Name: visualizing and tracking endogenous mrnas in live drosophila melanogaster egg chambers
Uploaded: 2019-06-04T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers at JoVE.com

Agradecemos a Salvatore AE Marras (centro do Instituto de pesquisa em saúde pública, Universidade Rutgers) pela síntese, rotulagem e purificação de balizas moleculares, e Daniel St Johnston (Instituto Gurdon, Universidade de Cambridge) para o Oskar-MS2/ Estoque de mosca transgênica MCP-GFP. Este trabalho foi apoiado por um prêmio de carreira da Fundação Nacional de ciência 1149738 e um Congresso de pessoal profissional-prêmio CUNY para DPB.

1. projeto de MBs para a imagem latente viva da pilha
<ol><li>
Dobre a sequência de RNA alvo para prever a estrutura secundária do alvo do mRNA usando o "formulário RNA" do servidor mfold (http://unafold.RNA.Albany.edu/?q=mfold/RNA-Folding-Form).
	<ol>
<li>Colar/carregar a seqüência de destino no formato FASTA, selecione 5 ou 10% sub-optimality (estruturas com uma energia livre de dobrar dentro de 5 ou 10% do valor de MFE, respectivamente), e ajustar o número máximo de dobraduras comput...

<ol>
	<li>Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+RNA+distribution+and+dynamics+in+living+cells.">Imaging intracellular RNA distribution and dynamics in living cells.</a> Nature Methods. 6 (5), 331-338 (2009).</li><li>Bao, G., Rhee, W. J., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+probes+for+live-cell+RNA+detection.">Fluorescent probes for live-cell RNA detection.</a> Annual Reviews of Biomedical Engineering. 11, 25-47 (2009).</li><li>Mannack, L. V., Eising, S., Rentmeister, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+techniques+for+visualizing+RNA+in+cells.">Current techniques for visualizing RNA in cells.</a> F1000Research. 5, (2016).</li><li>Larson, D. R., Zenklusen, D., Wu, B., Chao, J. A., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+observation+of+transcription+initiation+and+elongation+on+an+endogenous+yeast+gene.">Real-time observation of transcription initiation and elongation on an endogenous yeast gene.</a> Science. 332 (6028), 475-478 (2011).</li><li>Bertrand, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+ASH1+mRNA+particles+in+living+yeast.">Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast.</a> Molecular Cell. 2 (4), 437-445 (1998).</li><li>Garcia, J. F., Parker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MS2+coat+proteins+bound+to+yeast+mRNAs+block+5'+to+3'+degradation+and+trap+mRNA+decay+products:+implications+for+the+localization+of+mRNAs+by+MS2-MCP+system.">MS2 coat proteins bound to yeast mRNAs block 5' to 3' degradation and trap mRNA decay products: implications for the localization of mRNAs by MS2-MCP system.</a> RNA. 21 (8), 1393-1395 (2015).</li><li>Bratu, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+beacons:+Fluorescent+probes+for+detection+of+endogenous+mRNAs+in+living+cells.">Molecular beacons: Fluorescent probes for detection of endogenous mRNAs in living cells.</a> Methods in Molecular Biology. 319, 1-14 (2006).</li><li>Bratu, D. P., Cha, B. J., Mhlanga, M. M., Kramer, F. R., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+the+distribution+and+transport+of+mRNAs+in+living+cells.">Visualizing the distribution and transport of mRNAs in living cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 100 (23), 13308-13313 (2003).</li><li>Tyagi, S., Kramer, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+beacons:+probes+that+fluoresce+upon+hybridization.">Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization.</a> Nature Biotechnology. 14 (3), 303-308 (1996).</li><li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+beacon-based+approach+for+live-cell+imaging+of+RNA+transcripts+with+minimal+target+engineering+at+the+single-molecule+level.">A molecular beacon-based approach for live-cell imaging of RNA transcripts with minimal target engineering at the single-molecule level.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1550 (2017).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+detection+of+microRNAs+by+combining+molecular+beacon+probes+with+T7+exonuclease-assisted+cyclic+amplification+reaction.">Multiplex detection of microRNAs by combining molecular beacon probes with T7 exonuclease-assisted cyclic amplification reaction.