Name: a purification and in vitro activity assay for a (p)ppgpp synthetase from clostridium difficile
Uploaded: 2018-11-03T15:00:00
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这项工作由 niaid 1k22ai118929-01 资助。ebp 得到了美国弗吉尼亚州诺福克郡老多米尼翁大学研究办公室的暑期研究研究金计划赠款的支持。

1. 被 histidin-getl 标记的蛋白的诱导过度表达
<ol><li>从艰难梭菌r20291 基因组 dna 中扩增 rsh. <ol>
<li>使用高保真聚合酶, 并按照制造商的说明进行操作。</li>
		<li>使用引物放大艰难梭菌 rsh _ f (caggtacc gttattatatataagattacaag) 和 rsh _ r (cc ctgcagctaggggggggggggggggggtgttcatttaittataac), 它引入了一个 c 端的六角替丁标签。 注: 引物序列中的 kpni 和 psti 切割站点是带粗?...

<ol>
	<li>Cheek, S., Ginalski, K., Zhang, H., Grishin, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+update+of+the+sequence+and+structure+classification+of+kinases.">A comprehensive update of the sequence and structure classification of kinases.</a> BMC Structural Biology. 5 (1), 6 (2005).</li><li>Porath, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilized+metal+ion+affinity+chromatography.">Immobilized metal ion affinity chromatography.</a> Protein Expression and Purification. 3 (4), 263-281 (1992).</li><li>Arnau, J., Lauritzen, C., Pedersen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+strategy,+production+and+purification+of+proteins+with+exopeptidase-cleavable+His-tags.">Cloning strategy, production and purification of proteins with exopeptidase-cleavable His-tags.</a> Nature Protocols. 1 (5), 2326-2333 (2006).</li><li>Porath, J., Carlsson, J., Olsson, I., Belfrage, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal+chelate+affinity+chromatography,+a+new+approach+to+protein+fractionation.">Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation.</a> Nature. 258 (5536), 598-599 (1975).</li><li>Smith, M. C., Furman, T. C., Ingolia, T. D., Pidgeon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chelating+peptide-immobilized+metal+ion+affinity+chromatography.+A+new+concept+in+affinity+chromatography+for+recombinant+proteins.">Chelating peptide-immobilized metal ion affinity chromatography. A new concept in affinity chromatography for recombinant proteins.</a> Journal of Biological Chemistry. 263 (15), 7211-7215 (1988).</li><li>Graslund, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+production+and+purification.">Protein production and purification.</a> Nature Methods. 5 (2), 135-146 (2008).</li><li>Booth, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+an+N-terminal+Polyhistidine+Tag+on+Protein+Thermal+Stability.">Impact of an N-terminal Polyhistidine Tag on Protein Thermal Stability.</a> ACS Omega. 3 (1), 760-768 (2018).</li><li>Thielges, M. C., Chung, J. K., Axup, J. Y., Fayer, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+histidine+tag+attachment+on+picosecond+protein+dynamics.">Influence of histidine tag attachment on picosecond protein dynamics.</a> Biochemistry. 50 (25), 5799-5805 (2011).</li><li>Chaga, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Twenty-five+years+of+immobilized+metal+ion+affinity+chromatography:+past,+present+and+future.">Twenty-five years of immobilized metal ion affinity chromatography: past, present and future.</a> Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 49 (1-3), 313-334 (2001).</li><li>Ma, H., Deacon, S., Horiuchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+challenge+of+selecting+protein+kinase+assays+for+lead+discovery+optimization.">The challenge of selecting protein kinase assays for lead discovery optimization.</a> Expert opinion on drug discovery. 3 (6), 607-621 (2008).</li><li>Tamayo, R., Tischler, A. D., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+EAL+domain+protein+VieA+is+a+cyclic+diguanylate+phosphodiesterase.">The EAL domain protein VieA is a cyclic diguanylate phosphodiesterase.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (39), 33324-33330 (2005).</li><li>Purcell, E. B., McKee, R. W., McBride, S. M., Waters, C. M., Tamayo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+Diguanylate+Inversely+Regulates+Motility+and+Aggregation+in+Clostridium+difficile.">Cyclic Diguanylate Inversely Regulates Motility and Aggregation in Clostridium difficile.