Name: visualizing and tracking endogenous mrnas in live drosophila melanogaster egg chambers
Uploaded: 2019-06-04T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers at JoVE.com

Мы благодарим Сальваторе А.Е. Маррас (Центр Научно-исследовательского института общественного здравоохранения, Ратгерский университет) за синтез, маркировку и очищение молекулярных маяков, а Даниэля Сент-Джонстона (Гурдонский институт, Кембриджский университет) за оскар-MS2/ McP-GFP трансгенных мухи запасов. Эта работа была поддержана Национальным научным фондом CAREER Award 1149738 и премией Конгресса профессионального персонала-CUNY Для DPB.

1. Дизайн МБ для визуализации живых клеток
<ol><li>
Сложите целевую последовательность РНК, чтобы предсказать вторичную структуру цели mRNA, используя "форму РНК" с сервера mfold (http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/RNA-Folding-Form).
	<ol>
<li>Вставьте/загрузите целевую последовательность в формате FASTA, вы?...

<ol>
	<li>Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+RNA+distribution+and+dynamics+in+living+cells.">Imaging intracellular RNA distribution and dynamics in living cells.</a> Nature Methods. 6 (5), 331-338 (2009).</li><li>Bao, G., Rhee, W. J., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+probes+for+live-cell+RNA+detection.">Fluorescent probes for live-cell RNA detection.</a> Annual Reviews of Biomedical Engineering. 11, 25-47 (2009).</li><li>Mannack, L. V., Eising, S., Rentmeister, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+techniques+for+visualizing+RNA+in+cells.">Current techniques for visualizing RNA in cells.</a> F1000Research. 5, (2016).</li><li>Larson, D. R., Zenklusen, D., Wu, B., Chao, J. A., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+observation+of+transcription+initiation+and+elongation+on+an+endogenous+yeast+gene.">Real-time observation of transcription initiation and elongation on an endogenous yeast gene.</a> Science. 332 (6028), 475-478 (2011).</li><li>Bertrand, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+ASH1+mRNA+particles+in+living+yeast.">Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast.</a> Molecular Cell. 2 (4), 437-445 (1998).</li><li>Garcia, J. F., Parker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MS2+coat+proteins+bound+to+yeast+mRNAs+block+5'+to+3'+degradation+and+trap+mRNA+decay+products:+implications+for+the+localization+of+mRNAs+by+MS2-MCP+system.">MS2 coat proteins bound to yeast mRNAs block 5' to 3' degradation and trap mRNA decay products: implications for the localization of mRNAs by MS2-MCP system.</a> RNA. 21 (8), 1393-1395 (2015).</li><li>Bratu, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+beacons:+Fluorescent+probes+for+detection+of+endogenous+mRNAs+in+living+cells.">Molecular beacons: Fluorescent probes for detection of endogenous mRNAs in living cells.</a> Methods in Molecular Biology. 319, 1-14 (2006).</li><li>Bratu, D. P., Cha, B. J., Mhlanga, M. M., Kramer, F. R., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+the+distribution+and+transport+of+mRNAs+in+living+cells.">Visualizing the distribution and transport of mRNAs in living cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 100 (23), 13308-13313 (2003).</li><li>Tyagi, S., Kramer, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+beacons:+probes+that+fluoresce+upon+hybridization.">Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization.</a> Nature Biotechnology. 14 (3), 303-308 (1996).</li><li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+beacon-based+approach+for+live-cell+imaging+of+RNA+transcripts+with+minimal+target+engineering+at+the+single-molecule+level.">A molecular beacon-based approach for live-cell imaging of RNA transcripts with minimal target engineering at the single-molecule level.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1550 (2017).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+detection+of+microRNAs+by+combining+molecular+beacon+probes+with+T7+exonuclease-assisted+cyclic+amplification+reaction.">Multiplex detection of microRNAs by combining molecular beacon probes with T7 exonuclease-assisted cyclic amplification reaction.