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (1), 107-114 (2017).</li><li>Baker, M. B., Bao, G., Searles, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+quantification+of+specific+microRNA+using+molecular+beacons.">In vitro quantification of specific microRNA using molecular beacons.</a> Nucleic Acids Research. 40 (2), e13 (2012).</li><li>Ko, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+color-tunable+molecular+beacon+to+sense+miRNA-9+expression+during+neurogenesis.">A color-tunable molecular beacon to sense miRNA-9 expression during neurogenesis.</a> Scientific Reports. 4, 4626 (2014).</li><li>Vet, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+detection+of+four+pathogenic+retroviruses+using+molecular+beacons.">Multiplex detection of four pathogenic retroviruses using molecular beacons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 96 (11), 6394-6399 (1999).</li><li>Li, J., Cao, Z. C., Tang, Z., Wang, K., Tan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+beacons+for+protein-DNA+interaction+studies.">Molecular beacons for protein-DNA interaction studies.</a> Methods in Molecular Biology. 429, 209-224 (2008).</li><li>Li, W. M., Chan, C. M., Miller, A. L., Lee, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+Functional+Roles+of+Molecular+Beacon+as+a+MicroRNA+Detector+and+Inhibitor.">Dual Functional Roles of Molecular Beacon as a MicroRNA Detector and Inhibitor.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (9), 3568-3580 (2017).</li><li>Kuang, T., Chang, L., Peng, X., Hu, X., Gallego-Perez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Beacon+Nano-Sensors+for+Probing+Living+Cancer+Cells.">Molecular Beacon Nano-Sensors for Probing Living Cancer Cells.</a> Trends in Biotechnology. 35 (4), 347-359 (2017).</li><li>Ban, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-genetic+Purification+of+Ventricular+Cardiomyocytes+from+Differentiating+Embryonic+Stem+Cells+through+Molecular+Beacons+Targeting+IRX-4.">Non-genetic Purification of Ventricular Cardiomyocytes from Differentiating Embryonic Stem Cells through Molecular Beacons Targeting IRX-4.</a> Stem Cell Reports. 5 (6), 1239-1249 (2015).</li><li>Hadjinicolaou, A. V., Demetriou, V. L., Emmanuel, M. A., Kakoyiannis, C. K., Kostrikis, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+beacon-based+real-time+PCR+detection+of+primary+isolates+of+Salmonella+Typhimurium+and+Salmonella+Enteritidis+in+environmental+and+clinical+samples.">Molecular beacon-based real-time PCR detection of primary isolates of Salmonella Typhimurium and Salmonella Enteritidis in environmental and clinical samples.</a> BMC Microbiology. 9, 97 (2009).</li><li>McLaughlin, J. M., Bratu, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+melanogaster+Oogenesis:+An+Overview.">Drosophila melanogaster Oogenesis: An Overview.</a> Methods in Molecular Biology. 1328, 1-20 (2015).</li><li>Bastock, R., St Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+oogenesis.">Drosophila oogenesis.</a> Current Biology. 18 (23), R1082-R1087 (2008).</li><li>Rongo, C., Gavis, E. R., Lehmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+oskar+RNA+regulates+oskar+translation+and+requires+Oskar+protein.">Localization of oskar RNA regulates oskar translation and requires Oskar protein.</a> Development. 121 (9), 2737-2746 (1995).</li><li>Mhlanga, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+colocalisation+of+oskar+mRNA+and+trans-acting+proteins+revealed+by+quantitative+imaging+of+the+Drosophila+oocyte.">In vivo colocalisation of oskar mRNA and trans-acting proteins revealed by quantitative imaging of the Drosophila oocyte.</a> PLoS One. 4 (7), e6241 (2009).</li><li>Bayer, L. V., Omar, O. S., Bratu, D. P., Catrina, I. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PinMol:+Python+application+for+designing+molecular+beacons+for+live+cell+imaging+of+endogenous+mRNAs.">PinMol: Python application for designing molecular beacons for live cell imaging of endogenous mRNAs.</a> bioRxiv. , (2018).