Name: a purification and in vitro activity assay for a (p)ppgpp synthetase from clostridium difficile
Uploaded: 2018-11-03T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Purification and In Vitro Activity Assay for a pppGpp Synthetase from Clostridium difficile at JoVE.com

تم تمويل هذا العمل من نييد 1K22AI118929-01. وأيد EBP "الصيف زمالة برنامج منحة بحثية" من "مكتب بحوث" جامعة القديمة دومينيون، نورفولك، فيرجينيا، الولايات المتحدة الأمريكية.

1-إيندوسيبلي أوفيريكسبريشن بروتين الحامض الأميني معلم
<ol><li>تضخيم rsh من جيم R20291 الحمض النووي.<ol>
<li>استخدام بوليميريز عالية الدقة واتبع إرشادات الشركة المصنعة.</li>
		<li>تضخيم rsh جيم باستخدام أجهزة الإشعال rsh_F (كريسجتاككجتاتاتجكاتجاتااجاتاكاج) و rsh_R (CCكتجكاج...

<ol>
	<li>Cheek, S., Ginalski, K., Zhang, H., Grishin, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+update+of+the+sequence+and+structure+classification+of+kinases.">A comprehensive update of the sequence and structure classification of kinases.</a> BMC Structural Biology. 5 (1), 6 (2005).</li><li>Porath, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilized+metal+ion+affinity+chromatography.">Immobilized metal ion affinity chromatography.</a> Protein Expression and Purification. 3 (4), 263-281 (1992).</li><li>Arnau, J., Lauritzen, C., Pedersen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+strategy,+production+and+purification+of+proteins+with+exopeptidase-cleavable+His-tags.">Cloning strategy, production and purification of proteins with exopeptidase-cleavable His-tags.</a> Nature Protocols. 1 (5), 2326-2333 (2006).</li><li>Porath, J., Carlsson, J., Olsson, I., Belfrage, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal+chelate+affinity+chromatography,+a+new+approach+to+protein+fractionation.">Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation.</a> Nature. 258 (5536), 598-599 (1975).</li><li>Smith, M. C., Furman, T. C., Ingolia, T. D., Pidgeon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chelating+peptide-immobilized+metal+ion+affinity+chromatography.+A+new+concept+in+affinity+chromatography+for+recombinant+proteins.">Chelating peptide-immobilized metal ion affinity chromatography. A new concept in affinity chromatography for recombinant proteins.</a> Journal of Biological Chemistry. 263 (15), 7211-7215 (1988).</li><li>Graslund, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+production+and+purification.">Protein production and purification.</a> Nature Methods. 5 (2), 135-146 (2008).</li><li>Booth, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+an+N-terminal+Polyhistidine+Tag+on+Protein+Thermal+Stability.">Impact of an N-terminal Polyhistidine Tag on Protein Thermal Stability.</a> ACS Omega. 3 (1), 760-768 (2018).</li><li>Thielges, M. C., Chung, J. K., Axup, J. Y., Fayer, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+histidine+tag+attachment+on+picosecond+protein+dynamics.">Influence of histidine tag attachment on picosecond protein dynamics.</a> Biochemistry. 50 (25), 5799-5805 (2011).</li><li>Chaga, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Twenty-five+years+of+immobilized+metal+ion+affinity+chromatography:+past,+present+and+future.">Twenty-five years of immobilized metal ion affinity chromatography: past, present and future.</a> Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 49 (1-3), 313-334 (2001).</li><li>Ma, H., Deacon, S., Horiuchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+challenge+of+selecting+protein+kinase+assays+for+lead+discovery+optimization.">The challenge of selecting protein kinase assays for lead discovery optimization.</a> Expert opinion on drug discovery. 3 (6), 607-621 (2008).</li><li>Tamayo, R., Tischler, A. D., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+EAL+domain+protein+VieA+is+a+cyclic+diguanylate+phosphodiesterase.">The EAL domain protein VieA is a cyclic diguanylate phosphodiesterase.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (39), 33324-33330 (2005).</li><li>Purcell, E. B., McKee, R. W., McBride, S. M., Waters, C. M., Tamayo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+Diguanylate+Inversely+Regulates+Motility+and+Aggregation+in+Clostridium+difficile.">Cyclic Diguanylate Inversely Regulates Motility and Aggregation in Clostridium difficile.