Name: visualizing and tracking endogenous mrnas in live drosophila melanogaster egg chambers
Uploaded: 2019-06-04T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers at JoVE.com

우리는 합성, 라벨링 및 분자 비콘의 정화에 대한 살바토레 A.E. 마라스 (공중 보건 연구소 센터, 럿거스 대학) 감사, 다니엘 세인트 존스턴 (거든 연구소, 케임브리지 대학) 오스카-MS2 / MCP-GFP 형질 전환 플라이 스톡. 이 작품은 국립 과학 재단 경력 상 1149738 및 DPB에 전문 직원 의회 - CUNY 상에 의해 지원되었다.

1. 라이브 셀 이미징을 위한 MB의 설계
<ol><li>
표적 RNA 서열을 접어 mfold 서버로부터 "RNA 형태"를 사용하여 mRNA 표적의 이차 구조를 예측한다(http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/RNA-Folding-Form).
	<ol>
<li>FASTA 형식으로 대상 시퀀스를 붙여 넣기/업로드하고, 5 또는 10% 하위 최적도(MFE 값의 5 또는 10% 이내로 접는 자유 에너지가 있는 구조)를 선택하고 그에 따라 계산된 폴딩의 최대 개수를 조?...

<ol>
	<li>Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+RNA+distribution+and+dynamics+in+living+cells.">Imaging intracellular RNA distribution and dynamics in living cells.</a> Nature Methods. 6 (5), 331-338 (2009).</li><li>Bao, G., Rhee, W. J., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+probes+for+live-cell+RNA+detection.">Fluorescent probes for live-cell RNA detection.</a> Annual Reviews of Biomedical Engineering. 11, 25-47 (2009).</li><li>Mannack, L. V., Eising, S., Rentmeister, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+techniques+for+visualizing+RNA+in+cells.">Current techniques for visualizing RNA in cells.</a> F1000Research. 5, (2016).</li><li>Larson, D. R., Zenklusen, D., Wu, B., Chao, J. A., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+observation+of+transcription+initiation+and+elongation+on+an+endogenous+yeast+gene.">Real-time observation of transcription initiation and elongation on an endogenous yeast gene.</a> Science. 332 (6028), 475-478 (2011).</li><li>Bertrand, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+ASH1+mRNA+particles+in+living+yeast.">Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast.</a> Molecular Cell. 2 (4), 437-445 (1998).</li><li>Garcia, J. F., Parker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MS2+coat+proteins+bound+to+yeast+mRNAs+block+5'+to+3'+degradation+and+trap+mRNA+decay+products:+implications+for+the+localization+of+mRNAs+by+MS2-MCP+system.">MS2 coat proteins bound to yeast mRNAs block 5' to 3' degradation and trap mRNA decay products: implications for the localization of mRNAs by MS2-MCP system.</a> RNA. 21 (8), 1393-1395 (2015).</li><li>Bratu, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+beacons:+Fluorescent+probes+for+detection+of+endogenous+mRNAs+in+living+cells.">Molecular beacons: Fluorescent probes for detection of endogenous mRNAs in living cells.</a> Methods in Molecular Biology. 319, 1-14 (2006).</li><li>Bratu, D. P., Cha, B. J., Mhlanga, M. M., Kramer, F. R., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+the+distribution+and+transport+of+mRNAs+in+living+cells.">Visualizing the distribution and transport of mRNAs in living cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 100 (23), 13308-13313 (2003).</li><li>Tyagi, S., Kramer, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+beacons:+probes+that+fluoresce+upon+hybridization.">Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization.</a> Nature Biotechnology. 14 (3), 303-308 (1996).</li><li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+beacon-based+approach+for+live-cell+imaging+of+RNA+transcripts+with+minimal+target+engineering+at+the+single-molecule+level.">A molecular beacon-based approach for live-cell imaging of RNA transcripts with minimal target engineering at the single-molecule level.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1550 (2017).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+detection+of+microRNAs+by+combining+molecular+beacon+probes+with+T7+exonuclease-assisted+cyclic+amplification+reaction.">Multiplex detection of microRNAs by combining molecular beacon probes with T7 exonuclease-assisted cyclic amplification reaction.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (1), 107-114 (2017).</li><li>Baker, M. B., Bao, G., Searles, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+quantification+of+specific+microRNA+using+molecular+beacons.">In vitro quantification of specific microRNA using molecular beacons.