Name: visualizing and tracking endogenous mrnas in live drosophila melanogaster egg chambers
Uploaded: 2019-06-04T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers at JoVE.com

Vi tackar Salvatore A.E. Marras (Public Health Research Institute Center, Rutgers University) för syntes, märkning och rening av molekylära beacons, och Daniel St Johnston (The Gurdon Institute, University of Cambridge) för Oskar-MS2/ MCP-GFP transgena flug bestånd. Detta arbete stöddes av en National Science Foundation CAREER Award 1149738 och en professionell personal kongress-CUNY Award till DPB.

1. utformning av MBs för levande cell avbildning
<ol><li>
Vik mål RNA-sekvensen för att förutsäga mRNA Target sekundära struktur med hjälp av "RNA form" från mfold server (http://unafold.RNA.Albany.edu/?q=mfold/RNA-Folding-form).
	<ol>
<li>Klistra in/Ladda upp målsekvensen i FASTA-format, Välj 5 eller 10% sub-optimality (strukturer med en fri energi av vikning inom 5 eller 10% av MFE-värdet, respektive), och justera det maximala antalet beräknade vikningar i enlighet därmed (t. ex...

<ol>
	<li>Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+RNA+distribution+and+dynamics+in+living+cells.">Imaging intracellular RNA distribution and dynamics in living cells.</a> Nature Methods. 6 (5), 331-338 (2009).</li><li>Bao, G., Rhee, W. J., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+probes+for+live-cell+RNA+detection.">Fluorescent probes for live-cell RNA detection.</a> Annual Reviews of Biomedical Engineering. 11, 25-47 (2009).</li><li>Mannack, L. V., Eising, S., Rentmeister, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+techniques+for+visualizing+RNA+in+cells.">Current techniques for visualizing RNA in cells.</a> F1000Research. 5, (2016).</li><li>Larson, D. R., Zenklusen, D., Wu, B., Chao, J. A., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+observation+of+transcription+initiation+and+elongation+on+an+endogenous+yeast+gene.">Real-time observation of transcription initiation and elongation on an endogenous yeast gene.</a> Science. 332 (6028), 475-478 (2011).</li><li>Bertrand, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+ASH1+mRNA+particles+in+living+yeast.">Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast.</a> Molecular Cell. 2 (4), 437-445 (1998).</li><li>Garcia, J. F., Parker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MS2+coat+proteins+bound+to+yeast+mRNAs+block+5'+to+3'+degradation+and+trap+mRNA+decay+products:+implications+for+the+localization+of+mRNAs+by+MS2-MCP+system.">MS2 coat proteins bound to yeast mRNAs block 5' to 3' degradation and trap mRNA decay products: implications for the localization of mRNAs by MS2-MCP system.</a> RNA. 21 (8), 1393-1395 (2015).</li><li>Bratu, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+beacons:+Fluorescent+probes+for+detection+of+endogenous+mRNAs+in+living+cells.">Molecular beacons: Fluorescent probes for detection of endogenous mRNAs in living cells.</a> Methods in Molecular Biology. 319, 1-14 (2006).</li><li>Bratu, D. P., Cha, B. J., Mhlanga, M. M., Kramer, F. R., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+the+distribution+and+transport+of+mRNAs+in+living+cells.">Visualizing the distribution and transport of mRNAs in living cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 100 (23), 13308-13313 (2003).</li><li>Tyagi, S., Kramer, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+beacons:+probes+that+fluoresce+upon+hybridization.">Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization.</a> Nature Biotechnology. 14 (3), 303-308 (1996).</li><li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+beacon-based+approach+for+live-cell+imaging+of+RNA+transcripts+with+minimal+target+engineering+at+the+single-molecule+level.">A molecular beacon-based approach for live-cell imaging of RNA transcripts with minimal target engineering at the single-molecule level.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1550 (2017).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+detection+of+microRNAs+by+combining+molecular+beacon+probes+with+T7+exonuclease-assisted+cyclic+amplification+reaction.">Multiplex detection of microRNAs by combining molecular beacon probes with T7 exonuclease-assisted cyclic amplification reaction.