Name: visualizing and tracking endogenous mrnas in live drosophila melanogaster egg chambers
Uploaded: 2019-06-04T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers at JoVE.com

Agradecemos a Salvatore A.E. Marras (Centro del Instituto de Investigación de Salud Pública de la Universidad Rutgers) por la síntesis, etiquetado y purificación de balizas moleculares, y Daniel St Johnston (Instituto Gurdon, Universidad de Cambridge) por el oskar-MS2/ Stock de mosca transgénica MCP-GFP. Este trabajo fue apoyado por un Premio CAREER 1149738 de la Fundación Nacional de Ciencias y un Premio Del Congreso del Personal Profesional-CUNY a DPB.

1. Diseño de MBs para imágenes de células en vivo
<ol><li>
Doble la secuencia de ARN de destino para predecir la estructura secundaria del objetivo mRNA utilizando la "forma de ARN" del servidor mfold (http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/RNA-Folding-Form).
	<ol>
<li>Pegue/cargue la secuencia de destino en formato FASTA, seleccione una suboptisidad del 5 o 10% (estructuras con una energía libre de plegado dentro del 5 o 10% del valor MFE, respectivamente) y ajuste el número máximo de p...

<ol>
	<li>Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+RNA+distribution+and+dynamics+in+living+cells.">Imaging intracellular RNA distribution and dynamics in living cells.</a> Nature Methods. 6 (5), 331-338 (2009).</li><li>Bao, G., Rhee, W. J., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+probes+for+live-cell+RNA+detection.">Fluorescent probes for live-cell RNA detection.</a> Annual Reviews of Biomedical Engineering. 11, 25-47 (2009).</li><li>Mannack, L. V., Eising, S., Rentmeister, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+techniques+for+visualizing+RNA+in+cells.">Current techniques for visualizing RNA in cells.</a> F1000Research. 5, (2016).</li><li>Larson, D. R., Zenklusen, D., Wu, B., Chao, J. A., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+observation+of+transcription+initiation+and+elongation+on+an+endogenous+yeast+gene.">Real-time observation of transcription initiation and elongation on an endogenous yeast gene.</a> Science. 332 (6028), 475-478 (2011).</li><li>Bertrand, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+ASH1+mRNA+particles+in+living+yeast.">Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast.</a> Molecular Cell. 2 (4), 437-445 (1998).</li><li>Garcia, J. F., Parker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MS2+coat+proteins+bound+to+yeast+mRNAs+block+5'+to+3'+degradation+and+trap+mRNA+decay+products:+implications+for+the+localization+of+mRNAs+by+MS2-MCP+system.">MS2 coat proteins bound to yeast mRNAs block 5' to 3' degradation and trap mRNA decay products: implications for the localization of mRNAs by MS2-MCP system.</a> RNA. 21 (8), 1393-1395 (2015).</li><li>Bratu, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+beacons:+Fluorescent+probes+for+detection+of+endogenous+mRNAs+in+living+cells.">Molecular beacons: Fluorescent probes for detection of endogenous mRNAs in living cells.</a> Methods in Molecular Biology. 319, 1-14 (2006).</li><li>Bratu, D. P., Cha, B. J., Mhlanga, M. M., Kramer, F. R., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+the+distribution+and+transport+of+mRNAs+in+living+cells.">Visualizing the distribution and transport of mRNAs in living cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 100 (23), 13308-13313 (2003).</li><li>Tyagi, S., Kramer, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+beacons:+probes+that+fluoresce+upon+hybridization.">Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization.</a> Nature Biotechnology. 14 (3), 303-308 (1996).</li><li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+beacon-based+approach+for+live-cell+imaging+of+RNA+transcripts+with+minimal+target+engineering+at+the+single-molecule+level.">A molecular beacon-based approach for live-cell imaging of RNA transcripts with minimal target engineering at the single-molecule level.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1550 (2017).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+detection+of+microRNAs+by+combining+molecular+beacon+probes+with+T7+exonuclease-assisted+cyclic+amplification+reaction.">Multiplex detection of microRNAs by combining molecular beacon probes with T7 exonuclease-assisted cyclic amplification reaction.