</a> Journal of Bacteriology. 194 (13), 3307-3316 (2012).</li><li>Purcell, E. B., Tamayo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+cyclic+nucleotide+phosphodiesterases.">Identification and characterization of cyclic nucleotide phosphodiesterases.</a> Methods in Molecular Biology. 1016, 235-243 (2013).</li><li>Ross, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+cellulose+synthesis+Acetobacter+xylinum.+A+unique+guanyl+oligonucleotide+is+the+immediate+activator+of+the+cellulose+synthase.">Control of cellulose synthesis Acetobacter xylinum. A unique guanyl oligonucleotide is the immediate activator of the cellulose synthase.</a> Carbohydrate Research. 149 (1), 101-117 (1986).</li><li>Potrykus, K., Cashel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=(p)ppGpp:+still+magical?.">(p)ppGpp: still magical?.</a> Annual Review of Microbiology. 62, 35-51 (2008).</li><li>Boutte, C. C., Crosson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+lifestyle+shapes+stringent+response+activation.">Bacterial lifestyle shapes stringent response activation.</a> Trends in Microbiology. 21 (4), 174-180 (2013).</li><li>Nanamiya, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+functional+analysis+of+novel+(p)ppGpp+synthetase+genes+in+Bacillus+subtilis.">Identification and functional analysis of novel (p)ppGpp synthetase genes in Bacillus subtilis.</a> Molecular Microbiology. 67 (2), 291-304 (2008).</li><li>Gaca, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+Levels+of+(p)ppGpp+in+Enterococcus+faecalis:+the+Magic+beyond+the+Stringent+Response.">Basal Levels of (p)ppGpp in Enterococcus faecalis: the Magic beyond the Stringent Response.</a> mBio. 4 (5), (2013).</li><li>Sebaihia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multidrug-resistant+human+pathogen+Clostridium+difficile+has+a+highly+mobile,+mosaic+genome.">The multidrug-resistant human pathogen Clostridium difficile has a highly mobile, mosaic genome.</a> Nature Genetics. 38 (7), 779-786 (2006).</li><li>Gasteiger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ExPASy:+The+proteomics+server+for+in-depth+protein+knowledge+and+analysis.">ExPASy: The proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis.</a> Nucleic Acids Research. 31 (13), 3784-3788 (2003).</li><li>Purcell, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nutrient-regulated+cyclic+diguanylate+phosphodiesterase+controls+Clostridium+difficile+biofilm+and+toxin+production+during+stationary+phase.">A nutrient-regulated cyclic diguanylate phosphodiesterase controls Clostridium difficile biofilm and toxin production during stationary phase.</a> Infection and Immunity. , (2017).</li><li>Mechold, U., Murphy, H., Brown, L., Cashel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intramolecular+Regulation+of+the+Opposing+(p)ppGpp+Catalytic+Activities+of+RelSeq,+the+Rel/Spo+Enzyme+from+Streptococcus+equisimilis.">Intramolecular Regulation of the Opposing (p)ppGpp Catalytic Activities of RelSeq, the Rel/Spo Enzyme from Streptococcus equisimilis.</a> Journal of Bacteriology. 184 (11), 2878-2888 (2002).</li><li>Dalebroux, Z. D., Svensson, S. L., Gaynor, E. C., Swanson, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ppGpp+Conjures+Bacterial+Virulence.">ppGpp Conjures Bacterial Virulence.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 74 (2), 171-199 (2010).</li><li>Bartlett, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clostridium+difficile:+progress+and+challenges.">Clostridium difficile: progress and challenges.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1213, 62-69 (2010).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> US Department of Health and Human Services. , (2013).</li></ol>

本文报道了艰难梭菌中 hs 标记 rsh 的纯化过程, 并提出了一种利用放射性标记薄层色谱法进行活性定量的方法。这种方法以前曾被用来评估艰难梭菌的二瓜酸环化酶的活性, 以及来自其他生物体的 ppgpp 合成酶、核苷酸循环酶、激酶和磷酸二酯酶的活性11,12 ,13,21。虽然这种方法并不新颖, 但...