</a> Journal of Bacteriology. 194 (13), 3307-3316 (2012).</li><li>Purcell, E. B., Tamayo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+cyclic+nucleotide+phosphodiesterases.">Identification and characterization of cyclic nucleotide phosphodiesterases.</a> Methods in Molecular Biology. 1016, 235-243 (2013).</li><li>Ross, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+cellulose+synthesis+Acetobacter+xylinum.+A+unique+guanyl+oligonucleotide+is+the+immediate+activator+of+the+cellulose+synthase.">Control of cellulose synthesis Acetobacter xylinum. A unique guanyl oligonucleotide is the immediate activator of the cellulose synthase.</a> Carbohydrate Research. 149 (1), 101-117 (1986).</li><li>Potrykus, K., Cashel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=(p)ppGpp:+still+magical?.">(p)ppGpp: still magical?.</a> Annual Review of Microbiology. 62, 35-51 (2008).</li><li>Boutte, C. C., Crosson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+lifestyle+shapes+stringent+response+activation.">Bacterial lifestyle shapes stringent response activation.</a> Trends in Microbiology. 21 (4), 174-180 (2013).</li><li>Nanamiya, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+functional+analysis+of+novel+(p)ppGpp+synthetase+genes+in+Bacillus+subtilis.">Identification and functional analysis of novel (p)ppGpp synthetase genes in Bacillus subtilis.</a> Molecular Microbiology. 67 (2), 291-304 (2008).</li><li>Gaca, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+Levels+of+(p)ppGpp+in+Enterococcus+faecalis:+the+Magic+beyond+the+Stringent+Response.">Basal Levels of (p)ppGpp in Enterococcus faecalis: the Magic beyond the Stringent Response.</a> mBio. 4 (5), (2013).</li><li>Sebaihia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multidrug-resistant+human+pathogen+Clostridium+difficile+has+a+highly+mobile,+mosaic+genome.">The multidrug-resistant human pathogen Clostridium difficile has a highly mobile, mosaic genome.</a> Nature Genetics. 38 (7), 779-786 (2006).</li><li>Gasteiger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ExPASy:+The+proteomics+server+for+in-depth+protein+knowledge+and+analysis.">ExPASy: The proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis.</a> Nucleic Acids Research. 31 (13), 3784-3788 (2003).</li><li>Purcell, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nutrient-regulated+cyclic+diguanylate+phosphodiesterase+controls+Clostridium+difficile+biofilm+and+toxin+production+during+stationary+phase.">A nutrient-regulated cyclic diguanylate phosphodiesterase controls Clostridium difficile biofilm and toxin production during stationary phase.</a> Infection and Immunity. , (2017).</li><li>Mechold, U., Murphy, H., Brown, L., Cashel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intramolecular+Regulation+of+the+Opposing+(p)ppGpp+Catalytic+Activities+of+RelSeq,+the+Rel/Spo+Enzyme+from+Streptococcus+equisimilis.">Intramolecular Regulation of the Opposing (p)ppGpp Catalytic Activities of RelSeq, the Rel/Spo Enzyme from Streptococcus equisimilis.</a> Journal of Bacteriology. 184 (11), 2878-2888 (2002).</li><li>Dalebroux, Z. D., Svensson, S. L., Gaynor, E. C., Swanson, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ppGpp+Conjures+Bacterial+Virulence.">ppGpp Conjures Bacterial Virulence.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 74 (2), 171-199 (2010).</li><li>Bartlett, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clostridium+difficile:+progress+and+challenges.">Clostridium difficile: progress and challenges.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1213, 62-69 (2010).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> US Department of Health and Human Services. , (2013).</li></ol>

هنا نحن تقرير تنقية RSH صاحب معلم من جيم وتقديم طريقة لتقدير حجم النشاط باستخدام كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة راديولابيليد. سابقا وقد استخدم هذا الأسلوب لتقييم نشاط الإنزيمات سيكلاسي ديجوانيلاتي من جيم، فضلا عن (ف) بجب سينثاتيز، cyclase النوكليوتيدات، كيناز والأنزيمات فوسفوديستري?...