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (1), 107-114 (2017).</li><li>Baker, M. B., Bao, G., Searles, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+quantification+of+specific+microRNA+using+molecular+beacons.">In vitro quantification of specific microRNA using molecular beacons.</a> Nucleic Acids Research. 40 (2), e13 (2012).</li><li>Ko, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+color-tunable+molecular+beacon+to+sense+miRNA-9+expression+during+neurogenesis.">A color-tunable molecular beacon to sense miRNA-9 expression during neurogenesis.</a> Scientific Reports. 4, 4626 (2014).</li><li>Vet, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+detection+of+four+pathogenic+retroviruses+using+molecular+beacons.">Multiplex detection of four pathogenic retroviruses using molecular beacons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 96 (11), 6394-6399 (1999).</li><li>Li, J., Cao, Z. C., Tang, Z., Wang, K., Tan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+beacons+for+protein-DNA+interaction+studies.">Molecular beacons for protein-DNA interaction studies.</a> Methods in Molecular Biology. 429, 209-224 (2008).</li><li>Li, W. M., Chan, C. M., Miller, A. L., Lee, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+Functional+Roles+of+Molecular+Beacon+as+a+MicroRNA+Detector+and+Inhibitor.">Dual Functional Roles of Molecular Beacon as a MicroRNA Detector and Inhibitor.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (9), 3568-3580 (2017).</li><li>Kuang, T., Chang, L., Peng, X., Hu, X., Gallego-Perez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Beacon+Nano-Sensors+for+Probing+Living+Cancer+Cells.">Molecular Beacon Nano-Sensors for Probing Living Cancer Cells.</a> Trends in Biotechnology. 35 (4), 347-359 (2017).</li><li>Ban, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-genetic+Purification+of+Ventricular+Cardiomyocytes+from+Differentiating+Embryonic+Stem+Cells+through+Molecular+Beacons+Targeting+IRX-4.">Non-genetic Purification of Ventricular Cardiomyocytes from Differentiating Embryonic Stem Cells through Molecular Beacons Targeting IRX-4.</a> Stem Cell Reports. 5 (6), 1239-1249 (2015).</li><li>Hadjinicolaou, A. V., Demetriou, V. L., Emmanuel, M. A., Kakoyiannis, C. K., Kostrikis, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+beacon-based+real-time+PCR+detection+of+primary+isolates+of+Salmonella+Typhimurium+and+Salmonella+Enteritidis+in+environmental+and+clinical+samples.">Molecular beacon-based real-time PCR detection of primary isolates of Salmonella Typhimurium and Salmonella Enteritidis in environmental and clinical samples.</a> BMC Microbiology. 9, 97 (2009).</li><li>McLaughlin, J. M., Bratu, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+melanogaster+Oogenesis:+An+Overview.">Drosophila melanogaster Oogenesis: An Overview.</a> Methods in Molecular Biology. 1328, 1-20 (2015).</li><li>Bastock, R., St Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+oogenesis.">Drosophila oogenesis.</a> Current Biology. 18 (23), R1082-R1087 (2008).</li><li>Rongo, C., Gavis, E. R., Lehmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+oskar+RNA+regulates+oskar+translation+and+requires+Oskar+protein.">Localization of oskar RNA regulates oskar translation and requires Oskar protein.</a> Development. 121 (9), 2737-2746 (1995).</li><li>Mhlanga, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+colocalisation+of+oskar+mRNA+and+trans-acting+proteins+revealed+by+quantitative+imaging+of+the+Drosophila+oocyte.">In vivo colocalisation of oskar mRNA and trans-acting proteins revealed by quantitative imaging of the Drosophila oocyte.</a> PLoS One. 4 (7), e6241 (2009).</li><li>Bayer, L. V., Omar, O. S., Bratu, D. P., Catrina, I. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PinMol:+Python+application+for+designing+molecular+beacons+for+live+cell+imaging+of+endogenous+mRNAs.">PinMol: Python application for designing molecular beacons for live cell imaging of endogenous mRNAs.</a> bioRxiv. , (2018).