</a> Nucleic Acids Research. 40 (2), e13 (2012).</li><li>Ko, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+color-tunable+molecular+beacon+to+sense+miRNA-9+expression+during+neurogenesis.">A color-tunable molecular beacon to sense miRNA-9 expression during neurogenesis.</a> Scientific Reports. 4, 4626 (2014).</li><li>Vet, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+detection+of+four+pathogenic+retroviruses+using+molecular+beacons.">Multiplex detection of four pathogenic retroviruses using molecular beacons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 96 (11), 6394-6399 (1999).</li><li>Li, J., Cao, Z. C., Tang, Z., Wang, K., Tan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+beacons+for+protein-DNA+interaction+studies.">Molecular beacons for protein-DNA interaction studies.</a> Methods in Molecular Biology. 429, 209-224 (2008).</li><li>Li, W. M., Chan, C. M., Miller, A. L., Lee, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+Functional+Roles+of+Molecular+Beacon+as+a+MicroRNA+Detector+and+Inhibitor.">Dual Functional Roles of Molecular Beacon as a MicroRNA Detector and Inhibitor.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (9), 3568-3580 (2017).</li><li>Kuang, T., Chang, L., Peng, X., Hu, X., Gallego-Perez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Beacon+Nano-Sensors+for+Probing+Living+Cancer+Cells.">Molecular Beacon Nano-Sensors for Probing Living Cancer Cells.</a> Trends in Biotechnology. 35 (4), 347-359 (2017).</li><li>Ban, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-genetic+Purification+of+Ventricular+Cardiomyocytes+from+Differentiating+Embryonic+Stem+Cells+through+Molecular+Beacons+Targeting+IRX-4.">Non-genetic Purification of Ventricular Cardiomyocytes from Differentiating Embryonic Stem Cells through Molecular Beacons Targeting IRX-4.</a> Stem Cell Reports. 5 (6), 1239-1249 (2015).</li><li>Hadjinicolaou, A. V., Demetriou, V. L., Emmanuel, M. A., Kakoyiannis, C. K., Kostrikis, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+beacon-based+real-time+PCR+detection+of+primary+isolates+of+Salmonella+Typhimurium+and+Salmonella+Enteritidis+in+environmental+and+clinical+samples.">Molecular beacon-based real-time PCR detection of primary isolates of Salmonella Typhimurium and Salmonella Enteritidis in environmental and clinical samples.</a> BMC Microbiology. 9, 97 (2009).</li><li>McLaughlin, J. M., Bratu, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+melanogaster+Oogenesis:+An+Overview.">Drosophila melanogaster Oogenesis: An Overview.</a> Methods in Molecular Biology. 1328, 1-20 (2015).</li><li>Bastock, R., St Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+oogenesis.">Drosophila oogenesis.</a> Current Biology. 18 (23), R1082-R1087 (2008).</li><li>Rongo, C., Gavis, E. R., Lehmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+oskar+RNA+regulates+oskar+translation+and+requires+Oskar+protein.">Localization of oskar RNA regulates oskar translation and requires Oskar protein.</a> Development. 121 (9), 2737-2746 (1995).</li><li>Mhlanga, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+colocalisation+of+oskar+mRNA+and+trans-acting+proteins+revealed+by+quantitative+imaging+of+the+Drosophila+oocyte.">In vivo colocalisation of oskar mRNA and trans-acting proteins revealed by quantitative imaging of the Drosophila oocyte.</a> PLoS One. 4 (7), e6241 (2009).</li><li>Bayer, L. V., Omar, O. S., Bratu, D. P., Catrina, I. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PinMol:+Python+application+for+designing+molecular+beacons+for+live+cell+imaging+of+endogenous+mRNAs.">PinMol: Python application for designing molecular beacons for live cell imaging of endogenous mRNAs.</a> bioRxiv. , (2018).</li><li>Marras, S. A., Kramer, F. R., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiencies+of+fluorescence+resonance+energy+transfer+and+contact-mediated+quenching+in+oligonucleotide+probes.">Efficiencies of fluorescence resonance energy transfer and contact-mediated quenching in oligonucleotide probes.