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (1), 107-114 (2017).</li><li>Baker, M. B., Bao, G., Searles, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+quantification+of+specific+microRNA+using+molecular+beacons.">In vitro quantification of specific microRNA using molecular beacons.</a> Nucleic Acids Research. 40 (2), e13 (2012).</li><li>Ko, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+color-tunable+molecular+beacon+to+sense+miRNA-9+expression+during+neurogenesis.">A color-tunable molecular beacon to sense miRNA-9 expression during neurogenesis.</a> Scientific Reports. 4, 4626 (2014).</li><li>Vet, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+detection+of+four+pathogenic+retroviruses+using+molecular+beacons.">Multiplex detection of four pathogenic retroviruses using molecular beacons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 96 (11), 6394-6399 (1999).</li><li>Li, J., Cao, Z. C., Tang, Z., Wang, K., Tan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+beacons+for+protein-DNA+interaction+studies.">Molecular beacons for protein-DNA interaction studies.</a> Methods in Molecular Biology. 429, 209-224 (2008).</li><li>Li, W. M., Chan, C. M., Miller, A. L., Lee, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+Functional+Roles+of+Molecular+Beacon+as+a+MicroRNA+Detector+and+Inhibitor.">Dual Functional Roles of Molecular Beacon as a MicroRNA Detector and Inhibitor.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (9), 3568-3580 (2017).</li><li>Kuang, T., Chang, L., Peng, X., Hu, X., Gallego-Perez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Beacon+Nano-Sensors+for+Probing+Living+Cancer+Cells.">Molecular Beacon Nano-Sensors for Probing Living Cancer Cells.</a> Trends in Biotechnology. 35 (4), 347-359 (2017).</li><li>Ban, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-genetic+Purification+of+Ventricular+Cardiomyocytes+from+Differentiating+Embryonic+Stem+Cells+through+Molecular+Beacons+Targeting+IRX-4.">Non-genetic Purification of Ventricular Cardiomyocytes from Differentiating Embryonic Stem Cells through Molecular Beacons Targeting IRX-4.</a> Stem Cell Reports. 5 (6), 1239-1249 (2015).</li><li>Hadjinicolaou, A. V., Demetriou, V. L., Emmanuel, M. A., Kakoyiannis, C. K., Kostrikis, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+beacon-based+real-time+PCR+detection+of+primary+isolates+of+Salmonella+Typhimurium+and+Salmonella+Enteritidis+in+environmental+and+clinical+samples.">Molecular beacon-based real-time PCR detection of primary isolates of Salmonella Typhimurium and Salmonella Enteritidis in environmental and clinical samples.</a> BMC Microbiology. 9, 97 (2009).</li><li>McLaughlin, J. M., Bratu, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+melanogaster+Oogenesis:+An+Overview.">Drosophila melanogaster Oogenesis: An Overview.</a> Methods in Molecular Biology. 1328, 1-20 (2015).</li><li>Bastock, R., St Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+oogenesis.">Drosophila oogenesis.</a> Current Biology. 18 (23), R1082-R1087 (2008).</li><li>Rongo, C., Gavis, E. R., Lehmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+oskar+RNA+regulates+oskar+translation+and+requires+Oskar+protein.">Localization of oskar RNA regulates oskar translation and requires Oskar protein.</a> Development. 121 (9), 2737-2746 (1995).</li><li>Mhlanga, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+colocalisation+of+oskar+mRNA+and+trans-acting+proteins+revealed+by+quantitative+imaging+of+the+Drosophila+oocyte.">In vivo colocalisation of oskar mRNA and trans-acting proteins revealed by quantitative imaging of the Drosophila oocyte.</a> PLoS One. 4 (7), e6241 (2009).</li><li>Bayer, L. V., Omar, O. S., Bratu, D. P., Catrina, I. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PinMol:+Python+application+for+designing+molecular+beacons+for+live+cell+imaging+of+endogenous+mRNAs.">PinMol: Python application for designing molecular beacons for live cell imaging of endogenous mRNAs.</a> bioRxiv. , (2018).