激酶和焦磷酸激酶 (或二磷酸激酶) 酶将磷酸酯从三磷酸核苷酸 (ntp) 前体转移到底物分子。底物可以包括其他核苷酸、氨基酸或蛋白质、碳水化合物和脂质1。生物信息学分析有时可以根据与表征酶的相似性预测酶的同源基底物或底物, 但实验验证仍然是必要的。同样, 必须通过实验确定酶对底物的亲和力及其催化磷转移反应的速度, 以及共同因素、抑制剂或其他酶效应的影响。为了避免细菌细胞质中其他消耗 atp 的酶消耗 atp 前体的消耗, 定量活性检测需要纯化的蛋白质。
用金属亲和层析纯化蛋白质已在文献2,3中得到了深入的报道。组氨酸标记由六个连续的组氨酸残基附加到重组蛋白的 n-或 c 末端允许通过金属亲和层析 4,5,6快速纯化。这些序列与它们修饰的蛋白质相比很小, 通常对蛋白质功能的影响很小, 尽管它们有时会改变蛋白质的稳定性和/或酶动力学7,8.同一蛋白质的 n-和 c 端部的组氨酸标记可以产生不同的效果, 如果不知道所涉及的蛋白质的结构, 就很难预测。组氨酸标记通常是在重组蛋白克隆过程中采用的, 方法是设计编码6个组氨酸残基的引物, 或者立即 3 ' 到 atg 启动密码子, 或者立即 5 ' 到开放阅读框架的停止密码子。扩增后, 含有六分苷的基因在诱导启动子的控制下被连接成载体并表达, 通常是在大肠杆菌的实验室菌株中表达的。然后, 重组蛋白可以在含有固定化二价阳离子 (通常是镍或钴)的亲和树脂上分离9。用咪唑滴定法可以去除污染原生金属结合蛋白, 从而有竞争力地取代结合蛋白2。最后, 目标蛋白从浓度较高的咪唑柱中洗脱。固定化金属阳离子树脂有多种商业来源, 制造商为缓冲条件和咪唑浓度提供建议。洗脱后, 蛋白质可通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (sds-page) 进行分析, 进行透析, 或立即用于功能分析。
有几种方法可以通过将 atp 磷酸盐键水解与释放或激发荧光或产生化学发光的第二反应相结合来间接监测激酶活性, 但这些反应具有多个运动部件, 并且可以是后勤上具有挑战性10。专门测量磷转移活性的最直接方法是直接监测放射性标记磷酸盐基团从市售的γ-32-pntp 前体转移到非放射性标记基板 11的情况,12,13. 放射性标记基板和产品的混合物可以用薄层色谱法 (tlc) 进行分离和定量。薄层色谱利用溶质在给定溶剂中的不同流动性, 允许溶剂 (液相) 通过毛细管作用在表面 (固相) 上迁移, 在表面上吸附了溶质混合物14。与分子量较高或与固体有很大亲和力的溶质相比, 小的溶质与与固相缺乏良好的相互作用, 它们的迁移距离将更长。为了检测磷的转移, 磷酸盐分子增加了分子的分子量, 并在中性或酸性 ph 值11,12,14时添加负离子电荷。这降低了它们在基本表面 (如 pei-纤维素) 上的流动性。在酸性磷酸钾缓冲液中开发时, 单、二、三、四、五磷酸五甲酸盐的混合物可以在 pei 纤维素上很容易分离, 从而能够对每个物种进行定量 (图 2, 图 3)。这种检测可以使用含有感兴趣酶的细胞裂解物进行, 但这包括其他激酶、磷酸酶和一般 atpase 的活性耗尽底物和/或产品的可能性。为了对酶活性进行体外定量评估, 有必要对感兴趣的酶进行纯化。
鸟苷四磷酸酯 (ppgpp) 和 guanosine pentapph0fate (pppgpp) 是由焦磷酸基团从三磷酸腺苷 (atp) 前体转移到磷酸 guanosine (gdp) 或鸟苷四磷酸酯 (gtp) 基板15。这些单一的核糖核酸信号, 统称为 (p) ppgpp, 介导了细胞范围内对环境压力的反应, 被称为在不同细菌物种15,16的严格反应。两类保守的酶催化 (p) ppgpp15、17 Rel/Spo homolog (rsh) 酶的形成, 是 "长" 双功能 (p) ppgpp synthaseasepaseasep 水解酶, 其命名与 rela 和 spot (p) ppgpp 代谢相似大肠杆菌中含有合成酶、水解酶和调节域的酶, 而小的 alarmone 合成酶 (sas) 酶是短的单功能合成酶, 专门存在于 gram 阳性菌15中,17,18. 形成孢子的革兰氏阳性细菌艰难梭菌编码假定 rsh 和 sas 基因19。在这里, 我们提出的初始活性检测, 证实艰难梭菌rsh 酶是一种催化活性 (p) ppgpp 合成酶。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Inducible overexpression of a histidine-tagged protein</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion polymerase</td>
			<td>New England Biolabs (NEB)</td>
			<td>M0530L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAEX II DNA Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>20021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KpnI restriction enzyme</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0142S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PstI restriction enzyme</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0140S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB&#174; 5-alpha Competent&#160;E. coli&#160;(High Efficiency)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>C2987I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 (DE3) Competent E. coli</td>
			<td>NEB</td>
			<td>C2527I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10724815001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JXN-26 centrifuge with JLA 10.500 rotor</td>
			<td>Beckman Coulter Avanti</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge with D3024/D3024R rotor</td>
			<td>Scilogex</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxQ SHKE6000 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic processor</td>
			<td>Sonics</td>
			<td>VC-750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein purification by nickel affinity chromatography</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA resin</td>
			<td>G Biosciences</td>
			<td>786-940/941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Disposable Gravity columns, 10 mL</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>29924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Spectra/ Por float-A-lyzer G2 dialysis device (MWCO: 20-kD)</td>
			<td>Spectrum</td>
			<td>G235033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Protean Electrophoresis Cell</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein activity assay by thin layer chromatography</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin layer chromatograph (TLC) development tank</td>
			<td>General Glass Blowing Company</td>
			<td>80-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine (PEI)-cellulose plates (20 cm x 20 cm, 100 um thickness) with polyester support</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z122882-25EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP, [&#947;-32P]- 3000 Ci/mmol 10mCi/ml lead, 100 &#956;Ci</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEG002A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8217;-triphosphate (ATP) 100 mM</td>
			<td>Bio Basic Canada</td>
			<td>AB0311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine-5&#8217;-diphosphate disodium salt (GDP)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>AAJ61646MC/E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Storage phosphor screen</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>BAS-IP TR 2040 E Tritium Screen</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Storm 860 phosphorimager</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a purification and in vitro activity assay for a (p)ppgpp synthetase from clostridium difficile