</a> Nucleic Acids Research. 30 (21), e122 (2002).</li><li>Bratu, D. P., Catrina, I. E., Marras, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tiny+molecular+beacons+for+in+vivo+mRNA+detection.">Tiny molecular beacons for in vivo mRNA detection.</a> Methods in Molecular Biology. 714, 141-157 (2011).</li><li>Dean, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+(pulling)+of+needles+for+gene+delivery+by+microinjection.">Preparation (pulling) of needles for gene delivery by microinjection.</a> Cold Spring Harbor. 2006 (7), (2006).</li><li>Alami, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+transport+of+TDP-43+mRNA+granules+is+impaired+by+ALS-causing+mutations.">Axonal transport of TDP-43 mRNA granules is impaired by ALS-causing mutations.</a> Neuron. 81 (3), 536-543 (2014).</li><li>Jackson, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+Hairpin+DNA-Functionalized+Gold+Nanoparticles+for+Imaging+mRNA+in+Living+Cells.">Applications of Hairpin DNA-Functionalized Gold Nanoparticles for Imaging mRNA in Living Cells.</a> Methods in Enzymology. 572, 87-103 (2016).</li><li>Zimyanin, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+oskar+mRNA+transport+reveals+the+mechanism+of+posterior+localization.">In vivo imaging of oskar mRNA transport reveals the mechanism of posterior localization.</a> Cell. 134 (5), 843-853 (2008).</li><li>Catrina, I. E., Marras, S. A., Bratu, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tiny+molecular+beacons:+LNA/2'-O-methyl+RNA+chimeric+probes+for+imaging+dynamic+mRNA+processes+in+living+cells.">Tiny molecular beacons: LNA/2'-O-methyl RNA chimeric probes for imaging dynamic mRNA processes in living cells.</a> ACS Chemical Biology. 7 (9), 1586-1595 (2012).</li><li>Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+cytosolic+delivery+of+molecular+beacon+conjugates+and+flow+cytometric+analysis+of+target+RNA.">Efficient cytosolic delivery of molecular beacon conjugates and flow cytometric analysis of target RNA.</a> Nucleic Acids Research. 36 (12), e69 (2008).</li><li>Nitin, N., Santangelo, P. J., Kim, G., Nie, S., Bao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide-linked+molecular+beacons+for+efficient+delivery+and+rapid+mRNA+detection+in+living+cells.">Peptide-linked molecular beacons for efficient delivery and rapid mRNA detection in living cells.</a> Nucleic Acids Research. 32 (6), e58 (2004).</li><li>Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avoiding+false-positive+signals+with+nuclease-vulnerable+molecular+beacons+in+single+living+cells.">Avoiding false-positive signals with nuclease-vulnerable molecular beacons in single living cells.</a> Nucleic Acids Research. 35 (16), e105 (2007).</li><li>Bevilacqua, P. C., Ritchey, L. E., Su, Z., Assmann, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+Analysis+of+RNA+Secondary+Structure.">Genome-Wide Analysis of RNA Secondary Structure.</a> Annual Review of Genetics. 50, 235-266 (2016).</li><li>Mhlanga, M. M., Vargas, D. Y., Fung, C. W., Kramer, F. R., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=tRNA-linked+molecular+beacons+for+imaging+mRNAs+in+the+cytoplasm+of+living+cells.">tRNA-linked molecular beacons for imaging mRNAs in the cytoplasm of living cells.</a> Nucleic Acids Research. 33 (6), 1902-1912 (2005).</li><li>Eliceiri, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+imaging+software+tools.">Biological imaging software tools.</a> Nature Methods. 9 (7), 697-710 (2012).</li><li>Bolte, S., Cordelieres, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guided+tour+into+subcellular+colocalization+analysis+in+light+microscopy.">A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy.</a> Journal of Microscopy. 224 (Pt 3), 213-232 (2006).</li><li>Trcek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+germ+granules+are+structured+and+contain+homotypic+mRNA+clusters.">Drosophila germ granules are structured and contain homotypic mRNA clusters.</a> Nature Commununications. 6, 7962 (2015).</li></ol>