</li><li>Marras, S. A., Kramer, F. R., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiencies+of+fluorescence+resonance+energy+transfer+and+contact-mediated+quenching+in+oligonucleotide+probes.">Efficiencies of fluorescence resonance energy transfer and contact-mediated quenching in oligonucleotide probes.</a> Nucleic Acids Research. 30 (21), e122 (2002).</li><li>Bratu, D. P., Catrina, I. E., Marras, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tiny+molecular+beacons+for+in+vivo+mRNA+detection.">Tiny molecular beacons for in vivo mRNA detection.</a> Methods in Molecular Biology. 714, 141-157 (2011).</li><li>Dean, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+(pulling)+of+needles+for+gene+delivery+by+microinjection.">Preparation (pulling) of needles for gene delivery by microinjection.</a> Cold Spring Harbor. 2006 (7), (2006).</li><li>Alami, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+transport+of+TDP-43+mRNA+granules+is+impaired+by+ALS-causing+mutations.">Axonal transport of TDP-43 mRNA granules is impaired by ALS-causing mutations.</a> Neuron. 81 (3), 536-543 (2014).</li><li>Jackson, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+Hairpin+DNA-Functionalized+Gold+Nanoparticles+for+Imaging+mRNA+in+Living+Cells.">Applications of Hairpin DNA-Functionalized Gold Nanoparticles for Imaging mRNA in Living Cells.</a> Methods in Enzymology. 572, 87-103 (2016).</li><li>Zimyanin, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+oskar+mRNA+transport+reveals+the+mechanism+of+posterior+localization.">In vivo imaging of oskar mRNA transport reveals the mechanism of posterior localization.</a> Cell. 134 (5), 843-853 (2008).</li><li>Catrina, I. E., Marras, S. A., Bratu, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tiny+molecular+beacons:+LNA/2'-O-methyl+RNA+chimeric+probes+for+imaging+dynamic+mRNA+processes+in+living+cells.">Tiny molecular beacons: LNA/2'-O-methyl RNA chimeric probes for imaging dynamic mRNA processes in living cells.</a> ACS Chemical Biology. 7 (9), 1586-1595 (2012).</li><li>Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+cytosolic+delivery+of+molecular+beacon+conjugates+and+flow+cytometric+analysis+of+target+RNA.">Efficient cytosolic delivery of molecular beacon conjugates and flow cytometric analysis of target RNA.</a> Nucleic Acids Research. 36 (12), e69 (2008).</li><li>Nitin, N., Santangelo, P. J., Kim, G., Nie, S., Bao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide-linked+molecular+beacons+for+efficient+delivery+and+rapid+mRNA+detection+in+living+cells.">Peptide-linked molecular beacons for efficient delivery and rapid mRNA detection in living cells.</a> Nucleic Acids Research. 32 (6), e58 (2004).</li><li>Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avoiding+false-positive+signals+with+nuclease-vulnerable+molecular+beacons+in+single+living+cells.">Avoiding false-positive signals with nuclease-vulnerable molecular beacons in single living cells.</a> Nucleic Acids Research. 35 (16), e105 (2007).</li><li>Bevilacqua, P. C., Ritchey, L. E., Su, Z., Assmann, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+Analysis+of+RNA+Secondary+Structure.">Genome-Wide Analysis of RNA Secondary Structure.</a> Annual Review of Genetics. 50, 235-266 (2016).</li><li>Mhlanga, M. M., Vargas, D. Y., Fung, C. W., Kramer, F. R., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=tRNA-linked+molecular+beacons+for+imaging+mRNAs+in+the+cytoplasm+of+living+cells.">tRNA-linked molecular beacons for imaging mRNAs in the cytoplasm of living cells.</a> Nucleic Acids Research. 33 (6), 1902-1912 (2005).</li><li>Eliceiri, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+imaging+software+tools.">Biological imaging software tools.</a> Nature Methods. 9 (7), 697-710 (2012).</li><li>Bolte, S., Cordelieres, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guided+tour+into+subcellular+colocalization+analysis+in+light+microscopy.">A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy.</a> Journal of Microscopy. 224 (Pt 3), 213-232 (2006).</li><li>Trcek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+germ+granules+are+structured+and+contain+homotypic+mRNA+clusters.">Drosophila germ granules are structured and contain homotypic mRNA clusters.</a> Nature Commununications. 6, 7962 (2015).</li></ol>