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (1), 107-114 (2017).</li><li>Baker, M. B., Bao, G., Searles, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+quantification+of+specific+microRNA+using+molecular+beacons.">In vitro quantification of specific microRNA using molecular beacons.</a> Nucleic Acids Research. 40 (2), e13 (2012).</li><li>Ko, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+color-tunable+molecular+beacon+to+sense+miRNA-9+expression+during+neurogenesis.">A color-tunable molecular beacon to sense miRNA-9 expression during neurogenesis.</a> Scientific Reports. 4, 4626 (2014).</li><li>Vet, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+detection+of+four+pathogenic+retroviruses+using+molecular+beacons.">Multiplex detection of four pathogenic retroviruses using molecular beacons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 96 (11), 6394-6399 (1999).</li><li>Li, J., Cao, Z. C., Tang, Z., Wang, K., Tan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+beacons+for+protein-DNA+interaction+studies.">Molecular beacons for protein-DNA interaction studies.</a> Methods in Molecular Biology. 429, 209-224 (2008).</li><li>Li, W. M., Chan, C. M., Miller, A. L., Lee, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+Functional+Roles+of+Molecular+Beacon+as+a+MicroRNA+Detector+and+Inhibitor.">Dual Functional Roles of Molecular Beacon as a MicroRNA Detector and Inhibitor.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (9), 3568-3580 (2017).</li><li>Kuang, T., Chang, L., Peng, X., Hu, X., Gallego-Perez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Beacon+Nano-Sensors+for+Probing+Living+Cancer+Cells.">Molecular Beacon Nano-Sensors for Probing Living Cancer Cells.</a> Trends in Biotechnology. 35 (4), 347-359 (2017).</li><li>Ban, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-genetic+Purification+of+Ventricular+Cardiomyocytes+from+Differentiating+Embryonic+Stem+Cells+through+Molecular+Beacons+Targeting+IRX-4.">Non-genetic Purification of Ventricular Cardiomyocytes from Differentiating Embryonic Stem Cells through Molecular Beacons Targeting IRX-4.</a> Stem Cell Reports. 5 (6), 1239-1249 (2015).</li><li>Hadjinicolaou, A. V., Demetriou, V. L., Emmanuel, M. A., Kakoyiannis, C. K., Kostrikis, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+beacon-based+real-time+PCR+detection+of+primary+isolates+of+Salmonella+Typhimurium+and+Salmonella+Enteritidis+in+environmental+and+clinical+samples.">Molecular beacon-based real-time PCR detection of primary isolates of Salmonella Typhimurium and Salmonella Enteritidis in environmental and clinical samples.</a> BMC Microbiology. 9, 97 (2009).</li><li>McLaughlin, J. M., Bratu, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+melanogaster+Oogenesis:+An+Overview.">Drosophila melanogaster Oogenesis: An Overview.</a> Methods in Molecular Biology. 1328, 1-20 (2015).</li><li>Bastock, R., St Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+oogenesis.">Drosophila oogenesis.</a> Current Biology. 18 (23), R1082-R1087 (2008).</li><li>Rongo, C., Gavis, E. R., Lehmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+oskar+RNA+regulates+oskar+translation+and+requires+Oskar+protein.">Localization of oskar RNA regulates oskar translation and requires Oskar protein.</a> Development. 121 (9), 2737-2746 (1995).</li><li>Mhlanga, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+colocalisation+of+oskar+mRNA+and+trans-acting+proteins+revealed+by+quantitative+imaging+of+the+Drosophila+oocyte.">In vivo colocalisation of oskar mRNA and trans-acting proteins revealed by quantitative imaging of the Drosophila oocyte.</a> PLoS One. 4 (7), e6241 (2009).</li><li>Bayer, L. V., Omar, O. S., Bratu, D. P., Catrina, I. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PinMol:+Python+application+for+designing+molecular+beacons+for+live+cell+imaging+of+endogenous+mRNAs.">PinMol: Python application for designing molecular beacons for live cell imaging of endogenous mRNAs.</a> bioRxiv. , (2018).