Drosophila 계란 챔버에서 내인성 mRNA 인신 매매의 라이브 시각화는 이제 PinMol 소프트웨어로 쉽게 설계 할 수있는 특정, 효율적이고 뉴클레아제 내성 MBs의 사용에 의존합니다. MB는 표적 mRNA(바람직하게는 이차 구조가 없는 영역) 내에서 고유한 서열을 검출하도록 설계된 특정 프로브로서, 전사체의 고도로 해결된 검출이 가능하다. 다른 조직/세포 유형에 대해 이 기술/프로토콜을 채택할...

공간적 및 시간적 해상도로 동적 이벤트를 시각화하는 세포 생물학 연구는 형광 기반 라이브 세포 이미징 기술의 개발에 의해 가능해졌습니다. 현재, 생체 내 mRNA 시각화는 RNA aptamer-단백질 상호 작용, 유기 염료 및 핵산 프로브어닐링 1,2의RNA aptamer 유도 형광에 기초한 기술을 통해 달성된다. 3. 그들은 모두 높은 특이성, 감도 및 신호 대 배경 비율을 제공합니다. 그러나 RNA aptamer 중심 접근법은 광범위한 유전자 조작을 필요로하며, 여기서 이식유전자는 단백질 또는 유기 염료 결합에 필요한 인공 구조 모티브로 RNA를 발현하도록 설계되었습니다. 예를 들어, MS2/MCP 시스템은 박테리오파지 MS2 코트 단백질(MCP)에 대한 결합 서열의 다중 탠덤 반복을 포함하는 RNA 구성을 발현하는 이식유전자의 공동 발현을 필요로 하며, 또 다른 이식유전자는 형광 단백질을 코딩한다. MCP4,5에융합 . 이러한 이차 구조 모티프를 RNA에 첨가하고, 부피가 큰 형광 태그가 붙은 단백질과 함께, 네이티브 RNA 과정이6에영향을 받을 수 있다는 우려를 제기하고 있다. 이러한 우려를 해결하고 추가적인 고유한 이점을 제공하는 기술은 핵산 기반 접근법인 분자 비콘(MBs)입니다. MBs는 내인성 mRNA의 다중 검출을 허용하고, 단일 뉴클레오티드 변이의 차별, 및표적 mRNA 7,8을가진 혼성화의 빠른 역학. MB는 그들의 표적에 혼성화되면 형광 형성 변화를 겪기 전에 담금질된 헤어핀 폴드에 남아 있는 올리고뉴클레오티드 프로브(도1C)9. 몇몇 단은 비코딩 RNA (microRNAs 및 lncRNAs)10,11,12,13,RNA 레트로바이러스14 및 동적 DNA 단백질을 둘 다 검출하기 위하여 MB를 사용하여 성공했습니다 상호 작용15. 그(것)들은 zebrafish 배아16,신경13,종양 조직17,분화 심근세포18및 살모넬라와 같은 각종 유기체 및 조직에서 화상 진찰을 위해 성공적으로 채택되었습니다 19.
여기에서 우리는 살아있는 D. melanogaster 계란 약실에 있는 내인성 mRNAs를 위한 디자인, 납품 및 검출 접근을 액티브한 분자 수송의 동적 범위를 붙잡기 위하여 충분히 빠른 현미경 설치와 결합된 기술합니다. D. melanogaster 계란 챔버는 초기 생식줄기 세포 분열 및 모계 유전자 발현에서 분절 체계획의 생성에 이르기까지 광범위한 발달 연구를 위한 이상적인 다세포 모델 시스템으로 작용하고 있다20, 21. 계란 챔버는 쉽게 분리, 크고 반투명, 그리고 생체 외 분석의 시간을 견딜 수, 그(것)들을 화상 진찰 실험에 높게 순종하. 많은 일은 적극적으로 번역되기 전에 이산 세포 지역에 모계 전사체의 비대칭 국소화에 초점을 맞추고있다. 특히, 오스카 mRNA 국소화 및 난모세포의 후방 극에서의 후속 번역은 치명적인 이카우드 배아 표현형22를피하기 위해 엄격하게 조절된 방식으로 발생되어야 한다. oskar mRNA는 간호사 세포에게 불린 15 생식선 세포에서 전사되고, 고리 운하에게 불린 세포질 다리를 통해서 능동적으로 수송됩니다, 난모세포로, 성숙한 계란이 되고 궁극적으로 기름지게 되는 생식세포 (그림1A ). oskar mRNP를 오가는 단백질 요인의 동적 모집 및 교환과 관련하여 이미 이용 가능한 상당한 양의 정보와 장거리 세포 내 여행이 있어 오스카를 연구하기에 선호되는 후보로 만듭니다. mRNA 수명 주기의 많은 프로세스. MBs는 mRNA 국소화의 과정에 관하여 세부사항을 드러내고 Drosophila 난소 생성 도중 mRNA 수송을 통제하는 단백질 요인의 규칙 그리고 기능을 해독하는 에서 중요한 역할을 했습니다. 특히, 간호사 세포에 MB를 마이크로주입하고 살아있는 세포 영상 실험을 수행함으로써, 내인성 mRNA의 추적이 8,23이가능하다.
여기에 제시된 로드맵은 MBs를 사용하여 라이브 셀 이미징 실험을 수행하고, 이미징 데이터를 획득하는 것에서부터 네이티브 셀룰러 환경에서 내인성 mRNA를 추적하기 위한 데이터 분석 수행에 이르기까지 완전한 프로세스의 단계를 제공합니다. 단계는 그들의 자신의 실험실 조정 내의 그밖 조직/세포 모형으로 일하는 연구원의 필요를 충족시키기 위하여 수정되고 추가 로 최적화될 수 있습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Spectrofluorometer</td>