</li><li>Marras, S. A., Kramer, F. R., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiencies+of+fluorescence+resonance+energy+transfer+and+contact-mediated+quenching+in+oligonucleotide+probes.">Efficiencies of fluorescence resonance energy transfer and contact-mediated quenching in oligonucleotide probes.</a> Nucleic Acids Research. 30 (21), e122 (2002).</li><li>Bratu, D. P., Catrina, I. E., Marras, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tiny+molecular+beacons+for+in+vivo+mRNA+detection.">Tiny molecular beacons for in vivo mRNA detection.</a> Methods in Molecular Biology. 714, 141-157 (2011).</li><li>Dean, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+(pulling)+of+needles+for+gene+delivery+by+microinjection.">Preparation (pulling) of needles for gene delivery by microinjection.</a> Cold Spring Harbor. 2006 (7), (2006).</li><li>Alami, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+transport+of+TDP-43+mRNA+granules+is+impaired+by+ALS-causing+mutations.">Axonal transport of TDP-43 mRNA granules is impaired by ALS-causing mutations.</a> Neuron. 81 (3), 536-543 (2014).</li><li>Jackson, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+Hairpin+DNA-Functionalized+Gold+Nanoparticles+for+Imaging+mRNA+in+Living+Cells.">Applications of Hairpin DNA-Functionalized Gold Nanoparticles for Imaging mRNA in Living Cells.</a> Methods in Enzymology. 572, 87-103 (2016).</li><li>Zimyanin, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+oskar+mRNA+transport+reveals+the+mechanism+of+posterior+localization.">In vivo imaging of oskar mRNA transport reveals the mechanism of posterior localization.</a> Cell. 134 (5), 843-853 (2008).</li><li>Catrina, I. E., Marras, S. A., Bratu, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tiny+molecular+beacons:+LNA/2'-O-methyl+RNA+chimeric+probes+for+imaging+dynamic+mRNA+processes+in+living+cells.">Tiny molecular beacons: LNA/2'-O-methyl RNA chimeric probes for imaging dynamic mRNA processes in living cells.</a> ACS Chemical Biology. 7 (9), 1586-1595 (2012).</li><li>Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+cytosolic+delivery+of+molecular+beacon+conjugates+and+flow+cytometric+analysis+of+target+RNA.">Efficient cytosolic delivery of molecular beacon conjugates and flow cytometric analysis of target RNA.</a> Nucleic Acids Research. 36 (12), e69 (2008).</li><li>Nitin, N., Santangelo, P. J., Kim, G., Nie, S., Bao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide-linked+molecular+beacons+for+efficient+delivery+and+rapid+mRNA+detection+in+living+cells.">Peptide-linked molecular beacons for efficient delivery and rapid mRNA detection in living cells.</a> Nucleic Acids Research. 32 (6), e58 (2004).</li><li>Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avoiding+false-positive+signals+with+nuclease-vulnerable+molecular+beacons+in+single+living+cells.">Avoiding false-positive signals with nuclease-vulnerable molecular beacons in single living cells.</a> Nucleic Acids Research. 35 (16), e105 (2007).</li><li>Bevilacqua, P. C., Ritchey, L. E., Su, Z., Assmann, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+Analysis+of+RNA+Secondary+Structure.">Genome-Wide Analysis of RNA Secondary Structure.</a> Annual Review of Genetics. 50, 235-266 (2016).</li><li>Mhlanga, M. M., Vargas, D. Y., Fung, C. W., Kramer, F. R., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=tRNA-linked+molecular+beacons+for+imaging+mRNAs+in+the+cytoplasm+of+living+cells.">tRNA-linked molecular beacons for imaging mRNAs in the cytoplasm of living cells.</a> Nucleic Acids Research. 33 (6), 1902-1912 (2005).</li><li>Eliceiri, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+imaging+software+tools.">Biological imaging software tools.</a> Nature Methods. 9 (7), 697-710 (2012).</li><li>Bolte, S., Cordelieres, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guided+tour+into+subcellular+colocalization+analysis+in+light+microscopy.">A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy.</a> Journal of Microscopy. 224 (Pt 3), 213-232 (2006).</li><li>Trcek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+germ+granules+are+structured+and+contain+homotypic+mRNA+clusters.">Drosophila germ granules are structured and contain homotypic mRNA clusters.</a> Nature Commununications. 6, 7962 (2015).</li></ol>