</li><li>Marras, S. A., Kramer, F. R., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiencies+of+fluorescence+resonance+energy+transfer+and+contact-mediated+quenching+in+oligonucleotide+probes.">Efficiencies of fluorescence resonance energy transfer and contact-mediated quenching in oligonucleotide probes.</a> Nucleic Acids Research. 30 (21), e122 (2002).</li><li>Bratu, D. P., Catrina, I. E., Marras, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tiny+molecular+beacons+for+in+vivo+mRNA+detection.">Tiny molecular beacons for in vivo mRNA detection.</a> Methods in Molecular Biology. 714, 141-157 (2011).</li><li>Dean, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+(pulling)+of+needles+for+gene+delivery+by+microinjection.">Preparation (pulling) of needles for gene delivery by microinjection.</a> Cold Spring Harbor. 2006 (7), (2006).</li><li>Alami, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+transport+of+TDP-43+mRNA+granules+is+impaired+by+ALS-causing+mutations.">Axonal transport of TDP-43 mRNA granules is impaired by ALS-causing mutations.</a> Neuron. 81 (3), 536-543 (2014).</li><li>Jackson, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+Hairpin+DNA-Functionalized+Gold+Nanoparticles+for+Imaging+mRNA+in+Living+Cells.">Applications of Hairpin DNA-Functionalized Gold Nanoparticles for Imaging mRNA in Living Cells.</a> Methods in Enzymology. 572, 87-103 (2016).</li><li>Zimyanin, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+oskar+mRNA+transport+reveals+the+mechanism+of+posterior+localization.">In vivo imaging of oskar mRNA transport reveals the mechanism of posterior localization.</a> Cell. 134 (5), 843-853 (2008).</li><li>Catrina, I. E., Marras, S. A., Bratu, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tiny+molecular+beacons:+LNA/2'-O-methyl+RNA+chimeric+probes+for+imaging+dynamic+mRNA+processes+in+living+cells.">Tiny molecular beacons: LNA/2'-O-methyl RNA chimeric probes for imaging dynamic mRNA processes in living cells.</a> ACS Chemical Biology. 7 (9), 1586-1595 (2012).</li><li>Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+cytosolic+delivery+of+molecular+beacon+conjugates+and+flow+cytometric+analysis+of+target+RNA.">Efficient cytosolic delivery of molecular beacon conjugates and flow cytometric analysis of target RNA.</a> Nucleic Acids Research. 36 (12), e69 (2008).</li><li>Nitin, N., Santangelo, P. J., Kim, G., Nie, S., Bao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide-linked+molecular+beacons+for+efficient+delivery+and+rapid+mRNA+detection+in+living+cells.">Peptide-linked molecular beacons for efficient delivery and rapid mRNA detection in living cells.</a> Nucleic Acids Research. 32 (6), e58 (2004).</li><li>Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avoiding+false-positive+signals+with+nuclease-vulnerable+molecular+beacons+in+single+living+cells.">Avoiding false-positive signals with nuclease-vulnerable molecular beacons in single living cells.</a> Nucleic Acids Research. 35 (16), e105 (2007).</li><li>Bevilacqua, P. C., Ritchey, L. E., Su, Z., Assmann, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+Analysis+of+RNA+Secondary+Structure.">Genome-Wide Analysis of RNA Secondary Structure.</a> Annual Review of Genetics. 50, 235-266 (2016).</li><li>Mhlanga, M. M., Vargas, D. Y., Fung, C. W., Kramer, F. R., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=tRNA-linked+molecular+beacons+for+imaging+mRNAs+in+the+cytoplasm+of+living+cells.">tRNA-linked molecular beacons for imaging mRNAs in the cytoplasm of living cells.</a> Nucleic Acids Research. 33 (6), 1902-1912 (2005).</li><li>Eliceiri, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+imaging+software+tools.">Biological imaging software tools.</a> Nature Methods. 9 (7), 697-710 (2012).</li><li>Bolte, S., Cordelieres, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guided+tour+into+subcellular+colocalization+analysis+in+light+microscopy.">A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy.</a> Journal of Microscopy. 224 (Pt 3), 213-232 (2006).</li><li>Trcek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+germ+granules+are+structured+and+contain+homotypic+mRNA+clusters.">Drosophila germ granules are structured and contain homotypic mRNA clusters.</a> Nature Commununications. 6, 7962 (2015).</li></ol>