			<td>Fluoromax-4 Horiba-Jobin Yvon</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Photon counting spectrofluorometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz cuvette</td>
			<td>Fireflysci (former Precision Cells Inc.)</td>
			<td>701MFL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 tweezer</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501985</td>
			<td>Thin tweezers are very important to separate out the individual egg chambers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 700</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slip No.1 22 x 40mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Leica MZ6 Leica Microsystems Inc.</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 fruit fly anesthesia pad</td>
			<td>Genesee Scienific</td>
			<td>59-114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCL pH7.5</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1185-53-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning disc confocal microscope</td>
			<td>Leica DMI-4000B inverted microscope equipped with Yokogawa CSU 10 spinning disc Leica Microsystems Inc.</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamamatsu C9100-13 ImagEM EMCCD camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PatchMan NP 2 Micromanipulator</td>
			<td>Eppendorf Inc.</td>
			<td>920000037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FemtoJet Microinjector</td>
			<td>Eppendorf Inc.</td>
			<td>920010504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection needle: Femtotips II</td>
			<td>Eppendorf Inc.</td>
			<td>930000043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading tip: 20ul Microloader</td>
			<td>Eppendorf Inc.</td>
			<td>930001007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Cover glasses no. 1 or 1.5, 22x40mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-026; 48393-172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry yeast</td>
			<td>Any grocery store</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer, &#62; 20 GB RAM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Although processing can be carried out on most computers, higher capabilities will increase the speed of the processing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing and tracking endogenous mrnas in live drosophila melanogaster egg chambers