Live visualisering av endogena mRNA handel i Drosophila Egg Chambers förlitar sig på användning av specifika, effektiva, och Nuclease-resistenta MBS, som nu kan enkelt utformas med pinmol programvara. MBs är specifika sonder som utformats för att upptäcka unika sekvenser inom en Target mRNA (helst regioner som är fria från sekundär struktur), vilket gör möjligt mycket löst detektering av en avskrift. Den enda begränsningen vid antagande av denna teknik/protokoll för andra vävnader/celltyp...

Cellbiologi studier som visualiserar dynamiska händelser med rumslig och tidsmässig upplösning har möjliggjorts genom utveckling av fluorescensbaserade tekniker för levande cell avbildning. För närvarande, in vivo mRNA visualisering uppnås via teknik som är baserade på RNA aptamer-proteininteraktioner, RNA aptamer-inducerad fluorescens av organiska färgämnen och nukleinsyra sond glödgning1,2, 3. de erbjuder alla hög specificitet, känslighet och signal-till-bakgrund förhållande. Men RNA aptamer-centrerad metoder kräver omfattande genetisk manipulation, där en transgenens är konstruerad för att uttrycka ett RNA med konstgjorda strukturella motiv som krävs för protein eller organiska färgämnes bindning. Till exempel kräver MS2/MCP-systemet ett co-Expression av en transgenens som uttrycker en RNA-konstruktion som innehåller flera tandem upprepningar av bindningssekvens för bakteriofagen MS2 Coat protein (MCP), och en annan transgenens som kodar för ett fluorescerande protein smält till MCP4,5. Tillsatsen av sådana sekundära strukturella motiv till RNA, tillsammans med en skrymmande Fluorescent märkta protein, har väckt farhågor om att infödda RNA processer kan påverkas6. En teknik som tar itu med denna oro och erbjuder ytterligare unika fördelar är den nukleinsyra-baserade metoden, molekylära beacons (MBs). MBS möjliggör multiplex detektion av endogena mRNA, diskriminering av enstaka nukleotid variationer, och snabb kinetik av hybridisering med mål mrná7,8. MBs är oligonukleotid sonder som stannar kvar i en släckt hårnål gånger innan de genomgår en fluorogena konformationsförändring när de hybridisera sina mål (figur 1c)9. Flera grupper har haft framgång med att använda MBS för att detektera både icke-kodning av rnas (micrornas och lncrnas)10,11,12,13, RNA retrovirus14 och Dynamic DNA-protein interaktioner15. De har framgångsrikt använts för avbildning i olika organismer och vävnader, såsom zebrafiskar embryon16, nervceller13, tumör vävnad17, differentiera kardiomyocyter18, och salmonella 19.
Här beskriver vi utformningen, leveransen och detekterings metoden för endogena mRNAs i Living D. melanogaster ägg kammare tillsammans med en mikroskopi set-up som är tillräckligt snabb för att fånga det dynamiska utbudet av aktiva molekylära transporter. D. melanogaster Egg Chamber har fungerat som ett idealiskt flercelliga modellsystem för ett brett spektrum av utvecklingsstudier, från tidig köns cells stamcells Division och moderns genuttryck till generering av segmentell Body plan20, 21. Egg Chambers är lätt isolerade, stora och genomskinliga, och kan motstå timmar av ex vivo analys, vilket gör dem mycket mottagliga för Imaging experiment. Mycket arbete har fokuserat på asymmetrisk lokalisering av maternella utskrifter till diskreta subcellulära regioner innan de aktivt översätts. I synnerhet måste Oskar mRNA lokalisering och dess efterföljande översättning vid äggcell-stolpen ske på ett tätt reglerat sätt för att undvika en dödlig bicaudal embryonal fenotyp22. Oskar mRNA transkriberas i de 15 köns cells cellerna, kallas sjuksköterska celler, och aktivt transporteras genom cytoplasmiska broar, kallas ring kanaler, in i äggcell, den köns cells cellen som blir det mogna ägget och slutligen befruktas (figur 1a ). Den avsevärda mängd information som redan finns tillgänglig om den dynamiska rekryteringen och utbytet av protein faktorer till och från Oskar mRNP, tillsammans med dess långväga intracellulära resor, gör Oskar till föredragen kandidat för att studera de många processerna i mRNA livscykel. MBs har varit avgörande för att avslöja detaljer om processen för mRNA lokalisering och dechiffrera regleringen och funktionen av protein faktorer som styr mRNA transport under Drosophila oogenesis. I synnerhet genom att mikroinjicera MBS i sjuksköterska celler och utföra levande cell Imaging experiment, spårning av endogena mrnas är möjligt8,23.
Den färdplan som presenteras här erbjuder stegen i en komplett process, från att utföra en levande cell Imaging experiment med MBs, förvärva Imaging data, att utföra dataanalys för att spåra endogena mRNA i sin inhemska cellulära miljö. Stegen kan modifieras och optimeras ytterligare för att tillgodose behoven hos forskare som arbetar med andra vävnader/celltyper inom sin egen laboratoriemiljö.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Spectrofluorometer</td>
			<td>Fluoromax-4 Horiba-Jobin Yvon</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Photon counting spectrofluorometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz cuvette</td>
			<td>Fireflysci (former Precision Cells Inc.)</td>
			<td>701MFL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 tweezer</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501985</td>
			<td>Thin tweezers are very important to separate out the individual egg chambers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 700</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slip No.1 22 x 40mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Leica MZ6 Leica Microsystems Inc.</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 fruit fly anesthesia pad</td>
			<td>Genesee Scienific</td>
			<td>59-114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCL pH7.5</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1185-53-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning disc confocal microscope</td>
			<td>Leica DMI-4000B inverted microscope equipped with Yokogawa CSU 10 spinning disc Leica Microsystems Inc.</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamamatsu C9100-13 ImagEM EMCCD camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PatchMan NP 2 Micromanipulator</td>
			<td>Eppendorf Inc.</td>
			<td>920000037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FemtoJet Microinjector</td>
			<td>Eppendorf Inc.</td>
			<td>920010504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection needle: Femtotips II</td>
			<td>Eppendorf Inc.</td>
			<td>930000043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading tip: 20ul Microloader</td>
			<td>Eppendorf Inc.</td>
			<td>930001007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Cover glasses no. 1 or 1.5, 22x40mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-026; 48393-172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry yeast</td>
			<td>Any grocery store</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer, &#62; 20 GB RAM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Although processing can be carried out on most computers, higher capabilities will increase the speed of the processing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing and tracking endogenous mrnas in live drosophila melanogaster egg chambers