إنزيمات كيناز وبيروفوسفوكيناسي (أو ديفوسفو-كيناز) نقل الفوسفات من النوكليوتيدات ثلاثي الفوسفات (NTP) السلائف إلى جزيئات الركازة. يمكن أن تتضمن ركائز أخرى النيوكليوتيدات والأحماض الأمينية أو البروتينات والكربوهيدرات والدهون1. في بعض الأحيان يمكن التنبؤ بها تحليلات Bioinformatic الركازة المشابهة لأنزيم أو ركائز استناداً إلى التشابه للإنزيمات تتميز، ولكن لا يزال من الضروري التحقق التجريبي. وبالمثل، تقارب إنزيم substrate(s)، ومعدل أنه يحفز رد الفعل الفوسفور والنقل، وآثار العوامل المشتركة، ومثبطات، أو المستجيبة الإنزيم يجب أن يتحدد تجريبيا. تجنب استنزاف السلائف ATP بسائر الإنزيمات ATP المستهلكة الموجودة في السيتوبلازم البكتيري، تتطلب فحوصات النشاط كمية البروتين المنقي.
تنقية البروتين اللوني تقارب معدنية قطعت تماما في الأدب2،3. تسمح العلامات الحامض الأميني تتكون من ستة بقايا الحامض الأميني على التوالي إلحاق إلى N-أو ج-المحطة بروتين المؤتلف تنقية السريع بتقارب معدنية اللوني4،،من56. تسلسل هذه صغيرة مقارنة بالبروتينات تعديلها، وعادة ما يكون له تأثير ضئيل على وظيفة البروتين، على الرغم من أنها يمكن أن تغير في بعض الأحيان الاستقرار البروتين و/أو إنزيم حركية7،8. يمكن أن يكون الحامض الأميني العلامات في ن-وج-تيرميني للبروتين نفس تأثيرات مختلفة، والتي يصعب التنبؤ بها دون معرفة هيكل البروتين في السؤال. وأدرجت العلامات الحامض الأميني عادة أثناء استنساخ بروتين المؤتلف بتصميم كبسولة تفجير ترميز ستة الحامض الأميني البقايا، أما فورا 3 'إلى كودون بدء ATG أو فورا 5' إلى كودون وقف الإطار القراءة المفتوحة. بعد التضخيم، متصلة إلى ناقل تحت سيطرة مروج إيندوسيبلي الجينات المحتوية على هيكساهيستيديني وأعرب عادة في مختبر سلالة كولاي. ثم يمكن أن تكون معزولة جزئ البروتين راتنج تقارب المحتوية على الكاتيونات divalent المعطل تداولها (عادة من النيكل أو الكوبالت)9. يمكن إزالة تلويث الأصلية ملزمة معدنية البروتينات بالمعايرة مع ايميدازول، الذي يزيح تنافسية البروتين ملزمة2. وأخيراً، هو التيد البروتين المستهدف من العمود مع تركيزات أعلى من ايميدازول. هناك عدة مصادر تجارية الراتنجات الموجبة معدنية المعطل تداولها، والشركات المصنعة تقديم توصيات بشأن شروط المخزن المؤقت وتركيزات ايميدازول. بعد شطف، يمكن تحليلها بواسطة الصوديوم دوديسيل كبريتات-polyacrylamide هلام التفريد (الحزب الديمقراطي الصربي صفحة) البروتين أو دياليزيد أو استخدامها على الفور في الاختبارات الوظيفية.
هناك عدة طرق لمراقبة النشاط كيناز غير مباشر باقتران التحلل بوند الفوسفات ATP إلى رد فعل ثاني الذي يثير فلوروفوري أو النشرات أو يولد تشيميلومينيسسينسي، ولكن ردود الفعل هذه لها عدة أجزاء متحركة، ويمكن أن تكون 10من الناحية اللوجستية الصعبة. الطريقة الأكثر مباشرة لقياس نشاط نقل الفوسفور على وجه التحديد مباشرة رصد نقل مجموعة الفوسفات راديولابيليد من المتاحة تجارياً γ-32-P السلائف NTP للركيزة غير راديولابيليد11 , 12 , 13-يمكن فصل خليط من ركائز راديولابيليد والمنتجات وكمياً بطبقة رقيقة اللوني (TLC). ويستخدم TLC تفاضلية تنقل الذوائب في مذيب معين عن طريق السماح المذيبات (الطور السائل) ترحيل بعمل شعري عبر سطح (المرحلة الصلبة) التي كانت مزيجاً الذوائب الممتزة14. سيتم ترحيل الذوائب الصغيرة و/أو تفتقر إلى تفاعلات إيجابية مع المرحلة الصلبة مسافات أطول من مواقعها الأولية من الذوائب مع الأوزان الجزيئية أعلى أو الانتماءات كبيرة الصلبة. لدراسة نقل الفوسفور، مويتيس الفوسفات زيادة الوزن الجزيئي للجزيئات أنها تضاف إلى، وإضافة تهمة الأيونية السالبة في الأس الهيدروجيني المحايدة أو الحمضية11،،من1214. هذا يقلل من قدرتها على الحركة على سطح أساسية مثل السيلولوز بي. عندما وضعت في المخزن المؤقت لفوسفات البوتاسيوم الحمضية، يمكن فصل المخاليط مونو-دي-، ثلاثي، رباعي، والأنواع بينتافوسفاتي سهولة في بي-السليلوز، السماح للتحديد الكمي لكل نوع من الأنواع (الشكل 2، الشكل 3). يمكن إجراء هذه الاختبارات باستخدام ليساتيس الخلية التي تحتوي على الإنزيم للفائدة، ولكن هذا يشمل احتمال نشاط أخرى مؤنزم، فوسفاتاسيس، وأتباسيس العامة لاستنزاف الركيزة و/أو المنتج. تقييم كمي في المختبر لنشاط إنزيم، من الضروري تنقية إنزيم الفائدة.