</li><li>Marras, S. A., Kramer, F. R., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiencies+of+fluorescence+resonance+energy+transfer+and+contact-mediated+quenching+in+oligonucleotide+probes.">Efficiencies of fluorescence resonance energy transfer and contact-mediated quenching in oligonucleotide probes.</a> Nucleic Acids Research. 30 (21), e122 (2002).</li><li>Bratu, D. P., Catrina, I. E., Marras, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tiny+molecular+beacons+for+in+vivo+mRNA+detection.">Tiny molecular beacons for in vivo mRNA detection.</a> Methods in Molecular Biology. 714, 141-157 (2011).</li><li>Dean, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+(pulling)+of+needles+for+gene+delivery+by+microinjection.">Preparation (pulling) of needles for gene delivery by microinjection.</a> Cold Spring Harbor. 2006 (7), (2006).</li><li>Alami, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+transport+of+TDP-43+mRNA+granules+is+impaired+by+ALS-causing+mutations.">Axonal transport of TDP-43 mRNA granules is impaired by ALS-causing mutations.</a> Neuron. 81 (3), 536-543 (2014).</li><li>Jackson, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+Hairpin+DNA-Functionalized+Gold+Nanoparticles+for+Imaging+mRNA+in+Living+Cells.">Applications of Hairpin DNA-Functionalized Gold Nanoparticles for Imaging mRNA in Living Cells.</a> Methods in Enzymology. 572, 87-103 (2016).</li><li>Zimyanin, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+oskar+mRNA+transport+reveals+the+mechanism+of+posterior+localization.">In vivo imaging of oskar mRNA transport reveals the mechanism of posterior localization.</a> Cell. 134 (5), 843-853 (2008).</li><li>Catrina, I. E., Marras, S. A., Bratu, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tiny+molecular+beacons:+LNA/2'-O-methyl+RNA+chimeric+probes+for+imaging+dynamic+mRNA+processes+in+living+cells.">Tiny molecular beacons: LNA/2'-O-methyl RNA chimeric probes for imaging dynamic mRNA processes in living cells.</a> ACS Chemical Biology. 7 (9), 1586-1595 (2012).</li><li>Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+cytosolic+delivery+of+molecular+beacon+conjugates+and+flow+cytometric+analysis+of+target+RNA.">Efficient cytosolic delivery of molecular beacon conjugates and flow cytometric analysis of target RNA.</a> Nucleic Acids Research. 36 (12), e69 (2008).</li><li>Nitin, N., Santangelo, P. J., Kim, G., Nie, S., Bao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide-linked+molecular+beacons+for+efficient+delivery+and+rapid+mRNA+detection+in+living+cells.">Peptide-linked molecular beacons for efficient delivery and rapid mRNA detection in living cells.</a> Nucleic Acids Research. 32 (6), e58 (2004).</li><li>Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avoiding+false-positive+signals+with+nuclease-vulnerable+molecular+beacons+in+single+living+cells.">Avoiding false-positive signals with nuclease-vulnerable molecular beacons in single living cells.</a> Nucleic Acids Research. 35 (16), e105 (2007).</li><li>Bevilacqua, P. C., Ritchey, L. E., Su, Z., Assmann, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+Analysis+of+RNA+Secondary+Structure.">Genome-Wide Analysis of RNA Secondary Structure.</a> Annual Review of Genetics. 50, 235-266 (2016).</li><li>Mhlanga, M. M., Vargas, D. Y., Fung, C. W., Kramer, F. R., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=tRNA-linked+molecular+beacons+for+imaging+mRNAs+in+the+cytoplasm+of+living+cells.">tRNA-linked molecular beacons for imaging mRNAs in the cytoplasm of living cells.</a> Nucleic Acids Research. 33 (6), 1902-1912 (2005).</li><li>Eliceiri, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+imaging+software+tools.">Biological imaging software tools.</a> Nature Methods. 9 (7), 697-710 (2012).</li><li>Bolte, S., Cordelieres, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guided+tour+into+subcellular+colocalization+analysis+in+light+microscopy.">A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy.</a> Journal of Microscopy. 224 (Pt 3), 213-232 (2006).</li><li>Trcek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+germ+granules+are+structured+and+contain+homotypic+mRNA+clusters.">Drosophila germ granules are structured and contain homotypic mRNA clusters.</a> Nature Commununications. 6, 7962 (2015).</li></ol>