La visualización en vivo del tráfico endógeno de ARNm en cámaras de huevo Drosophila se basa en el uso de mBs específicos, eficientes y resistentes a la nucleasa, que ahora se pueden diseñar fácilmente con el software PinMol. Los MB son sondas específicas diseñadas para detectar secuencias únicas dentro de un ARNm de destino (preferiblemente regiones libres de estructura secundaria), lo que hace posible la detección altamente resuelta de una transcripción. La única limitación al adoptar es...

Los estudios de biología celular que visualizan eventos dinámicos con resolución espacial y temporal han sido posibles gracias al desarrollo de técnicas de imagen de células vivas basadas en fluorescencia. En la actualidad, la visualización in vivo de ARNm se logra a través de tecnologías basadas en interacciones de aptámero-proteína de ARN, fluorescencia inducida por aptámero de ARN de tintes orgánicos y recocido de la sonda de ácido nucleico1,2, 3. Todos ellos ofrecen alta especificidad, sensibilidad y relación señal-fondo. Sin embargo, los enfoques centrados en el ARN requieren una manipulación genética extensiva, donde un transgén está diseñado para expresar un ARN con motivos estructurales artificiales que son necesarios para la unión a proteínas o tintes orgánicos. Por ejemplo, el sistema MS2/MCP requiere la coexpresión de un transgén que exprese una construcción de ARN que contenga múltiples repeticiones en tándem de la secuencia de unión para la proteína de recubrimiento del bacteriófago MS2 (MCP), y otro transgén que codifica una proteína fluorescente fusionado con MCP4,5. La adición de estos motivos estructurales secundarios al ARN, junto con una proteína voluminosa con etiqueta fluorescente, ha suscitado preocupaciones de que los procesos de ARN nativos puedan verse afectados6. Una tecnología que aborda esta preocupación y ofrece ventajas únicas adicionales es el enfoque basado en ácido nucleico, balizas moleculares (MB). Los MB permiten la detección múltiplex de ARNm endógenos, la discriminación de variaciones de nucleótidos individuales y la rápida cinética de la hibridación con ARNm7objetivo,8. Los MF son sondas de oligonucleótidos que permanecen en un pliegue de horquilla apenada antes de someterse a un cambio de conformación fluorogénica una vez que hibridan a sus objetivos (Figura1C)9. Varios grupos han tenido éxito en el uso de MBs para detectar ARN no codificantes (microRNAs y lncRNAs)10,11,12,13, retrovirus de ARN14 y proteínas de ADN dinámicas interacciones15. Se han empleado con éxito para la toma de imágenes en diversos organismos y tejidos, tales como embriones de pez cebra16, neuronas13, tejido tumoral17, cardiomiocitos diferenciadores18,y Salmonella 19.
Aquí describimos el enfoque de diseño, entrega y detección de ARNm endógenos en cámaras de huevo D. melanogaster vivas junto con una configuración de microscopía que es lo suficientemente rápida como para capturar el rango dinámico del transporte molecular activo. La cámara de óvulos D. melanogaster ha servido como un sistema modelo multicelular ideal para una amplia gama de estudios de desarrollo, desde la división temprana de células madre germinales y la expresión génica materna hasta la generación de plan corporal segmentado20, 21. Las cámaras de huevo son fácilmente aisladas, grandes y translúcidas, y son capaces de soportar horas de análisis ex vivo, lo que las hace altamente susceptibles a experimentos de imágenes. Mucho trabajo se ha centrado en la localización asimétrica de transcripciones maternas a regiones subcelulares discretas antes de ser traducidas activamente. En particular, la localización del ARNm de oskar y su posterior traducción en el polo posterior del ovocitos deben producirse de manera estrictamente regulada para evitar un fenotipo22de embrión bicaudalletal letal. el ARNm de oskar se transcribe en las 15 células germinales, llamadas células de la barulgante, y se transporta activamente a través de puentes citoplásmicos, llamados canales de anillo, en el ovocitos, la célula germinal que se convierte en el óvulo maduro y, en última instancia, se fertiliza (Figura1A ). La considerable cantidad de información ya disponible sobre el reclutamiento dinámico y el intercambio de factores proteicos hacia y desde oskar mRNP, junto con sus viajes intracelulares de largo alcance, hacen de Oskar un candidato preferido para estudiar los muchos procesos del ciclo de vida del ARNm. Los MB han sido fundamentales para revelar detalles sobre el proceso de localización de ARNm y descifrar la regulación y función de los factores proteicos que controlan el transporte de ARNm durante la oogénesis de Drosophila. En particular, mediante la microinyección de MB en células de enfermería y la realización de experimentos de imágenes de células vivas, el seguimiento de los ARNm endógenos es posible8,23.
La hoja de ruta presentada aquí ofrece los pasos de un proceso completo, desde la realización de un experimento de imágenes de células en vivo utilizando MBs, la adquisición de datos de imágenes, hasta la realización de análisis de datos para realizar un seguimiento del ARNm endógeno en su entorno celular nativo. Los pasos se pueden modificar y optimizar aún más para satisfacer las necesidades de los investigadores que trabajan con otros tejidos/tipos de células dentro de su propio entorno de laboratorio.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Spectrofluorometer</td>
			<td>Fluoromax-4 Horiba-Jobin Yvon</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Photon counting spectrofluorometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz cuvette</td>
			<td>Fireflysci (former Precision Cells Inc.)</td>
			<td>701MFL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 tweezer</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501985</td>
			<td>Thin tweezers are very important to separate out the individual egg chambers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 700</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slip No.1 22 x 40mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Leica MZ6 Leica Microsystems Inc.</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 fruit fly anesthesia pad</td>
			<td>Genesee Scienific</td>
			<td>59-114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCL pH7.5</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1185-53-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning disc confocal microscope</td>
			<td>Leica DMI-4000B inverted microscope equipped with Yokogawa CSU 10 spinning disc Leica Microsystems Inc.</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamamatsu C9100-13 ImagEM EMCCD camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PatchMan NP 2 Micromanipulator</td>
			<td>Eppendorf Inc.</td>
			<td>920000037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FemtoJet Microinjector</td>
			<td>Eppendorf Inc.</td>
			<td>920010504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection needle: Femtotips II</td>
			<td>Eppendorf Inc.</td>
			<td>930000043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading tip: 20ul Microloader</td>
			<td>Eppendorf Inc.</td>
			<td>930001007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Cover glasses no. 1 or 1.5, 22x40mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-026; 48393-172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry yeast</td>
			<td>Any grocery store</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer, &#62; 20 GB RAM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Although processing can be carried out on most computers, higher capabilities will increase the speed of the processing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing and tracking endogenous mrnas in live drosophila melanogaster egg chambers