جوانوسيني تيترافوسفاتي (بجب) وجوانوسيني بينتافوسفاتي (ببجب) ريبونوكليوتيدي إشارات الجزيئات التي شكلتها نقل بيروفوسفات المجموعة من سلائف الادينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP)، على التوالي، guanosine diphosphate (الناتج المحلي الإجمالي) أو جانسين الركيزة تيترافوسفاتي (غتب)15. هذه الإشارات ريبونوكليوتيدي واحد، المعروفة ببجب (p)، التوسط استجابة على مستوى الخلية للإجهاد البيئي المعروف باسم الاستجابة الصارمة في الأنواع البكتيرية المتنوعة15،16. فئتين مصانة من الإنزيمات تحفيز التشكيل (ف) بجب15،17 Rel/مكتب التخطيط الاستراتيجي الإنزيمات هومولوج (RSH) 'طويلة' بيفونكشونال (ف) بجب سينثاتيز/هيدرولاسيس اسمه للتشابه بهم إلى ريلى والفور (ف) بجب الأيضية إنزيمات من الإشريكيّة القولونية التي تحتوي على سينثاتيز هيدرولاز والمجالات التنظيمية، بينما الإنزيمات سينثاتيز (SAS) الارمون الصغيرة سينثيتاسيس مونوفونكشونال قصيرة وجدت حصرا في غرام البكتيريا إيجابية15، 17 , 18-بكتيريا إيجابية تشكيل بوغ المطثيّة العسيرة بترميز الجينات RSH و SAS المفترضة19. هنا، نحن نقدم فحوصات النشاط الأولية التي تؤكد أن الإنزيم RSH جيم سينثاتيز بجب (ف) حفازة نشطة.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Inducible overexpression of a histidine-tagged protein</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion polymerase</td>
			<td>New England Biolabs (NEB)</td>
			<td>M0530L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAEX II DNA Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>20021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KpnI restriction enzyme</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0142S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PstI restriction enzyme</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0140S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB&#174; 5-alpha Competent&#160;E. coli&#160;(High Efficiency)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>C2987I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 (DE3) Competent E. coli</td>
			<td>NEB</td>
			<td>C2527I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10724815001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JXN-26 centrifuge with JLA 10.500 rotor</td>
			<td>Beckman Coulter Avanti</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge with D3024/D3024R rotor</td>
			<td>Scilogex</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxQ SHKE6000 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic processor</td>
			<td>Sonics</td>
			<td>VC-750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein purification by nickel affinity chromatography</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA resin</td>
			<td>G Biosciences</td>
			<td>786-940/941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Disposable Gravity columns, 10 mL</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>29924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Spectra/ Por float-A-lyzer G2 dialysis device (MWCO: 20-kD)</td>
			<td>Spectrum</td>
			<td>G235033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Protean Electrophoresis Cell</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein activity assay by thin layer chromatography</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin layer chromatograph (TLC) development tank</td>
			<td>General Glass Blowing Company</td>
			<td>80-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine (PEI)-cellulose plates (20 cm x 20 cm, 100 um thickness) with polyester support</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z122882-25EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP, [&#947;-32P]- 3000 Ci/mmol 10mCi/ml lead, 100 &#956;Ci</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEG002A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8217;-triphosphate (ATP) 100 mM</td>
			<td>Bio Basic Canada</td>
			<td>AB0311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine-5&#8217;-diphosphate disodium salt (GDP)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>AAJ61646MC/E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Storage phosphor screen</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>BAS-IP TR 2040 E Tritium Screen</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Storm 860 phosphorimager</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a purification and in vitro activity assay for a (p)ppgpp synthetase from clostridium difficile