A visualização ao vivo do tráfico endógeno de mRNA em câmaras de ovos de Drosophila depende do uso de MBS específicos, eficientes e resistentes a nucleases, que agora podem ser facilmente projetados com o software pinmol . Os MBs são sondas específicas projetadas para detectar sequências exclusivas dentro de um mRNA alvo (preferencialmente regiões livres de estrutura secundária), possibilitando uma detecção altamente resolvida de uma transcrição. A única limitação ao adotar esta técni...

Estudos de biologia celular que visualizam eventos dinâmicos com resolução espacial e temporal foram possibiliados pelo desenvolvimento de técnicas de imagens de células ao vivo baseadas em fluorescência. Atualmente, in vivo mRNA visualização é alcançada através de tecnologias que são baseadas em interações RNA aptamer-proteína, RNA aptamer-induzida por fluorescência de corantes orgânicos e ácido nucleico sonda de recozimento1,2, 3. They todos oferecem a especificidade elevada, a sensibilidade e a relação do sinal-à-fundo. No entanto, as abordagens centradas no RNA requerem manipulação genética extensiva, onde um transgene é projetado para expressar um RNA com motivos estruturais artificiais que são necessários para a ligação de proteínas ou corantes orgânicos. Por exemplo, o sistema MS2/MCP requer a coexpressão de um transgene expressando uma construção de RNA contendo múltiplas repetições em tandem da seqüência de ligação para a proteína de revestimento de bacteriófago MS2 (MCP), e outro transgene que codifica uma proteína fluorescente fundido para MCP4,5. A adição de tais motivos estruturais secundários ao RNA, junto com um volumoso cDNAs marcou a proteína, levantou as preocupações que os processos nativos do RNA podem ser afetados6. Uma tecnologia que aborda essa preocupação e oferece vantagens exclusivas adicionais é a abordagem baseada em ácido nucleico, balizas moleculares (MBs). MBS permitem a detecção multiplex de mRNAs endógenas, discriminação de variações de nucleotídeo único e cinética rápida de hibridação com mRNA alvo7,8. Os MBs são sondas de oligonucleotídeo que permanecem em uma prega de hairpin extinto antes de sofrer uma mudança conformacional fluorogênica, uma vez que eles hibridizam para seus alvos (Figura 1C)9. Diversos grupos tiveram o sucesso em usar MBS para detectar ambos não-codificando RNAs (microRNAs e lncrnas) 10,11,12,13, retrovirus14 do RNA e ADN-proteína dinâmica interações15. Foram empregados com sucesso para a imagem latente em vários organismos e tecidos, tais como embriões do zebrafish16, neurônios13, o tecido17do tumor, diferenciando os cardiomiócitos18, e as salmonelas a 19.
Aqui nós descrevemos a aproximação do projeto, da entrega e da deteção para mRNAs endógenos em câmaras de ovo vivas do D. melanogaster acopladas com uma estrutura da microscopia que seja rápida bastante capturar a escala dinâmica do transporte molecular ativo. A câmara do ovo de D. melanogaster serviu como um sistema modelo multicelular ideal para uma escala larga de estudos desenvolventes, da divisão adiantada da pilha de haste do germline e da expressão genética materna à geração do plano segmentar20do corpo, a 21. As câmaras de ovo são facilmente isoladas, grandes e translúcidas, e capazes de suportar horas de análise ex vivo , tornando-os altamente aptos a experimentos de imagem. Muito trabalho centrou-se na localização assimétrica das transcrições maternas a regiões subcelulares discretas antes de serem traduzidas ativamente. No detalhe, a localização de Oskar mRNA e sua tradução subseqüente no pólo do posterior do oocyte devem ocorrer em uma maneira firmemente regulada para evitar um phenotype bicaudal letal do embrião22. Oskar mRNA é transcrito nas 15 células germinais, denominadas células de enfermagem, e transportada ativamente através de pontes citoplasmáticas, denominadas canais de anel, para o oócito, a célula germinativa que se torna o ovo maduro e é finalmente fertilizado (Figura 1a ). A quantidade considerável de informações já disponíveis sobre o recrutamento dinâmico e a troca de fatores proteicos de e para Oskar mrnp, juntamente com sua viagem intracelular de longo alcance, fazem de Oskar um candidato preferencial para estudar os muitos processos do ciclo de vida do mRNA. Os MBs têm sido fundamentais para revelar detalhes sobre o processo de localização de mRNA e decifrar a regulação e a função de fatores proteicos que controlam o transporte de mRNA durante a Drosophila oogenesis. Em particular, por microinjetar MBS em células de enfermeira e realizando experimentos de imagens de células ao vivo, o rastreamento de mRNAs endógenas é possível8,23.
O roteiro aqui apresentado oferece as etapas de um processo completo, desde a realização de um experimento de imagens de células ao vivo usando MBs, adquirindo dados de imagem, até a realização de análises de dados para rastrear o mRNA endógeno em seu ambiente celular nativo. As etapas podem ser modificadas e otimizadas para atender às necessidades dos pesquisadores que trabalham com outros tecidos/tipos de células dentro de seu próprio ambiente de laboratório.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Spectrofluorometer</td>
			<td>Fluoromax-4 Horiba-Jobin Yvon</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Photon counting spectrofluorometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz cuvette</td>
			<td>Fireflysci (former Precision Cells Inc.)</td>
			<td>701MFL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 tweezer</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501985</td>
			<td>Thin tweezers are very important to separate out the individual egg chambers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 700</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slip No.1 22 x 40mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Leica MZ6 Leica Microsystems Inc.</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 fruit fly anesthesia pad</td>
			<td>Genesee Scienific</td>
			<td>59-114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCL pH7.5</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1185-53-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning disc confocal microscope</td>
			<td>Leica DMI-4000B inverted microscope equipped with Yokogawa CSU 10 spinning disc Leica Microsystems Inc.</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamamatsu C9100-13 ImagEM EMCCD camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PatchMan NP 2 Micromanipulator</td>
			<td>Eppendorf Inc.</td>
			<td>920000037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FemtoJet Microinjector</td>
			<td>Eppendorf Inc.</td>
			<td>920010504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection needle: Femtotips II</td>
			<td>Eppendorf Inc.</td>
			<td>930000043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading tip: 20ul Microloader</td>
			<td>Eppendorf Inc.</td>
			<td>930001007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Cover glasses no. 1 or 1.5, 22x40mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-026; 48393-172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry yeast</td>
			<td>Any grocery store</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer, &#62; 20 GB RAM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Although processing can be carried out on most computers, higher capabilities will increase the speed of the processing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing and tracking endogenous mrnas in live drosophila melanogaster egg chambers