激酶和焦磷酸激酶酶将磷酸伽玛或β-焦磷酸钙基团从三磷酸核苷酸前体转移到底物, 以产生磷酸化产物。使用γ-32-p标记的 ntp 前体可以通过射线成像同时监测基板的利用率和产品的形成。纤维素板上的薄层色谱 (tlc) 允许对底物和产品进行快速分离和敏感定量。我们提出了一种利用薄层色谱法测定纯化 (p) pppp 合成酶的热磷酸酶活性的方法。这种方法以前曾被用来表征循环核苷酸和二核苷酸合成酶的活性, 广泛适用于表征水解三磷酸核苷酸键或转移末端的任何酶的活性磷酸盐从磷酸盐供体到另一个分子。

我们提出了一种方法的亲和力纯化 a (p) pppp 合成酶从艰难梭菌和评估其酶活性。图 1显示了金属亲和层析法实现的蛋白质纯化。对该纯化的第二洗脱 (e2) 组分进行透析, 用于酶活性测定。图 2详细说明了用薄层色谱法制备和实施热磷化酶检测的必要步骤。图 3说明了这些实验中的数据是如何量化的, 重...

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A Purification and In Vitro Activity Assay for a pppGpp Synthetase from Clostridium difficile

本文介绍了一种纯化带组氨酸标记的热释蛋白酶的方法, 并利用放射性标记底物和产物的薄层色谱法测定了体外的酶活性。酶活性测定广泛适用于任何激酶、核苷酸循环酶或磷转移反应, 其机理包括三磷酸核苷酸水解。

艰难梭菌(p) pppp 合成酶的纯化及体外活性测定

Kinase and pyrophosphokinase enzymes transfer the gamma phosphate or the beta-gamma pyrophosphate moiety from nucleotide triphosphate precursors to ...