إنزيمات كيناز وبيروفوسفوكيناسي نقل الفوسفات غاما أو مجموعة بيروفوسفات بيتا-غاما من السلائف ثلاثي الفوسفات النوكليوتيدات إلى ركائز لخلق منتجات فوسفوريلاتيد. الاستخدام γ-32-ف المسمى السلائف NTP يسمح الرصد المتزامن الركازة الانتفاع والمنتج تكوين بالأشعة. طبقة رقيقة اللوني (TLC) على لوحات السيلولوز يسمح الفصل السريع والكمي الحساسة للركيزة والمنتج. نحن نقدم طريقة لاستخدام كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة الاعتداء نشاط بيروفوسفوكيناسي سينثاتيز بجب (ف) المنقي. هذا الأسلوب قد استخدمت سابقا لوصف نشاط دوري سينثيتاسيس النوكليوتيدات ودينوكليوتيدي، وهو مناسبة على نطاق واسع لوصف نشاط أي إنزيم هيدروليزيس ثلاثي الفوسفات النوكليوتيدات سندات أو نقل محطة طرفية الفوسفات من مانح فوسفات إلى جزيء آخر.

نقدم طريقة لتنقية تقارب سينثاتيز بجب (ف) من المطثيّة العسيرة وتقييم نشاطها الأنزيمي. يوضح الشكل 1 تنقية البروتين حققها اللوني تقارب معدنية. كان الكسر شطف (E2) الثانية من تنقية هذه دياليزيد وتستخدم لتحليل النشاط الأنزيمي. الشكل 2 تفاصيل ?...

Watch this Scientific Journal Video about A Purification and In Vitro Activity Assay for a pppGpp Synthetase from Clostridium difficile at JoVE.com

A Purification and In Vitro Activity Assay for a pppGpp Synthetase from Clostridium difficile

هنا، يمكننا وصف طريقة لتنقية الإنزيمات معلم الحامض الأميني بيروفوسفوكيناسي واستخدام طبقة رقيقة اللوني من ركائز راديولابيليد ومنتجات الاعتداء للنشاط الأنزيمي في المختبر. مقايسة نشاط إنزيم قابل للتطبيق على نطاق واسع لأي كيناز، cyclase النوكليوتيدات، أو رد فعل الفوسفور ونقل إليه الذي يتضمن التحلل ثلاثي الفوسفات النوكليوتيدات.

تنقية و في المختبر نشاط الإنزيم (ع) بجب سينثاتيز من المطثيّة العسيرة

Kinase and pyrophosphokinase enzymes transfer the gamma phosphate or the beta-gamma pyrophosphate moiety from nucleotide triphosphate precursors to ...