As técnicas de imagem com base em fluorescência, em combinação com a evolução da microscopia de luz, revolucionaram a forma como os biólogos celulares realizam estudos de imagem celular ao vivo. Os métodos para detectar RNAs expandiram-se extremamente desde que os estudos seminal lig a localização local-específica do mRNA ao Regulamento da expressão genética. Os processos dinâmicos do mRNA podem agora ser visualizados através das aproximações que detectam mRNAs, acoplados com os set-ups da microscopia que são rápidos bastante capturar a escala dinâmica do comportamento molecular. A tecnologia de baliza molecular é uma abordagem baseada em hibridação capaz de detecção direta de transcrições endógenas em células vivas. As balizas moleculares são sondas de ácido nucleico discriminante, em forma de hairpin, extinto internamente, mononucleotídeo, que fluorescência somente após a hibridação a uma sequência de alvos única. Quando acoplados com a microscopia de fluorescência avançada e a imagem latente de alta resolução, permitem que um realize o seguimento espacial e temporal do movimento intracelular de mRNAs. Embora essa tecnologia seja o único método capaz de detectar transcrições endógenas, os biólogos celulares ainda não adotaram totalmente essa tecnologia devido às dificuldades de projetar tais sondas para imagens de células ao vivo. Uma aplicação de software nova, pinmol, permite o projeto realçado e rápido das pontas de prova seridas melhor para hibridizam eficientemente às regiões do alvo do mRNA dentro de uma pilha viva. Além disso, a aquisição de imagem de alta resolução, em tempo real e o software de análise de imagens de código aberto, permitem uma saída de dados refinada, levando a uma avaliação mais fina da complexidade subjacente aos processos dinâmicos envolvidos no ciclo de vida do mRNA.
Aqui nós apresentamos um protocolo detalhado para projetar e entregar balizas moleculars em câmaras do ovo do melanogaster de Drosophila . A deteção e o visualização diretos e altamente específicos de mRNAs maternos endógenos são executados através da microscopia confocal do disco giratório. Os dados da imagem latente são processados e analisados usando a deteção e o seguimento do objeto no software gelado para obter detalhes sobre o movimento dinâmico dos mRNAs, que são transportados e localizados às regiões especializadas dentro do oocyte.