Fluorescence-baserade avbildningstekniker, i kombination med utvecklingen i ljusmikroskopi, har revolutionerat hur cell biologer genomföra levande cell avbildning studier. Metoder för att upptäcka rnas har expanderat kraftigt sedan nyskapande studier länkade platsspecifika mRNA lokalisering till gen uttrycks reglering. Dynamiska mRNA-processer kan nu visualiseras via metoder som detekterar mRNAs, tillsammans med mikroskopiuppställningar som är tillräckligt snabba för att fånga det dynamiska utbudet av molekylära beteenden. Molekylär Beacon Technology är en hybridisering-baserad metod som kan direkt detektering av endogena utskrifter i levande celler. Molekylära fyrar är hårnål-formad, internt släckt, single-nucleotide diskriminerande nukleinsyra sonder, som fluorescerar endast vid hybridisering till en unik målsekvens. I kombination med avancerad fluorescens-mikroskopi och högupplöst avbildning gör de det möjligt för en att utföra rumslig och tidsmässig spårning av mRNAs-intracellulär rörelse. Även om denna teknik är den enda metod som kan upptäcka endogena utskrifter, har cell biologer ännu inte helt anammat denna teknik på grund av svårigheter att utforma sådana sonder för levande cell avbildning. En ny programvara applikation, Pinmol, möjliggör förbättrad och snabb design av sonder bäst lämpade för att effektivt hybridisera till mRNA mål regioner inom en levande cell. Dessutom, högupplöst, realtid bild förvärv och nuvarande, öppen källkod bildanalysprogram vara möjliggör en raffinerad dataproduktion, vilket leder till en finare utvärdering av komplexiteten bakom de dynamiska processer som ingår i mRNA livscykel.
Här presenterar vi ett omfattande protokoll för att designa och leverera molekylära beacons till Drosophila melanogaster Egg Chambers. Direkt och mycket specifik detektion och visualisering av endogena maternell mRNAs utförs via spinning Disc konfokalmikroskopi. Imaging data bearbetas och analyseras med hjälp av objektdetektering och spårning i isiga programvara för att få information om den dynamiska rörelsen hos mRNAs, som transporteras och lokaliseras till specialiserade regioner inom äggocyten.