형광 기지를 둔 화상 진찰 기술은, 가벼운 현미경 검사법에 있는 발달과 조합하여, 세포 생물학자가 살아있는 세포 화상 진찰 연구 결과를 수행하는 방법 혁명을 일으켰습니다. RNA를 검출하는 방법은 정액 연구 결과 유전자 발현 규칙에 사이트 특정 mRNA 현지화를 연결하기 때문에 크게 확장되었습니다. 동적 mRNA 프로세스는 지금 분자 행동의 동적 범위를 포착하기 위하여 충분히 빠른 현미경 설치와 결합된 mRNA를 검출하는 접근을 통해 구상될 수 있습니다. 분자 비콘 기술은 살아있는 세포에서 내인성 전사체를 직접 검출할 수 있는 혼성화 기반 접근법이다. 분자 비콘은 헤어핀 모양, 내부적으로 담금질, 단일 뉴클레오티드 차별 핵산 프로브이며, 이는 독특한 표적 서열로 혼성화될 때만 형광됩니다. 고급 형광 현미경 검사법 및 고해상도 이미징과 결합할 때, 그들은 mRNA의 세포 내 움직임의 공간적 및 시간적 추적을 수행 할 수 있습니다. 이 기술은 내인성 전사체를 검출할 수 있는 유일한 방법이지만, 세포 생물학자는 살아있는 세포 화상 진찰을 위한 그 같은 탐사기를 디자인하는 어려움 때문에 아직 완전히 이 기술을 받아들이지 않았습니다. 새로운 소프트웨어 애플리케이션인 PinMol은살아있는 세포 내의 mRNA 표적 영역을 효율적으로 혼성화하는 데 가장 적합한 프로브의 향상된 신속한 설계를 가능하게 합니다. 또한 고해상도, 실시간 이미지 수집 및 현재 오픈 소스 이미지 분석 소프트웨어를 통해 정교한 데이터 출력을 통해 mRNA의 수명 주기에 관련된 동적 프로세스의 복잡성을 보다 세밀하게 평가할 수 있습니다.
여기에서 우리는 Drosophila melanogaster 계란 약실에 분자 비콘을 디자인하고 전달하기 위한 포괄적인 프로토콜을 제시합니다. 내인성 모계 mRNAs의 직접적이고 고도로 구체적인 검출 및 시각화는 회전 디스크 공초점 현미경 검사법을 통해 수행됩니다. 이미징 데이터는 Icy 소프트웨어에서 물체 감지 및 추적을 사용하여 처리및 분석되어 oocyte 내의 특수 영역으로 이송되고 국한되는 mRNA의 동적 움직임에 대한 세부 정보를 얻을 수 있습니다.

