に革命を起こしました。RNAを検出する方法は、セミナル研究が遺伝子発現調節に部位特異的mRNA局在化を結合して以来、大幅に拡大してきました。動的mRNAプロセスは、mRNAを検出するアプローチを介して可視化することができ、分子挙動の動的範囲を捕捉するのに十分な速さである顕微鏡検査のセットアップと組み合わされます。分子ビーコン技術は、生細胞内の内因性転写物を直接検出できるハイブリダイゼーションベースのアプローチです。分子ビーコンは、ヘアピン状、内部的にクエンチされた、単一ヌクレオチド識別核酸プローブであり、これは、ユニークな標的配列へのハイブリダイゼーション時にのみ蛍光する。高度な蛍光顕微鏡と高解像度イメージングと組み合わせることで、mRNAの細胞内移動の空間的および時間的な追跡を行うことが可能になります。この技術は内因性転写物を検出できる唯一の方法ですが、細胞生物学者は、生細胞イメージングのためのそのようなプローブの設計が困難なため、この技術をまだ完全に受け入れていません。新しいソフトウェアアプリケーションPinMolは、生きている細胞内のmRNA標的領域に効率的にハイブリダイズするのに最適なプローブの強化され、迅速な設計を可能にします。さらに、高解像度のリアルタイム画像取得と現在のオープンソース画像解析ソフトウェアにより、洗練されたデータ出力が可能になり、mRNAのライフサイクルに関与する動的プロセスの基礎となる複雑さの詳細な評価が可能になります。
ここでは、ショウジョウバエメラメラノガスター卵室に分子ビーコンを設計し、提供するための包括的なプロトコルを提示します。内因性mRNAの直接的かつ非常に特異的な検出および可視化は、紡糸ディスク共焦点顕微鏡を介して行われる。イメージングデータは、氷のソフトウェアで物体検出とトラッキングを使用して処理および分析され、卵母細胞内の特殊な領域に輸送およびローカライズされるmRNAの動的な動きに関する詳細を取得します。

PinMolを使用して、複数の MB を 1 つの mRNA ターゲットに対して設計できます (図 1B-C)。合成および精製後、選択されたMBはインビトロ分析を用いて特徴付け、比較される。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58545/58545fig1.jpg"> 図1:内因性mRNAの生細胞イメージングのた?...

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Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

ここでは、分子ビーコン、スピニングディスク共焦点顕微鏡、オープンソース分析を用いたライブショウジョウバエメラノガスター卵室における内因性mRNA人身売買の可視化、検出、分析、追跡のためのプロトコルを提示する。ソフトウェア。

ライブショウジョウバエメラノガスター卵室における内因性mRNAの可視化と追跡

Fluorescence-based imaging techniques, in combination with developments in light microscopy, have revolutionized how cell biologists conduct live cell ...