Восновенизация эндогенной мРНК в яичных камерах Drosophila опирается на использование специфических, эффективных и устойчивых к нуклеаде МБ, которые теперь могут быть легко разработаны с помощью программного обеспечения PinMol. МБ представляют собой специфические зонды, предназна?...

Исследования клеточной биологии, которые визуализируют динамические события с пространственным и временным разрешением, стали возможными благодаря развитию методов визуализации живых клеток на основе флуоресценции. В настоящее время, in vivo мРНК визуализация достигается с помощью технологий, которые основаны на РНК aptamer-белковых взаимодействий, РНК аптамер индуцированной флуоресценции органических красителей и нуклеиновой кислоты зонд annealing1,2, 3. Все они предлагают высокую специфичность, чувствительность и соотношение сигнала к фону. Тем не менее, РНК aptamer-ориентированных подходов требуют обширных генетических манипуляций, где трансген инженерии, чтобы выразить РНК с искусственными структурными мотивами, которые необходимы для белка или органических связывания красителя. Например, система MS2/MCP требует совместного выражения трансгена, выражающего конструкцию РНК, содержащую несколько тандемных повторов связывающей последовательности для белка покрытия бактериофага MS2 (MCP), и другого трансгена, кодирующего флуоресцентный белок сливается с MCP4,5. Добавление таких вторичных структурных мотивов в РНК, наряду с громоздким флуоресцентно помечены белка, вызвало опасения, что родные процессы РНК могут быть затронуты6. Технология, которая решает эту проблему и предлагает дополнительные уникальные преимущества, это подход на основе нуклеиновой кислоты, молекулярные маяки (МБ). МБ позволяют мультиплексное обнаружение эндогенных мРНК, дискриминацию однонуклеотидных вариаций ибыструю кинетику гибридизации с целевой мРНК 7,8. МБ являются олигонуклеотидных зондов, которые остаются в утоленной шпильки раза до прохождения фторгенных конформационных изменений, как только они гибридизируются к своим целям (Рисунок 1C)9. Несколько групп имели успех в использовании МБ для обнаружения как некодирующих РНК (микроРНК и lncRNAs)10,11,12,13, РНК ретровирусов14 и динамических ДНК-белков взаимодействия15. Они были успешно использованы для визуализации в различных организмах и тканях, таких как эмбрионы зебры16, нейроны13, опухолевая ткань17, дифференциационирование кардиомиоцитов18, и сальмонеллы 19.
Здесь мы описываем дизайн, доставка и обнаружение подход для эндогенных мРНК в жизни D. melanogaster яичные камеры в сочетании с микроскопией настройки, которая достаточно быстро, чтобы захватить динамический диапазон активного молекулярного транспорта. D. melanogaster яичная камера служила в качестве идеальной многоклеточной модели системы для широкого спектра исследований в области развития, от раннего зародышевой деления стволовых клеток и выражение материнского гена к поколению сегментарного плана тела20, 21. Яичные камеры легко изолированы, большие и полупрозрачные, и способны выдерживать часы анализа ex vivo, что делает их высоко поддаются воображению экспериментов. До активного перевода была проработана большая работа по асимметричной локализации материнских стенограмм в отдельные субклеточные области. В частности, локализация Оскарм мРНК и его последующий перевод на задний полюс ооцита должны происходить в строго регламентированной манере, чтобы избежать смертельного бидаудального эмбриона фенотипа22. Оскар мРНК транскрибируется в 15 зародышевых клеток, называемых клетками медсестры, и активно транспортируется через цитоплазмамические мосты, называемые кольцевыми каналами, в яйцеклетку, зародышевую клетку, которая становится зрелой яйцеклеткой и в конечном счете оплодотворяется (Рисунок 1A ). Значительный объем информации, уже имеющейся в отношении динамичного набора и обмена белковыми факторами и из Oskar mRNP, наряду с его дальними внутриклеточными поездками, делает Оскара предпочтительным кандидатом на учебу многие процессы жизненного цикла мРНК. МБ сыграли важную роль в раскрытии деталей о процессе локализации мРНК и расшифровке регуляции и функции белковых факторов, контролирующих перенос мРНК во время дрозофилы oogenesis. В частности, путем микроинъекцииЯ МБ в клетки медсестры и выполнения экспериментовпо визуализации живых клеток, отслеживание эндогенных мРНК возможно 8,23.
Представленная здесь дорожная карта предлагает шаги полного процесса, от проведения эксперимента по визуализации живых клеток с использованием МБ, получения данных изображений, до проведения анализа данных для отслеживания эндогенной мРНК в своей родной клеточной среде. Шаги могут быть изменены и дополнительно оптимизированы для удовлетворения потребностей исследователей, работающих с другими типами тканей/клеток в их собственной лабораторной обстановке.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Spectrofluorometer</td>
			<td>Fluoromax-4 Horiba-Jobin Yvon</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Photon counting spectrofluorometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz cuvette</td>
			<td>Fireflysci (former Precision Cells Inc.)</td>
			<td>701MFL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 tweezer</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501985</td>
			<td>Thin tweezers are very important to separate out the individual egg chambers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 700</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slip No.1 22 x 40mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Leica MZ6 Leica Microsystems Inc.</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 fruit fly anesthesia pad</td>
			<td>Genesee Scienific</td>
			<td>59-114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCL pH7.5</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1185-53-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning disc confocal microscope</td>
			<td>Leica DMI-4000B inverted microscope equipped with Yokogawa CSU 10 spinning disc Leica Microsystems Inc.</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamamatsu C9100-13 ImagEM EMCCD camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PatchMan NP 2 Micromanipulator</td>
			<td>Eppendorf Inc.</td>
			<td>920000037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FemtoJet Microinjector</td>
			<td>Eppendorf Inc.</td>
			<td>920010504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection needle: Femtotips II</td>
			<td>Eppendorf Inc.</td>
			<td>930000043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading tip: 20ul Microloader</td>
			<td>Eppendorf Inc.</td>
			<td>930001007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Cover glasses no. 1 or 1.5, 22x40mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-026; 48393-172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry yeast</td>
			<td>Any grocery store</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer, &#62; 20 GB RAM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Although processing can be carried out on most computers, higher capabilities will increase the speed of the processing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing and tracking endogenous mrnas in live drosophila melanogaster egg chambers