Las técnicas de diagnóstico por imágenes basadas en la fluorescencia, en combinación con los desarrollos de la microscopía ligera, han revolucionado la forma en que los biólogos celulares realizan estudios de imágenes de células vivas. Los métodos para detectar ARN se han ampliado considerablemente desde que los estudios seminales vincularon la localización de ARNm específica del sitio con la regulación de la expresión génica. Los procesos dinámicos de ARNm ahora se pueden visualizar a través de enfoques que detectan ARNm, junto con configuraciones de microscopía que son lo suficientemente rápidas como para capturar el rango dinámico de comportamiento molecular. La tecnología de baliza molecular es un enfoque basado en la hibridación capaz de detectar directamente transcripciones endógenas en células vivas. Las balizas moleculares son sondas de ácido nucleico con forma de horquilla, acondicionadas internamente y discriminantes de un solo nucleótido, que fluoran sólo tras la hibridación a una secuencia de diana única. Cuando se combina con microscopía de fluorescencia avanzada e imágenes de alta resolución, permiten realizar un seguimiento espacial y temporal del movimiento intracelular de ARNm. Aunque esta tecnología es el único método capaz de detectar transcripciones endógenas, los biólogos celulares aún no han adoptado completamente esta tecnología debido a las dificultades en el diseño de este tipo de sondas para la toma de imágenes de células vivas. Una nueva aplicación de software, PinMol,permite un diseño mejorado y rápido de las sondas más adecuadas para hibridar eficientemente a las regiones objetivo de ARNm dentro de una célula viva. Además, la adquisición de imágenes en tiempo real y el software de análisis de imágenes actual de código abierto permiten una salida de datos refinada, lo que conduce a una evaluación más fina de la complejidad subyacente a los procesos dinámicos involucrados en el ciclo de vida del ARNm.
Aquí presentamos un protocolo integral para diseñar y entregar balizas moleculares en cámaras de óvulos Drosophila melanogaster. La detección y visualización directa y muy específica de arNM maternos endógenos se realiza mediante microscopía confocal de disco giratorio. Los datos de imagen se procesan y analizan mediante la detección y seguimiento de objetos en el software Icy para obtener detalles sobre el movimiento dinámico de los ARNm, que se transportan y localizan a regiones especializadas dentro del ovocitos.