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول إنزيمات phosphotransfer بما في ذلك خصوصية الركيزة الإنزيمية وحركية التفاعل. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بجمع سريع لمجموعات بيانات متعددة متسقة للغاية، مما يتيح تحديد كمية قوية إحصائيا لنشاط الإنزيم. إن البرهان المرئي لهذه الطريقة أمر بالغ الأهمية لأن اكتشاف التفاعلات على لوحات TLC وتحديد الأنواع المشعة في التفاعلات أسهل بكثير من الشرح.بالإضافة إلى Astha، فإن الإجراء الذي يوضحه سيكون آسيا بودل، وهي طالبة دراسات عليا أخرى من مختبري. ابدأ هذا البروتوكول مع فرط التعبير غير القابل للانصات من بروتين الموسومة بالهستيدين كما هو موضح في بروتوكول النص. إعداد ملليلتر واحد من راتنج حمض نيتريلواستيك النيكل في عمود الجاذبية لتنقية البروتين.في اليوم السابق للاستخدام، توازن العمود بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية مع ميليلترين من العازلة التوازن. في اليوم التالي جلب العمود من أربع درجات مئوية إلى درجة حرارة الغرفة قبل تحميل lysate أوضح والسماح لها الوقوف لمدة ساعتين إلى ثلاث ساعات تقريبا. ثم إعادة تعليق بيليه في العازلة تحلل.Sonicate الخلايا على الجليد لمدة 10 مرات 10 ثانية فترات، والتوقف 30 ثانية بين البقول. توضيح lysate بواسطة الطرد المركزي في 3، 080 مرات ز لمدة 30 دقيقة في أربع درجات مئوية باستخدام microcentrifuge. إعداد lysate clarified مع وحدات التخزين متساوية من المخزن المؤقت تحلل، ثم تطبيق prepped، clarified lysate إلى العمود وجمع تدفق من خلال.إعادة تطبيق تدفق lysate clarified إلى العمود وجمع تدفق الثانوية من خلال. ثم غسل العمود مع خمسة ملليلتر من غسل العازلة واحدة وجمع تدفق من خلال. غسل العمود مرة أخرى مع خمسة ملليلتر من غسل العازلة اثنين وجمع تدفق من خلال.الآن تطبيق مليلتر اثنين من عازلة elution. جمع تدفق من خلال في كسرين من ملليلتر واحد لكل منهما. أثناء تنقية البروتين، إدراج كلوريد المغنيسيوم في مخازن التنقية، تعديل بروتوكول الشركة المصنعة، ضروري للنشاط الأنزيمي.لتقييم نوعي لتنقية البروتين من قبل SDS-PAGE، تشغيل 20 aliquots ميكرولتر من جميع الكسور العمود على التراص 4٪، 10٪ تشغيل هلام بولياكريلاميد لمدة 60 دقيقة في 170 فولت. وصمة عار هلام مع 0.1٪ Coomassie الأزرق في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس ساعات، هزاز بلطف على الروك benchtop. ثم destain هلام في 40٪ الميثانول-10٪ حمض الخليك الجليدي بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة، هزاز على الروك benchtop.Dialyze الكسر مائل اثنين ضد عازلة غسيل الكلى في نسبة 200:1 باستخدام جهاز غسيل الكلى ملليلتر واحد مع 20 كيلودالون قطع الوزن الجزيئي بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية. تحديد تركيز عينة البروتين dialyzed عن طريق قياس الامتصاص في 280 نانومتر واستخدام معامل الانقراض الضرس المحسوب. تخزين 100 ميكرولتر aliquots من عينة البروتين dialyzed في ناقص 80 درجة مئوية حتى الاستخدام.قبل إجراء التفاعل، قم بإعداد لوحات الكروماتوغرافيا طبقة رقيقة من السليلوز PEI عن طريق غسلها في المياه الأيونية. ضع اللوحات في غرفة زجاجية مع ماء مقطر مزدوج على عمق حوالي 0.5 سنتيمتر. بعد السماح للمياه بالهجرة إلى أعلى اللوحة، أخرج اللوحات من الحجرة الزجاجية واتركها على رف على مقاعد البدلاء لتجف بين عشية وضحاها.وضع علامة على اللوحات المجففة على بعد سنتيمترين من حافة واحدة مع قلم رصاص ناعم للإشارة إلى مكان تطبيق العينات على TLC. بالنسبة لعينات ميكرولترتين، ضعي عينات لا تقل عن سنتيمتر واحد. عند التخطيط للتجارب، اترك دائمًا نقطة واحدة على كل لوحة غير مستخدمة لتكون بمثابة ممر فارغ لتحديد كمية العينات.لإجراء تحليل نشاط الإنزيم، قم بإعداد التفاعلات الفردية باستخدام GAMMA P32 ATP كما هو موضح في بروتوكول النص. إضافة RSH بعد أن تم خلط المكونات الأخرى، كما إضافة RSH إلى المزيج المحتوي على النيوكليوتيد يبدأ مقايسة النشاط الأنزيمية. للسيطرة على التحليل المائي ATP من تلوث نشاط النوى، وتجميع رد فعل 10 ميكرولتر لا تحتوي على البروتين واحتضان ذلك في موازاة ذلك.بقعة عينات اثنين microliter في T يساوي صفر وفي نهاية التجربة لضمان أن ATP لم يتم تحللها في غياب البروتين. فور إضافة RSH، قم بإزالة اثنين من ميكروليتر وبقعتها على لوحة PEI-cellulose التي تحمل علامة T تساوي عينة دقيقة صفر. احتضان رد الفعل في 37 درجة مئوية، وإزالة اثنين من microliter aliquots في النقاط الزمنية المطلوبة.