Методы визуализации на основе флуоресценции, в сочетании с разработками в области световой микроскопии, произвели революцию в том, как клеточные биологи проводят исследования живой визуализации клеток. Методы обнаружения РНК значительно расширились, так как семенные исследования связывали локализацию мРНК с регулированием экспрессии генов. Динамические процессы мРНК теперь могут быть визуализированы с помощью подходов, которые обнаруживают мРНК, в сочетании с микроскопией настройки, которые достаточно быстро, чтобы захватить динамический диапазон молекулярного поведения. Технология молекулярного маяка представляет собой подход, основанный на гибридизации, способный непосредственно обнаруживать эндогенные транскрипты в живых клетках. Молекулярные маяки - это шпильки, внутренне утопленные, однонуклеотидные дискриминирующих нуклеиновой кислоты зонды, которые флуоресцируют только при гибридизации в уникальную целевую последовательность. В сочетании с передовой флуоресценционной микроскопией и изображениями с высоким разрешением они позволяют выполнять пространственное и временное отслеживание внутриклеточного движения мРНК. Хотя эта технология является единственным методом, способным обнаруживать эндогенные транскрипты, клеточные биологи еще не полностью приняли эту технологию из-за трудностей в проектировании таких зондов для визуализации живых клеток. Новое программное приложение, PinMol, позволяет для расширения и быстрого проектирования зондов лучше всего подходит для эффективной гибридизации мРНК целевых регионов в живой клетке. Кроме того, высокое разрешение, приобретение изображений в реальном времени и текущее программное обеспечение для анализа изображений с открытым исходным кодом позволяют проводить уточненные данные, что позволяет более точно оценить сложность динамических процессов, лежащих в жизненном цикле мРНК.
Здесь мы представляем всеобъемлющий протокол для проектирования и доставки молекулярных маяков в Дрозофила меланогастер яйцеклеток. Прямое и высокоспецифическое обнаружение и визуализация эндогенных материнских мРНК осуществляется с помощью вращающейся дисковой конфокальной микроскопии. Данные визуализации обрабатываются и анализируются с помощью обнаружения и отслеживания объектов в программном обеспечении Icy для получения подробной информации о динамическом движении мРНК, которые транспортируются и локализуются в специализированные регионы в пределах яйцеклетки.