PinMol을사용하여, 여러 MB는 하나의 mRNA 표적을 위해 설계될 수 있다(도 1B-C). 합성 및 정제 후, 선택된 MB는 시험관내 분석을 사용하여 특징화되고 비교된다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58545/58545fig1.jpg"> 도 1: 내인성 mRNA의 살아있는 세포 화상 진찰을 위한 기술 및...

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Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

여기에서, 우리는 분자 비콘, 회전 디스크 공초점 현미경 및 오픈 소스 분석을 사용하여 살아있는 Drosophila melanogaster 계란 챔버에서 내인성 mRNA 인신 매매의 시각화, 탐지, 분석 및 추적을위한 프로토콜을 제시합니다. 소프트웨어.

라이브 드로소필라 멜라노가스터 에그 챔버에서 내인성 mRNA 를 시각화하고 추적

Fluorescence-based imaging techniques, in combination with developments in light microscopy, have revolutionized how cell biologists conduct live cell ...

이 방법은 편광 RNA 국소화의 기계장치 그리고 기능에 관하여 RNA 생물학 필드에 있는 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 살아있는 조직에서 내인성 RNA 인신 매매의 실시간 시각화를 허용한다는 것입니다. 이 기술의 의미는 새로운 치료 표적을 밝히기 위하여 잠재력을 가지고 있기 때문에 RNA 관련 질병의 치료로 확장합니다.이 방법은 과일 플라이 계란 챔버에서 RNA 프로세스에 대한 통찰력을 제공 할 수 있지만, 그것은 또한 제브라피시 또는 배양 세포와 같은 다른 시스템에 적용 될 수있다. 일반적으로, 이 방법에 새로운 개별은 분자 비콘 소품의 디자인 그리고 납품과 관련되었던 도전 때문에 투쟁할 것입니다. 분자 비콘 미세 주입의 경우 40X 오일 목표를 선택하고 해부된 계란 챔버가 있는 커버슬립을 현미경 단계에 장착합니다.미세 주입을 위해 제대로 지향되는 발달 단계 중반에서 후반까지 계란 챔버를 찾습니다. 그런 다음 적절한 주입 및 보상 압력으로 마이크로 인젝터를 설정합니다. 마이크로 조작기 조이스틱을 사용하여 분자 비콘 용액 1 마이크로리터가 장착된 바늘을 오일 드롭에 부드럽게 낮춥니다.팁이 시야 주변을 향해 초점을 맞춥니다. 바늘 끝에서 공기를 제거하고 바늘에서 흐르는 것을 확인하고 바늘을 홈 위치로 가져오는 깨끗한 기능을 수행하십시오. 계란 챔버에 초점을 미세 주입 하 고 계란 챔버의 가장자리 근처 초점에 다시 바늘을 가지고.간호사 세포로부터 여포 세포를 분리하는 막이 초점을 맞출 수 있도록 목표의 z 위치의 미세 조정을 수행한다. 2~5초 동안 분자 비콘을 주입하기 위해 간호사 세포에 바늘을 삽입합니다. 재현 가능한 미세 주입 성공을 보장하기 위해, 마이크로 조작기로 바늘의 끝을 가져오는 동안 주입 될 여포 세포와 간호사 세포를 분리하는 막에 신중하게 초점을 맞춥니다.모든 분자 비콘을 주입했을 때 바늘을 부드럽게 제거하고 홈 위치로 후퇴하십시오. 이미지 수집을 위해 원하는 배율로 목표를 변경합니다. 그런 다음 새로운 목표에 따라 계란 챔버에 초점을 맞추고 이미지 수집을 시작합니다.분자 비콘의 스팟 감지를 위해 이미지 J.에서 이미지를 열어 ICY 도구로 변환하여 이미지를 ICY로 다시 변환합니다. 축척 막대가 스택에 자동으로 오버레이됩니다. 필요에 따라 경감 창을 통해 축척 막대를 편집합니다.그런 다음 레이어 탭 아래의 축척 막대의 눈 아이콘을 비활성화하여 원래 스택에서 축척 막대를 제거합니다. 검출 및 추적, 탐지 및 스팟 검출기를 선택하고 입력 및 전처리 매개 변수에 대해 현재 시퀀스 입력 감지 및 채널 0이 선택됨을 확인합니다. 검출기의 경우 분석을 수행하기 위해 스택에 z 슬라이스가 충분하지 않은 경우에만 3D용 2D 파장의 힘 사용을 사용하여 어두운 배경에서 밝은 지점을 감지하십시오.더 큰 반점에 대해 더 많은 저울을 추가하고 관심 영역에 대한 시퀀스의 관심 영역이 설정되어 있는지 확인합니다. 필터링의 경우 필터링이 설정되지 않은지 확인하고 출력 에서 적절한 파일 형식을 선택합니다. 스팟 검출기 결과를 추적 분석에 사용하려면 수영장으로 내보내기를 선택합니다.공동 지역화 해석의 경우 다른 채널에 대한 스팟 검색을 반복합니다. 분자 비콘 반점을 추적하려면 탐지 및 추적, 추적, 스팟 추적을 선택하고 스팟 감지와 동일한 매개 변수를 사용하여 스팟 검출기를 실행합니다. 예상 매개 변수를 클릭하고 매개 변수 추정 팝업 창에서 원하는 대상 모션을 선택합니다.그런 다음 실행 추적을 클릭합니다. 트랙을 시각화하려면 감지 및 추적, 추적 및 트랙 관리자를 선택합니다. 컬러 트랙 프로세서의 경우 트랙의 색상을 활성화하고 선택합니다.트랙 프로세서 추가에서 트랙 프로세서 시간 클립을 선택합니다. 체크 클리퍼 창에서 현재 시간 점 전후에 표시할 검색 수를 입력합니다. 트랙 정보를 XML 트랙 파일로 저장하고 카메라 아이콘을 사용하여 결과 스크린샷을 얻습니다.z 방향을 따라 스택을 투영하려면 검색 모음을 사용하여 플러그인을 찾고 드롭다운 메뉴에서 최대 프로젝션을 선택합니다. 