Usando o Pinmol, vários MBS podem ser projetados para um alvo de mRNA (Figura 1b-C). Após síntese e purificação, os MBs selecionados são caracterizados e comparados por meio da análise in vitro.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58545/58545fig1.jpg"> Figura 1: técnica e descrição tecidual para imagens de células ao vivo de mRNA...

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Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Aqui, apresentamos um protocolo para a visualização, detecção, análise e rastreamento do tráfico endógeno de mRNA em câmara de ovo de Drosophila melanogaster ao vivo usando balizas moleculares, microscopia confocal de disco giratório e análise de código aberto Software.

Visualizando e rastreando mRNAs endógenas em câmaras de ovo de Drosophila melanogaster ao vivo

Fluorescence-based imaging techniques, in combination with developments in light microscopy, have revolutionized how cell biologists conduct live cell ...

Este método pode ajudar a responder perguntas-chave no campo de biologia do RNA sobre o mecanismo e a função da localização polarizada do RNA. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a visualização em tempo real do tráfico endógeno de RNA em tecidos vivos. As implicações dessa técnica se estendem para a terapia de doenças relacionadas ao RNA porque tem potencial para descobrir novos alvos terapêuticos.Embora este método possa fornecer insights sobre os processos de RNA na câmara de ovos de mosca-das-frutas, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como em zebrafish ou células culturais. Geralmente, indivíduos novos neste método lutarão por causa dos desafios associados ao projeto e à entrega dos adereços de farol molecular. Para microinjeção de farol molecular, selecione o objetivo do óleo 40X e monte uma mancha de cobertura com a câmara de ovo dissecada no estágio do microscópio.Localize uma câmara de ovos no estágio de desenvolvimento médio e tardio que seja adequadamente orientada para microinjeção. Em seguida, configure um microinjetor com as pressões de injeção e compensação apropriadas. Usando o joystick micro manipulador, abaixe suavemente uma agulha carregada com um microliter de solução de farol molecular na gota de óleo.Coloque a ponta em foco para a periferia do campo de visão. Execute uma função limpa para remover o ar da ponta da agulha e garantir que haja fluxo da agulha e leve a agulha para a posição de casa. Concentre-se na câmara de ovos para ser microinjetada e traga a agulha de volta ao foco perto da borda da câmara de ovos.Realize um ajuste fino da posição z do objetivo de modo que a membrana que separa as células folículos das células enfermeiras esteja em foco. Insira a agulha em uma célula enfermeira para injeção dos faróis moleculares durante um período de dois a cinco segundos. Para garantir o sucesso da microinjeção reprodutível, concentre-se cuidadosamente na membrana que separa as células folículos e as células enfermeiras que serão injetadas ao colocar a ponta da agulha em foco com o micro manipulador.Quando todos os faróis moleculares tiverem sido injetados, remova suavemente a agulha e retraia-a para a posição de casa. Alterar o objetivo para a ampliação desejada para aquisição de imagens. Em seguida, concentre-se na câmara de ovos sob o novo objetivo e comece a aquisição de imagem.Para detecção pontual dos faróis moleculares, abra as imagens na imagem J.Use a ferramenta converter para ICY para converter as imagens de volta ao ICY. Uma barra de escala será automaticamente sobreposta na pilha. Edite a barra de escala através da janela do inspetor, conforme necessário.Em seguida, inativar o ícone ocular da barra de escala sob a guia de camada para remover a barra de escala da pilha original. Selecione detecção e rastreamento, detecção e detector de manchas e confirme a detecção de entrada de sequência atual e o canal zero são selecionados para os parâmetros de entrada e pré-processamento, respectivamente. Para detector, selecione