Usando PinMol, se pueden diseñar varios MM para un objetivo de ARNm (Figura1B-C). Después de la síntesis y purificación, los MB seleccionados se caracterizan y se comparan utilizando el análisis in vitro.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58545/58545fig1.jpg"> Figura 1: Técnica y descripción de tejidos para imágenes de células vi...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers at JoVE.com

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Aquí, presentamos un protocolo para la visualización, detección, análisis y seguimiento del tráfico endógeno de ARNm en cámara de óvulos Drosophila melanogaster en vivo utilizando balizas moleculares, microscopía confocal de disco giratorio y análisis de código abierto Software.

Visualización y seguimiento de ARNm endógenos en cámaras de huevo Drosophila melanogaster en vivo

Fluorescence-based imaging techniques, in combination with developments in light microscopy, have revolutionized how cell biologists conduct live cell ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología del ARN sobre el mecanismo y la función de la localización de ARN polarizado. La principal ventaja de esta técnica es que permite la visualización en tiempo real del tráfico endógeno de ARN en tejidos vivos. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia de enfermedades relacionadas con el ARN porque tiene un potencial para descubrir nuevas dianas terapéuticas.Aunque este método puede proporcionar información sobre los procesos de ARN en la cámara de huevo de mosca de la fruta, también se puede aplicar a otros sistemas como en peces cebra o células de cultivo. Generalmente, los individuos nuevos en este método lucharán debido a los desafíos asociados con el diseño y la entrega de los accesorios de la baliza molecular. Para la microinyección de baliza molecular, seleccione el objetivo de aceite 40X y monte un cubreobjetos con la cámara de huevo diseccionada en la etapa del microscopio.Localice una cámara de huevo en la etapa de desarrollo media tardía y tardía que esté correctamente orientada para la microinyección. A continuación, configure un microinyector con las presiones de inyección y compensación adecuadas. Con el joystick del micromantenerador, baje suavemente una aguja cargada con un microlitro de solución de baliza molecular en la gota de aceite.Ponga la punta en el foco hacia la periferia del campo de visión. Realice una función limpia para extraer el aire de la punta de la aguja y asegurarse de que haya flujo de la aguja y llevar la aguja a la posición de inicio. Concéntrese en la cámara de óvulo que se va a inyectar microinyecía y vuelva a enfocar la aguja cerca del borde de la cámara de huevo.Realice un ajuste fino de la posición z del objetivo de manera que la membrana que separa las células del folículo de las células de la enfermera esté enfocada. Inserte la aguja en una célula de enfermería para la inyección de las balizas moleculares durante un período de dos a cinco segundos. Para asegurar el éxito reproducible de la microinyección, concéntrese cuidadosamente en la membrana que separa las células del folículo y las células de la enfermera que se inyectarán mientras se en foco la punta de la aguja con el micro manipulador.Cuando se hayan inyectado todas las balizas moleculares, retire suavemente la aguja y retírela a la posición principal. Cambie el objetivo a la ampliación deseada para la adquisición de imágenes. A continuación, concéntrese en la cámara de huevos bajo el nuevo objetivo y comience la adquisición de la imagen.Para la detección de manchas de las balizas moleculares, abra las imágenes en La imagen J.Utilice la herramienta Convertir a ICY para convertir las imágenes a ICY. Una barra de escala se superpuesta automáticamente a la pila. Edite la barra de escala a través de la ventana del inspector según sea necesario.A continuación, desactive el icono de ojo de la barra de escala debajo de la pestaña de capa para eliminar la barra de escala de la pila original. Seleccione la detección y el seguimiento, la detección y el detector de puntos, y confirme que la detección de entrada de secuencia de corriente y el canal cero se seleccionan para los parámetros de entrada y preprocesamiento, respectivamente. Para el detector, seleccione detectar puntos brillantes sobre el fondo oscuro utilizando el uso de fuerza de longitudes de onda 2D para 3D solo si no hay suficientes cortes z en las pilas para realizar el análisis.Seleccione escalas y sensibilidad para cada escala agregando más escalas para puntos más grandes y confirme que la región de interés de la secuencia está establecida para la región de interés. Para filtrar, confirme que no se ha establecido ningún filtrado y seleccione el formato de archivo adecuado en la salida. Si los resultados del detector de puntos se van a utilizar para realizar un seguimiento del análisis, seleccione Exportar a piscina.Para el análisis de colocación, repita la detección de puntos para el otro canal. Para realizar un seguimiento de las manchas de baliza molecular, seleccione la detección y el seguimiento, el seguimiento, el seguimiento de puntos y ejecute el detector de puntos utilizando los mismos parámetros que para la detección de puntos. Haga clic en estimar parámetros y seleccione el movimiento de destino deseado en la ventana emergente