Используя PinMol,несколько МБ могут быть разработаны для одной цели мРНК (рисунок1B-C). После синтеза и очистки, выбранные МБ характеризуются и сравниваются с помощью анализа in vitro.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_up...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers at JoVE.com

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Здесь мы представляем протокол для визуализации, обнаружения, анализа и отслеживания эндогенной торговли мРНК в живой дрозофилальной меланогастерской яичной камере с использованием молекулярных маяков, вращающейся дисковой конфокальной микроскопии и анализа с открытым исходным кодом Программного обеспечения.

Визуализация и отслеживание эндогенных мРНК в Live Drosophila меланогастер яйцо палаты

Fluorescence-based imaging techniques, in combination with developments in light microscopy, have revolutionized how cell biologists conduct live cell ...

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области рнк биологии о механизме и функции поляризации РНК локализации. Основным преимуществом этой методики является то, что она позволяет в режиме реального времени визуализировать эндогенную РНК-торговлю живыми тканями. Последствия этого метода распространяются на терапию заболеваний, связанных с РНК, поскольку она имеет потенциал для выявления новых терапевтических целей.Хотя этот метод может дать представление о РНК-процессах в яичной камере плодовой мухи, он также может быть применен к другим системам, таким как зебрафиш или клетки культуры. Как правило, лица, новые для этого метода будет бороться из-за проблем, связанных с проектированием и поставкой молекулярного радиомаяка реквизита. Для микроинъекции молекулярного маяка выберите цель масла 40X и смонтировать крышку с расчлененной яичной камерой на стадии микроскопа.Найдите яичную камеру на средней и поздней стадии развития, которая правильно ориентирована на микроинъекцию. Затем навеяли микроинъектор с соответствующим давлением впрыска и компенсации. Используя джойстик микромипулятора, аккуратно опустите иглу, загруженную одним микролитером раствора молекулярного маяка, в масляную каплю.Сосредоточьте наконечник на периферии поля зрения. Выполните чистую функцию, чтобы удалить воздух из кончика иглы и обеспечить, чтобы есть поток из иглы и довести иглу до домашнего положения. Сосредоточьтесь на яичной камере, которая будет microinjected и принести иглу обратно в фокус вблизи края яичной камеры.Выполните тонкую регулировку z-позиции цели так, что мембрана, отделяющая клетки фолликула от клеток медсестры находится в фокусе. Вставьте иглу в клетку медсестры для инъекции молекулярных маяков в течение двух-пяти секунд. Чтобы обеспечить воспроизводимый успех микроинъекции, сосредоточьтесь на мембране, разделяющей клетки фолликула и клетки медсестры, которые будут введены, в то время как кончик иглы будет фокусирован с микро-манипулятором.Когда все молекулярные маяки были введены, осторожно удалить иглу и втягивать его в домашнее положение. Измените цель на желаемое увеличение для получения изображений. Затем сосредоточьтесь на яичной камере под новой целью и начните приобретение изображения.Для обнаружения месте молекулярных маяков, откройте изображения в изображении J.Use конвертировать в ICY инструмент для преобразования изображений обратно в ICY. Планка шкалы будет автоматически наложена на стек. При необходимости отредактировать планку масштаба через окно инспектора.Затем актививировать значок глаз для бара масштаба под вкладкой слоя, чтобы удалить планку шкалы из исходного стека. Выберите детектор обнаружения и отслеживания, обнаружения и обнаружения, а также подтвердите текущую последовательность обнаружения входных данных и нулевой канал для входных и предобработонные параметры соответственно. Для детектора выберите обнаружить яркое пятно на темном фоне, используя силовое использование 2D длин волн для 3D только в том случае, если в стеках недостаточно z-срезов для выполнения анализа.Выберите весы и чувствительность для каждой шкалы, добавляя больше весов для больших пятен и подтвердите, что область интереса из последовательности настроена для области интереса. Для фильтрации подтвердите, что фильтрация не была установлена, и выберите соответствующий формат файла в выходные время. Если результаты спот-детектора будут использоваться для отслеживания анализа, выберите экспорт в бассейн.Для анализа колокализации повторите обнаружение пятна для другого канала. Для отслеживания молекулярных пятен маяка выберите обнаружение и отслеживание, отслеживание, отслеживание пятен и запуск детектора пятен, используя те же параметры, что и для обнаружения пятен. Нажмите параметры оценки и выберите желаемое целевое движение в окне всплывающего окна оценки параметров.