검사기 창에서 시퀀스 탭, 캔버스 및 회전을 선택하여 이미지를 원하는 방향으로 조정하고 회전된 이미지의 스크린샷을 얻습니다. 그런 다음 관심 영역, 관심 영역 2D 영역을 선택하고 관심 영역 을 선택하고 자르기 위해 이미지에 대한 관심 영역을 선택합니다.타임스탬프 오버레이 플러그인을 설치하고 팝업 창의 지침에 따라 타임스탬프를 추가하여 타임스탬프를 배치하고 포맷하는 방법에 대한 지침을 설정합니다. 시간 간격을 변경하거나 추가하려면 시퀀스 속성 창에서 편집을 클릭합니다. 눈 아이콘을 활성화하여 검사창의 레이어 탭 아래에 있는 축척 막대를 다시 추가합니다.그런 다음 타임스탬프가 찍힌 결과의 스크린샷을 얻고 TIFF 및 AVI 형식으로 이미지를 저장합니다. 이 방법을 이용하여, 특히 우발생의 다양한 단계, 특히 중기 우발생 후의 분자 비콘을 통해 내생성 mRNAs의 수송 및 국소화 패턴을 시각화할 수 있다. 개별적으로 동일한 단계 계란 챔버에 주입 할 때, 다른 oskar 특정 분자 비콘은 국소화의 동일한 패턴을 제시한다.간호사 세포의 세포질에 주입된 분자 비콘은 인접한 간호사 세포뿐만 아니라 난소세포로 자유롭게 확산됩니다. 따라서, 비콘은 그들의 표적으로 혼성화하고 마이크로 주입 사이트 보다는 그밖 사이트에 형광 신호를 생성할 수 있습니다. 중반 oogenesis에서 oskar GFP 형질 전환 계란 챔버에서, 수집 데이터의 분석은 분자 비콘을 사용하여 검출된 형광 신호와 함께 유전자 조작 된 GFP 태그 오스카르 mRNA의 형광 신호에 대한 광범위한 지역화를 보여줍니다.더욱이, 5D 스택은 간호사 세포와 난소세포 세포질 모두에서 장거리 수송을 위한 oskar mRNA 궤적을 결정하기 위해 추가로 분석될 수 있다. 개발 후, 이 기술은 RNA 생물학 분야의 연구원들이 Drosophila 계란 챔버에서 내인성 모계 mRNA 수송 및 국소화를 탐구하는 길을 열었습니다.

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Cell Biology

Biology

Unit 1

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Control of Gene Expression

SCIENTISTS IN ACTION

Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

Drosophila Melanogaster에서 애벌레 CNS의 해부

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

연구

생물학

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

성인 Drosophila Melanogaster의 로코의 고해상도 비디오 추적

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes

Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes

라이브를 떠올리 Drosophila</em형광 염료와 함께> Glial - 신경근육학 융티온

Our project identified GFP labeled glial structures at the developing larval fly neuromuscular synapse. To look at development of live glial-nerve-muscle ...

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

에 잔 심장을 떠올리 Drosophila</em

The Drosophila heart has recently emerged as a good model system for examining the genetic, cellular, and molecular mechanisms underlying function in ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

라이브 영상 Drosophila melanogaster 배아 Hemocyte 마이 그 레이션

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

의 분리 Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

개별 준비 Drosophila</em라이브 이미징을위한> 계란 회의소

Live cell imaging is an important technique applied to a number of Drosophila tissues used as models to investigate topics such as axis specification, ...

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

의 수명 측정<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

사멸 세포 간극의 이미지를하는 동안 라이브<em&gt; 초파리</em&gt; 배아

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

(A)의 유지 보수<em&gt; 노랑 초파리</em&gt; 인구 케이지

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life ...