detectar ponto brilhante sobre fundo escuro usando o uso de força de comprimentos de onda 2D para 3D somente se não houver fatias z suficientes nas pilhas para realizar a análise.Selecione escalas e sensibilidade para cada escala adicionando mais escalas para pontos maiores e confirme que a região de interesse da sequência é definida para região de interesse. Para filtragem, confirme se nenhuma filtragem foi definida e selecione o formato de arquivo apropriado sob saída. Se os resultados do detector de manchas forem usados para análise de rastreamento, selecione exportar para piscina.Para análise de colocalização, repita a detecção do ponto para o outro canal. Para rastrear os pontos do farol molecular, selecione detecção e rastreamento, rastreamento, rastreamento de manchas e execute o detector de manchas usando os mesmos parâmetros da detecção do local. Clique em parâmetros de estimativa e selecione o movimento de destino desejado na janela popup de estimativa de parâmetros.Em seguida, clique em executar o rastreamento. Para visualizar as faixas, selecione detecção e rastreamento, rastreamento e gerenciador de faixas. Para o processador de faixa de cores, selecione ativar e selecionar uma cor para as faixas.A partir de adicionar processador de faixa, selecione o clipe de tempo do processador de faixa. Na janela do cortador de verificação, digite o número de detecções a serem mostradas antes e depois do ponto de tempo atual. Salve as informações da faixa como um arquivo de faixa XML e use o ícone da câmera para obter uma captura de tela dos resultados.Para projetar a pilha ao longo da direção z, use a barra de pesquisa para encontrar o plugin e selecione a projeção máxima no menu suspenso. Na janela do inspetor, selecione a guia de sequência, tela e rotação para ajustar a imagem à orientação desejada e obter uma captura de tela da imagem rotativa. Em seguida, selecione região de interesse, região de interesse 2D, escolha região de forma de interesse e selecione a região de interesse na imagem para cultivo.Instale o plugin de sobreposição de datamp e adicione um data-hora seguindo as instruções na janela pop-up para obter instruções sobre como colocar e formatar o estamp de tempo. Para alterar ou adicionar o intervalo de tempo, clique em editar na janela de propriedades sequência. Ative o ícone dos olhos para adicionar de volta a barra de escala sob a guia de camada na janela do inspetor.Em seguida, obtenha uma captura de tela dos resultados carimbados e salve a imagem nos formatos TIFF e AVI. Usando este método como demonstrado, é possível visualizar os padrões de transporte e localização de mRNAs endógenos através de balizas moleculares em vários estágios da oogênese e, em particular, na e depois da oogênese média. Quando injetados individualmente nas mesmas câmaras de ovos de estágio, diferentes faróis moleculares específicos de Oskar apresentam o mesmo padrão de localização.Os faróis moleculares injetados no citoplasma de uma célula enfermeira difundirão livremente em células enfermeiras adjacentes, bem como no oócito. Assim, os faróis são capazes de hibridizar com seus alvos e gerar sinais de fluorescência em outros locais além do local de microinjeção. Nas câmaras de ovos transgênicos oskar GFP em média oogênese, a análise dos dados de aquisição mostra uma colocalização extensiva para o sinal de fluorescência de GFP geneticamente modificado com o sinal de fluorescência detectado usando sinalizadores moleculares.Além disso, as pilhas 5D podem ser analisadas para determinar as trajetórias de oskar mRNA para transporte de longa distância tanto em células enfermeiras quanto em citoplasma oocito. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores da área de biologia do RNA explorarem o transporte e a localização do mRNA materno endógeno na câmara de ovos Drosophila.

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Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

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