Затем нажмите запустить отслеживания. Чтобы визуализировать треки, выберите обнаружение и отслеживание, отслеживание и менеджер трека. Для процессора цветовой дорожки выберите включить и выбрать цвет для треков.Из добавить процессор трека, выберите трек процессора время клипа. В окне клипера чека введите количество обнаружений, которые будут показаны до и после текущей точки времени. Сохраните информацию о треке в качестве файла трека XML и используйте значок камеры для получения скриншота результатов.Чтобы проецировать стек по z-направлению, используйте планку поиска, чтобы найти плагин и выбрать максимальную проекцию из меню высадки. В окне инспектора выберите вкладку последовательности, холст и вращение, чтобы приспособить изображение к желаемой ориентации и получить скриншот повернутого изображения. Затем выберите область, представляющий интерес, 2D-регион, представляющий интерес, выберите область, представляющий интерес, и выберите область, интересную для изображения для обрезки.Установите плагин наложения таймштамп и добавьте таймштамп в соответствии с инструкциями во всплывающем окне для направления о том, как разместить и отформатировать таймштамп. Чтобы изменить или добавить интервал времени, нажмите редактировать в окне свойств последовательности. Активируйте значок глаза, чтобы добавить обратно планку масштаба под вкладку слоя в окне инспектора.Затем получить скриншот с метких результатов и сохранить изображение в обоих форматах TIFF и AVI. Используя этот метод, как было продемонстрировано, можно визуализировать модели транспортировки и локализации эндогенных мРНК с помощью молекулярных маяков на различных стадиях уогенеза и, в частности, в середине и после него. При индивидуальном введении в одной и той же стадии яичных камер, различные оскар конкретных молекулярных маяков представляют ту же модель локализации.Молекулярные маяки, вводимые в цитоплазму клетки медсестры, свободно рассеиваются в соседние клетки медсестры, а также в яйцеклетки. Таким образом, маяки способны гибридизироваться со своими целями и генерировать сигналы флуоресценции на других участках, помимо места микроинъекции. В оскар GFP трансгенных яичных камер в середине oogenesis, анализ данных о приобретении показывает обширную колокализацию для флуоресценции сигнала генетически модифицированных GFP помечены оскар мРНК с флуоресценции сигнала обнаружены с помощью молекулярных маяков.Кроме того, 5D стеки могут быть дополнительно проанализированы для определения траекторий оскар мРНК для транспортировки на большие расстояния как в клетке медсестры, так и в цитоплазме яйцеклеток. После своего развития, этот метод проложил путь для исследователей в области РНК биологии для изучения эндогенных материнской мРНК транспорта и локализации в яичной камере Drosophila.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Cell Biology

Biology

Unit 1

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Control of Gene Expression

SCIENTISTS IN ACTION

Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

Препарирование личинок ЦНС у дрозофилы

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

Видео высокого разрешения отслеживания передвижения у взрослых дрозофилы

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes

Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes

Визуализация Живая Drosophila Глиальные-нервно-мышечном соединении с флуоресцентными красителями

Our project identified GFP labeled glial structures at the developing larval fly neuromuscular synapse. To look at development of live glial-nerve-muscle ...

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

Визуализация бьющееся сердце в Drosophila</em

The Drosophila heart has recently emerged as a good model system for examining the genetic, cellular, and molecular mechanisms underlying function in ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Живая съемка Дрозофилы Эмбриональные миграции гемоцитов

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Изоляция Дрозофилы Семенники

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

Подготовка индивидуальных Drosophila Яйцо палат для работы с изображениями Онлайн

Live cell imaging is an important technique applied to a number of Drosophila tissues used as models to investigate topics such as axis specification, ...

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Измерение продолжительности жизни в<em&gt; Дрозофилы</em

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Живая съемка апоптоза клеток во время акции<em&gt; Drosophila</em&gt; Эмбриогенеза

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

Поддержание<em&gt; Дрозофилы</em&gt; Население Кейдж

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life ...