بعد جمع جميع aliquots ، قم بإجراء كروماتوغرافيا رقيقة عن طريق ملء غرفة الكروماتوغرافيا مع فوسفات البوتاسيوم أحادية البابس 1.5 مولر إلى عمق 0.5 سنتيمتر. تزج الحافة السفلية من لوحة في المذيبات والسماح للمذيبات إلى الهجرة إلى أعلى لوحة على مدى 90 دقيقة تقريبا. قم بإزالة اللوحة من خزان الكروماتوغرافيا ووضعها على رف تجفيف على مقاعد البدلاء للهواء الجاف بين عشية وضحاها.بعد أن يجف الطبق، لف اللوحة في فيلم بلاستيكي لتجنب نقل المواد المشعة إلى كاسيت التصوير وتحليلها عن طريق التصوير الآلي. اعرض لوحة PEI-cellulose التي تحتوي على ردود فعل منفصلة على كاسيت فوسفورمامر لمدة أربع ساعات في درجة حرارة الغرفة. بعد التعرض، صورة كاسيت على phosphorimager.باستخدام برامج التصوير مع واجهة المستخدم الرسومية، رسم المناطق ذات الاهتمام أو ROIs عن طريق تحديد أولا رسم مستطيل، ثم استخدام الماوس لرسم ROIs مستطيلة حول حارة واحدة كاملة و ATP وguanosine-tetraphosphate البقع الواردة داخل هذا الممر. استخدم أوامر التحديد والنسخ واللصق لرسم ROIs متطابقة داخل الممرات الأخرى للتأكد من أن مؤشر الـ ROIs يقيس الإشارة داخل مناطق متطابقة في كل حارة. قم بتضمين ROIs من حارة غير مستخدمة لاستخدامها كفراغات.باستخدام تحليل ، أدوات ، مدير ROI ، إضافة أوامر من برنامج التصوير ، حدد كل من ROIs رسمها على لوحة PEI - السليلوز. الآن استخدام تحليل، تعيين القياسات، قياس الأوامر لتحديد كثافة الإشارة داخل كل عائد الاستثمار وتصدير القياسات باعتباره spreadsheeet. في جدول البيانات، اطرح قيم عائد الاستثمار فارغة من الإشارات التجريبية.إن تحويل البيانات إلى النسبة المئوية من الـ guanosine-tetraphosphate synthetized أمر بالغ الأهمية، لأنه يضمن أن مجموعات البيانات التي يتم جمعها في أيام مختلفة مع دفعات مختلفة من البروتين أو مختلف الغاما P32 ATP متسقة ويمكن تجميعها للصرامة الإحصائية. يوضح هذا الكرتون كيفية استخدام المناطق ذات الأهمية لتحديد حارة تحتوي على الإشارة المشعة الكلية في عينة ومكونات ATP المشعة و مناطق تترافوسفات جوانوسين ذات الأهمية. يتم تطبيع إشارات ATP و guanosine tetraphosphate إلى الإشارة الكلية بدلاً من الإبلاغ عن القيم المطلقة لأن خطأ الأنابيب أو اضمحلال الركيزة المشعة يمكن أن يؤثر على الإشارة الكلية في العينة ولكن لا تؤثر على نشاط الإنزيم.يظهر هنا هو لوحة TLC الفعلية من رد فعل نفذت باستخدام تنقية C.difficile RSH. تفاعل التحكم الذي لا يحتوي على البروتين يسمح بالتكون الكمي من التحلل المائي ATP غير المُخلَف في حين أن حارة فارغة تسمح بدقة تحديد كمية الإشارة. وفي بقع ATP وguanosine-tetraphosphate، ينقل الإنزيم الفوسفات المشع من ركيزة ATP إلى سلائف الناتج المحلي الإجمالي، مما يخلق رابع فوسفات الغانوزين المشع.وهذا يؤكد أن synthetase من c.difficile هو الانزيم هو مُفتَهَلِ. عن طريق أخذ العينات رد الفعل على فترات، يمكن ملاحظة التقدم. هنا يتم ملاحظة الإشارة الخام في كل نقطة زمنية.ATP آخذ في التناقص و جوانوسين رباعي الفوسفات آخذ في الازدياد. تظهر هنا البيانات التي تم تسويتها. أشرطة الخطأ أصغر بكثير لأن الحسابات الحسابات التهيئة لأي خطأ pipetting.أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن تكون حذراً من خدش الراتنج على لوحة TLC، لأن هذا يمكن أن تتداخل مع الهجرة المذيبات. هذه تقنية يمكن الوصول إليها للغاية مع تحليل البيانات المباشر الذي يمكن أن يوفر بسرعة تحديد كمي قوي لنشاط الإنزيم. لقد استخدمناه لتأكيد أن كلوستريديوم difficile يجمع بين رهاب الـ (جوانوسين) رباعي الفوسفات، والذي لم يتم الإبلاغ عنه من قبل.لا تنس أن العمل مع النشاط الإشعاعي يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويجب اتباع قواعد المؤسسة لتخزين واستخدام المواد المشعة أثناء تنفيذ هذا الإجراء. يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة في تخليق رباعي الفوسفات الجانوسين ولكن يمكن أيضا أن تطبق على ردود فعل phosphotransfer الأخرى, بما في ذلك نشاط كيناز البروتين وتوليف diguanylate دوري.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Purification and In Vitro Activity Assay for a (p)ppGpp Synthetase from Clostridium difficile