此方法可以帮助回答有关磷转移酶的关键问题，包括酶基质特异性和反应动力学。该技术的主要优点是，它允许快速收集多个数据集，这些数据集非常一致，从而能够对酶活性进行统计上可靠的定量。这种方法的视觉演示至关重要，因为发现TLC板块上的反应和量化反应中的放射性物种比解释要容易得多。除了阿莎，演示程序将是亚洲普德尔，另一个研究生从我的实验室。开始这个协议与可读过度表达组蛋白标记的蛋白质，如文本协议中所述。在重力柱中准备一毫升镍硝酸树脂以净化蛋白质。使用前一天，在四摄氏度下用两毫升的平衡缓冲液将柱子在四摄氏度下过夜。第二天，在装载澄清的 lysate 之前，将柱子从 4 摄氏度带到室温，并让它站立大约两到三个小时。然后在解液缓冲液中重新填充颗粒。在冰上对细胞进行10次10秒的间隔，在脉冲之间暂停30秒。使用微离心在4摄氏度下以3080倍g的离心法澄清酸盐，在4摄氏度下30分钟。用等量的解解缓冲液准备澄清的解解液，然后将预制的、澄清的解解体应用到列中并收集流经。重新应用已澄清的 lysate 流到列并收集辅助流。然后用五毫升的洗涤缓冲液洗涤柱，然后收集流经。再次用五毫升的洗涤缓冲液 2 洗涤柱重新清洗柱，然后收集流经。现在应用两毫升的洗脱缓冲液。以两个分数收集流经，每个分数为一毫升。在蛋白质纯化过程中，将氯化镁加入纯化缓冲液（对制造商协议）的修改对于酶活性至关重要。要通过SDS-PAGE对蛋白质纯化进行定性评估，在4%堆叠上运行所有柱分数的20微升等分，10%运行聚丙烯酰胺凝胶，在170伏特下运行60分钟。在室温下用 0.1% 的 Coomassie 蓝色染色凝胶 5 小时，在台式摇杆上轻轻摇动。然后在室温下将凝胶在40%甲醇-10%的冰川醋酸中过夜，在台面摇杆上摇动。使用一毫升透析装置，在4摄氏度下过夜，用20千多顿分子量截止，将洗洗的分数2对透析缓冲液以200：1的比例进行透析。通过测量280纳米的吸光度并使用计算的摩尔消光系数，确定透析蛋白样品的浓度。将透析蛋白样品的100微升等分储存在零下80摄氏度，直到使用。在执行反应之前，通过用去离子水清洗来准备PEI纤维素薄层色谱板。将板放在玻璃室中，用双蒸馏水，深度约为 0.5 厘米。让水迁移到盘子顶部后，将板从玻璃室中拿出来，放在台式机架上晾干过夜。用一支软铅笔将干板从一边标记两厘米，以指示样品将应用于 TLC 的地点。对于双微升样品，请将样品分开不少于一厘米。规划实验时，始终在每个板上保留一个未使用的点，作为样品定量的空白通道。要进行酶活性测定，请使用伽马P32 ATP准备单个反应，如文本协议中所述。在其他成分混合后添加 RSH，因为将 RSH 添加到含核苷酸的混合中将启动酶活性测定。为了控制ATP水解对污染核酸酶活性的影响，组装一种不含蛋白质的10微升反应，并同时孵育。在 T 等于零和实验结束时发现两微升样品，以确保 ATP 在缺乏蛋白质的情况下不会水解。添加 RSH 后，立即取出两个微升，并将其点到标有的 PEI 纤维素板上，因为 T 等于零分钟样品。