de estimación de parámetros.A continuación, haga clic en Ejecutar seguimiento. Para visualizar las pistas, seleccione detección y seguimiento, seguimiento y gestor de seguimiento. Para el procesador de pistas de color, seleccione habilitar y seleccione un color para las pistas.En Agregar procesador de pistas, seleccione el clip de tiempo del procesador de seguimiento. En la ventana de la pinza de verificación, introduzca el número de detecciones que se mostrarán antes y después del punto de tiempo actual. Guarde la información de la pista como un archivo de pista XML y utilice el icono de la cámara para obtener una captura de pantalla de los resultados.Para proyectar la pila a lo largo de la dirección z, utilice la barra de búsqueda para encontrar el complemento y seleccione la proyección máxima en el menú desplegable. En la ventana del inspector, seleccione la pestaña de secuencia, el lienzo y la rotación para ajustar la imagen a la orientación deseada y obtener una captura de pantalla de la imagen girada. A continuación, seleccione la región de interés, la región 2D de interés, elija la forma de región de interés y seleccione la región de interés de la imagen para recortar.Instale el plugin de superposición de marca de tiempo y agregue una marca de tiempo siguiendo las instrucciones en la ventana emergente para obtener instrucciones sobre cómo colocar y formatear la marca de tiempo. Para cambiar o agregar el intervalo de tiempo, haga clic en editar en la ventana de propiedades de secuencia. Active el icono de ojo para volver a añadir la barra de escala debajo de la pestaña de capa en la ventana del inspector.A continuación, obtenga una captura de pantalla de los resultados con marca de tiempo y guarde la imagen en formatos TIFF y AVI. Utilizando este método como se ha demostrado, es posible visualizar los patrones de transporte y localización de los mRNas endógenos a través de balizas moleculares en varias etapas de la oogénesis y, en particular, en y después de la oogénesis media. Cuando se inyecta individualmente en las cámaras de huevo de la misma etapa, diferentes balizas moleculares específicas de oskar presentan el mismo patrón de localización.Las balizas moleculares inyectadas en el citoplasma de una célula de enfermería se difunden libremente en las células de enfermería adyacentes, así como en el citocito. Por lo tanto, las balizas son capaces de hibridirse con sus objetivos y generar señales de fluorescencia en otros sitios que no sean el sitio de microinyección. En las cámaras de óvulos transgénicas Oskar GFP a mediados de la oogénesis, el análisis de los datos de adquisición muestra una colocación extensa para la señal de fluorescencia de GFP genéticamente diseñada etiquetada con arnm de oskar con la señal de fluorescencia detectada mediante balizas moleculares.Además, las pilas 5D se pueden analizar más a fondo para determinar las trayectorias de ARNm de oskar para el transporte de larga distancia tanto en células de enfermera como en citoplasma de citocícito. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología del ARN exploraran el transporte endógeno del ARNm materno y la localización en la cámara de óvulos de Drosophila.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Cell Biology

Biology

Unit 1

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Control of Gene Expression

SCIENTISTS IN ACTION

Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

La disección del sistema nervioso central de larvas de Drosophila melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

Investigación

Biología

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

Vídeo de alta resolución de Seguimiento de la locomoción en adultos de Drosophila melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes

Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes

Visualizar el vivo Drosophila Gliales-unión neuromuscular con tintes fluorescentes

Our project identified GFP labeled glial structures at the developing larval fly neuromuscular synapse. To look at development of live glial-nerve-muscle ...

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

Visualizar el corazón latiendo en Drosophila</em

The Drosophila heart has recently emerged as a good model system for examining the genetic, cellular, and molecular mechanisms underlying function in ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Imágenes en directo de Drosophila melanogaster Migraciones hemocitos embrionarias

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

El aislamiento de Drosophila melanogaster Testículos

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

Preparación Individual Drosophila Huevos Cámaras de Imágenes en directo

Live cell imaging is an important technique applied to a number of Drosophila tissues used as models to investigate topics such as axis specification, ...

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Medición de la esperanza de vida en<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Imágenes de Apoptotic Liquidación de células vivas durante<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriogénesis

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

El mantenimiento de una<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Jaula Población

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life ...