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

تشكيل بيوفيلم في المختبر في غرفة الشرائح 8 جيد

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. ...

Measurement of Factor V Activity in Human Plasma Using a Microplate Coagulation Assay

قياس نشاط V عامل في البلازما البشرية باستخدام الفحص التخثر صفيحة ميكروسكوبية

 In response to injury, blood coagulation is activated and results in generation of the clotting protease, thrombin. Thrombin cleaves fibrinogen to fibrin ...

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

اللعاب، الغدد اللعابية، وجمع اللمف الدموي من القراد اللبود الكتفي

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

Culturing and Maintaining Clostridium difficile in an Anaerobic Environment

Culturing and Maintaining Clostridium difficile in an Anaerobic Environment

زراعة وصيانة<em&gt; المطثية العسيرة</em&gt; في بيئة لاهوائية

Clostridium  difficile is a Gram-positive, anaerobic, sporogenic bacterium  that is primarily responsible for antibiotic associated diarrhea (AAD) and is ...

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

في المختبر المقايسة المشتركة لتقييم الهجرة العدلية المستحثة المسببة للأمراض عبر الظهارية

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

العزلة، تحديد الهوية، وتنقية خلايا الفئران التوتة طلائي

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

RNA تنقية من داخل الخلية المزروعة<em&gt; المستوحدة الليستيريا</em&gt; في خلايا البلاعم

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

تدفق تحليل Cytometric من القاتل الطبيعي خلية التحللي آخر في الدم الجامع البشري

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Cefoperazone-treated Mouse Model of Clinically-relevant Clostridium difficile Strain R20291

Cefoperazone-treated Mouse Model of Clinically-relevant Clostridium difficile Strain R20291

المعالجة سيفوبيرازون ماوس نموذج سريريا ذات صلة<em&gt; المطثية العسيرة</em&gt; سلالة R20291

Clostridium difficile is an anaerobic, gram-positive, spore-forming enteric pathogen that is associated with increasing morbidity and mortality and ...

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

بروتوكول لتوصيف التغيرات المورفولوجية<em&gt; كلوستريديوم ديفيسيل</em&gt; في الاستجابة للعلاج بالمضادات الحيوية

Assessment of antibiotic action with new drug development directed towards anaerobic bacteria is difficult and technically demanding. To gain insight into ...