Med Pinmolkan flera MBS utformas för ett mRNA-mål (figur 1b-C). Efter syntes och rening, de valda MBs kännetecknas och jämförs med in vitro-analys.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58545/58545fig1.jpg"> Figur 1: teknik-och vävnads beskrivning för levande cell avbildning av endogena mRNAs. Aavbildning av e...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers at JoVE.com

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Här presenterar vi ett protokoll för visualisering, detektering, analys och spårning av endogent mRNA-handel i levande Drosophila melanogaster ägg kammare med hjälp av molekylära beacons, spinning Disc konfokalmikroskopi, och öppen källkod analys Programvara.

Visualisera och spåra endogena mRNAs i levande Drosophila melanogaster ägg kammare

Fluorescence-based imaging techniques, in combination with developments in light microscopy, have revolutionized how cell biologists conduct live cell ...

Denna metod kan hjälpa till att besvara viktiga frågor i RNA biologi området om mekanismen och funktionen av polariserade RNA lokalisering. Den största fördelen med denna teknik är att det möjliggör realtid visualisering av endogena RNA-handel med levande vävnader. Konsekvenserna av denna teknik sträcker sig mot terapi av RNA-relaterade sjukdomar eftersom det har en potential att avslöja nya terapeutiska mål.Även om denna metod kan ge insikt i RNA-processer i fruktflugeäggkammaren, kan den också tillämpas på andra system som i zebrafiskar eller odlingsceller. Generellt, individer nya till denna metod kommer att kämpa på grund av de utmaningar som är förknippade med utformning och leverans av molekylära beacon rekvisita. För molekylär beacon mikroinjection, välj 40X olja mål och montera en coverslip med dissekerade äggkammaren på mikroskopet scenen.Lokalisera en äggkammare i mitten till sent utvecklingsstadium som är korrekt orienterad för mikroinjektion. Sätt sedan upp en mikroinjektor med lämpliga injektions- och kompensationstryck. Med hjälp av mikro manipulator joystick, försiktigt sänka en nål laddad med en mikroliter av molekylär beacon lösning i oljedroppet.Sätt spetsen i fokus mot synfältets periferi. Utför en ren funktion för att avlägsna luften från nålspetsen och för att säkerställa att det finns flöde från nålen och föra nålen till hemmapositionen. Fokusera på äggkammaren som ska mikroinjecteras och föra nålen tillbaka i fokus nära äggkammarens kant.Utför en finjustering av z-positionen för målsättningen så att membranet som separerar follikelscellerna från sjuksköterskecellerna är i fokus. Sätt in nålen i en sjuksköterska cell för injektion av molekylära fyrar under en period av två till fem sekunder. För att säkerställa reproducerbar mikroinjektion framgång, fokusera noga på membranet separerar follikelceller och sjuksköterska celler som kommer att injiceras samtidigt som spetsen på nålen i fokus med mikro manipulatorn.När alla molekylära fyrar har injicerats, försiktigt bort nålen och dra tillbaka den till hemläge. Ändra målsättningen till önskad förstoring för bildinhämtning. Fokusera sedan på äggkammaren under det nya målet och påbörja bildförvärvet.För spotdetektering av de molekylära beaconsna, öppna bilderna i Bild J.Använd verktyget konvertera till ICY för att konvertera bilderna tillbaka till ICY. En skala bar kommer automatiskt överlagras på stacken. Redigera skalningsfältet via inspektörsfönstret vid behov.Inaktivera sedan ögonikonen för skallisten under lagerfliken för att ta bort skallisten från originalstacken. Välj identifiering och spårning, detektering och dekordetektor, och bekräfta aktuell sekvensinmatningsdetektering och kanal nolla väljs för in- och förbearbetningsparametrarna respektive. För detektor, välj detektera ljuspunkt över mörk bakgrund med hjälp av kraftanvändning av 2D-våglängder för 3D endast om det inte finns tillräckligt med z-skivor i staplarna för att utföra analysen.Välj skalor och känslighet för varje skala lägga till fler skalor för större fläckar och bekräfta att region av intresse från sekvens är inställd för region av intresse. För filtrering bekräftar du att ingen filtrering har ställts in och välj lämpligt filformat under utdata. Om dekordetektorns resultat ska användas för spårningsanalys väljer du export till simbassäng.För colocalization analys, upprepa platsidentifiering för den andra kanalen. För att spåra de molekylära beacon-fläckarna väljer du detektering och spårning, spårning, dekorspårning och kör dekordetektorn med samma parametrar som för spotdetekteringen. Klicka på uppskatta parametrar och välj önskad målrörelse i fönstret