この方法は、二極化RNA局在化のメカニズムと機能に関するRNA生物学分野の主要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、生きた組織における内在性RNAの密売のリアルタイム可視化を可能にすることです。この技術の意味は、新しい治療標的を発見する可能性があるため、RNA関連疾患の治療にまで及ぶ。この方法は、フルーツフライ卵室内のRNAプロセスに関する洞察を提供することができますが、ゼブラフィッシュや培養細胞などの他のシステムにも適用できます。一般的に、この方法に新しい個人は、分子ビーコン小道具の設計と送達に関連する課題のために苦労します。分子ビーコンマイクロインジェクションの場合、40X油の目的を選択し、解剖された卵チャンバーを顕微鏡ステージにカバースリップを取り付けます。マイクロインジェクションに適した中期から後期の発達段階で卵室を見つけます。次に、適切な注入および補償圧力を備えたマイクロインジェクターを設置する。マイクロマニピュレータージョイスティックを使用して、1マイクロリットルの分子ビーコン溶液を装填した針をオイルドロップにそっと下げます。視野の周辺に向かって先端に焦点を合わせます。針先から空気を取り除き、針から流れがあることを確認し、針をホーム位置に持って来るために、きれいな機能を実行します。マイクロ注入される卵室に焦点を当て、卵室の端近くに焦点を戻す針を持って来ます。毛包細胞をナース細胞から分離する膜が焦点となるような目的のz位置の微調整を行う。2~5秒の期間にわたって分子ビーコンを注射するために、針をナースセルに挿入します。再現性のあるマイクロインジェクションの成功を確実にするために、毛包細胞を分離する膜と注射されるナース細胞に注意深く焦点を当て、マイクロマニピュレーターで針の先端を焦点にします。すべての分子ビーコンが注入されたら、針をそっと取り出し、自宅の位置に引き込みます。目的を画像取得の目的の倍率に変更します。次に、新しい目的の下で卵室に焦点を当て、画像の取得を開始します。分子ビーコンのスポット検出のために、イメージJ.ICYへの変換ツールを使用して画像をICYに戻します。スケール バーは、スタック上に自動的にオーバーレイされます。必要に応じて、インスペクターウィンドウを使用してスケールバーを編集します。次に、レイヤータブの下にあるスケールバーの目のアイコンを無効にして、元のスタックからスケールバーを削除します。検出と追跡、検出、スポット検出器を選択し、入力および前処理パラメータに対して現在のシーケンス入力検出とチャネルゼロを確認します。検出器の場合は、解析を実行するのに十分な Z スライスがない場合にのみ、3D の 2D 波長を使用して暗い背景の明るいスポットを検出するを選択します。スケールごとに尺度と感度を選択し、より大きなスポットにスケールを追加し、シーケンスから対象領域が対象領域に設定されていることを確認します。フィルタリングの場合は、フィルタが設定されていないか確認し、出力で適切なファイル形式を選択します。スポット検出結果を追跡解析に使用する場合は、プールへのエクスポートを選択します。共局在解析の場合は、他のチャネルのスポット検出を繰り返します。分子ビーコンスポットを追跡するには、スポット検出と同じパラメータを使用して検出と追跡、追跡、スポット追跡を選択し、スポット検出器を実行します。推定パラメータをクリックし、パラメータ推定ポップアップウィンドウで目的のターゲットモーションを選択します。次に、[追跡の実行] をクリックします。トラックを視覚化するには、検出と追跡、追跡、およびトラック マネージャーを選択します。カラートラックプロセッサの場合は、[有効] を選択し、トラックの色を選択します。トラックプロセッサの追加から、トラックプロセッサタイムクリップを選択します。チェック クリッパー ウィンドウで、現在のタイム ポイントの前後に表示する検出数を入力します。トラック情報を XML トラックファイルとして保存し、カメラアイコンを使用して結果のスクリーンショットを取得します。z 方向に沿ってスタックを投影するには、検索バーを使用してプラグインを見つけ、ドロップダウンメニューから最大投影を選択します。インスペクタウィンドウでシーケンスタブ、キャンバス、回転を選択して画像を希望の向きに調整し、回転した画像のスクリーンショットを取得します。次に、対象の領域、2D の対象領域を選択し、対象の領域の形状を選択し、トリミングする画像上の対象領域を選択します。タイムスタンプオーバーレイプラグインをインストールし、タイムスタンプの配置とフォーマット方法の指示については、ポップアップウィンドウの指示に従ってタイムスタンプを追加します。時間間隔を変更または追加するには、シーケンスプロパティウィンドウで「編集」をクリックします。目のアイコンをアクティブにして、インスペクタ ウィンドウのレイヤー タブの下にあるスケール バーを戻します。次に、タイムスタンプ付きの結果のスクリーンショットを取得し、TIFF と AVI の両方の形式で画像を保存します。この方法を例示するように使用すると、種々の段階の卵形成の様々な段階、特に中発性の中期における分子ビーコンを介して内在性mRNAの輸送および局在化パターンを可視化することができる。同じステージの卵室に個別に注入すると、異なるオスカー特異的分子標識が同じ局在パターンを提示する。ナース細胞の細胞質に注入された分子ビーコンは、隣接する看護師細胞および卵母細胞に自由に拡散する。これにより、ビーコンは、マイクロインジェクション部位以外の部位で、標的とハイブリダイズし、蛍光シグナルを生成することができる。中発性のオスカルGFPトランスジェニック卵室では、取得データの分析は、分子ビーコンを使用して検出された蛍光シグナルを用いて遺伝子操作されたGFPタグ付きオスカーmRNAの蛍光シグナルに対する広範な共局在化を示す。さらに、5Dスタックをさらに解析して、看護師細胞および卵母細胞細胞質の両方で長距離輸送のためのオスカーmRNA軌道を決定することができる。その開発後、この技術は、RNA生物学の分野の研究者がショウジョウバエ卵室で内因性の母体の母RNA輸送と局在を探求する道を開いた。

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