parameters estimation popup.Klicka sedan på körspårning. Om du vill visualisera spåren väljer du identifiering och spårning, spårning och spårhanterare. För färgspårsprocessor väljer du aktivera och väljer en färg för spåren.Från Lägg till spårprocessor väljer du tidsklipp för spårprocessorer. I fönstret check clipper anger du antalet identifieringar som ska visas före och efter den aktuella tidspunkten. Spara spårinformationen som en XML-spårfil och använd kameraikonen för att få en skärmbild av resultaten.För att projicera stacken längs z-riktningen använder du sökfältet för att hitta insticksprogrammet och välj maximal projektion från dropdown-menyn. I inspektörsfönstret väljer du sekvensfliken, arbetsytan och rotationen för att justera bilden efter önskad orientering och få en skärmbild av den roterade bilden. Välj sedan region av intresse, 2D region av intresse, välj region av intresse form och välj region av intresse på bilden för beskärning.Installera timestamp overlay plugin och lägga till en tidsstämpel följer instruktionerna i popup fönstret för vägbeskrivning om hur man placerar och formatera tidsstämpeln. Om du vill ändra eller lägga till tidsintervallet klickar du på Redigera i fönstret för sekvensegenskaper. Aktivera ögonikonen för att lägga tillbaka skalningslisten under lagerfliken i inspektörsfönstret.Skaffa sedan en skärmdump av de tidsstämplingsresultat och spara bilden i både TIFF- och AVI-format. Med denna metod som visat, är det möjligt att visualisera transport och lokalisering mönster av endogena mRNAs via molekylära beacons i olika stadier av oogenesis och i synnerhet vid och efter mitten oogenesis. När individuellt injiceras i samma skede äggkammare, olika oskar specifika molekylära fyrar presentera samma mönster av lokalisering.Molekylära fyrar injiceras i cytoplasman i en sjuksköterska cell kommer fritt diffusa i intilliggande sjuksköterska celler samt i äggcell. Således är fyrar kunna hybridisera med sina mål och generera fluorescens signaler på andra platser än microinjection webbplats. I oskar GFP transgena ägg kammare i mitten oogenesis, analys av förvärvet data visar omfattande colocalization för fluorescens signalen av genetiskt modifierade GFP taggade oskar mRNA med fluorescens signalen upptäcks med hjälp av molekylära fyrar.Dessutom kan 5D-stackar analyseras ytterligare för att bestämma oskar mRNA-banor för långväga transport i både sjuksköterska cell och äggceller cytoplasma. Efter dess utveckling banade denna teknik vägen för forskare inom RNA-biologi att utforska endogena moderns mRNA transport och lokalisering i Drosophila äggkammare.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Cell Biology

Biology

Unit 1

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Control of Gene Expression

SCIENTISTS IN ACTION

Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

Dissekering av Larvernas CNS i Drosophila melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

Högupplöst video Spårning av rörelseorgan hos vuxna Drosophila melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes

Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes

Visualisera Live Drosophila Gliaceller-neuromuskulära förbindelsen med fluorescerande färger

Our project identified GFP labeled glial structures at the developing larval fly neuromuscular synapse. To look at development of live glial-nerve-muscle ...

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

Visualisera bultande hjärta i Drosophila</em

The Drosophila heart has recently emerged as a good model system for examining the genetic, cellular, and molecular mechanisms underlying function in ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Live avbildning av Drosophila melanogaster Embryonala Hemocyte Flyttningar

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Isolering av Drosophila melanogaster Testiklar

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

Framställning av individuella Drosophila Egg Chambers för Live Imaging

Live cell imaging is an important technique applied to a number of Drosophila tissues used as models to investigate topics such as axis specification, ...

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Mätning av livslängden i<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live avbildning av Apoptotic Cell Utförsäljning under<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenesis

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

Underhåll av en<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Befolkning Cage

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life ...