在37摄氏度下孵育反应，在所需时间点去除两微升等分。收集所有等分，在色谱室中填充1.5摩尔单基磷酸钾，以0.5厘米的深度进行薄层色谱。将板的下边缘浸入溶剂中，让溶剂在大约 90 分钟内迁移到板的顶部。从色谱罐中卸下板，放在台式干燥架上，通宵晾干。板材干燥后，用塑料薄膜包裹板，避免放射性物质转移到成像盒中，并通过自摄影进行分析。在室温下暴露含有对磷基盒分离反应的PEI纤维素板4小时。曝光后，在荧光粉图像上成像盒式磁带。使用具有图形用户界面的成像软件，首先选择"绘制矩形"来绘制感兴趣的区域或 ROIS，然后使用鼠标在一条整条车道周围绘制矩形 PI，以及该车道中包含的 ATP 和瓜诺辛四磷酸盐点。使用"选择、复制和粘贴"命令在其他通道中绘制相同的 PI，以确保 RO 在每个通道中的相同区域内测量信号。包括未使用的车道中用作空白的 PI。使用分析、工具、ROI 管理器、添加成像软件的命令，选择 PEI 纤维素板上绘制的所有 ROI。现在使用"分析、设置测量"命令量化每个 ROI 中的信号强度，并导出测量值作为点差。在电子表格中，从实验信号中减去空白 ROI 值。将数据转换为瓜诺辛-四磷酸盐合成百分比至关重要，因为它可确保不同日期收集的具有不同批次蛋白质或不同伽马 P32 ATP 的数据集是一致的，并且可以汇集以进行统计严谨。这幅漫画演示了如何使用感兴趣的区域来定义包含样品中总放射性信号的车道，以及感兴趣的元素放射性 ATP 和瓜诺辛四磷酸盐区域。ATP 和瓜诺辛四磷酸盐信号被规范化为总信号，而不是报告绝对值，因为放射性基质的移液误差或衰变会影响样品中的总信号，但不影响酶活性。此处显示的是使用纯化 C.diffile RSH 进行的反应的实际 TLC 板。不含蛋白质的控制反应允许定量未分层的ATP水解，而空白通道允许精确的信号定量。在ATP和瓜诺辛-四磷酸盐点中，该酶将放射性磷酸盐从ATP基质转移到GDP前体，产生放射性瓜诺辛四磷酸盐。这证实，从C.difficile的假设瓜诺辛四磷酸盐合成是一种活性酶。通过每隔一段时间对反应进行采样，可以观察到进展。在这里，在每个时间点都观察到原始信号。ATP 正在减少，瓜诺辛四磷酸盐正在增加。此处显示的是规范化数据。错误条要小得多，因为规范化导致任何移液错误。尝试此程序时，必须小心不要刮伤 TLC 板上的树脂，因为这可能干扰溶剂迁移。这是一种非常易访问的技术，具有直接的数据分析，可以快速提供强大的酶活性定量。我们已经用它来证实，梭菌化合物瓜诺辛四磷酸盐，这是从来没有报道过。不要忘记，使用放射性操作可能极其危险，在执行此过程时，您必须遵守机构关于放射性物质的存储和使用的规则。该方法可以提供对瓜诺辛四磷酸盐合成的洞察，但它也可以应用于其他磷转移反应，包括蛋白质激酶活性和环状二甘酸酯合成。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Purification and In Vitro Activity Assay for a (p)ppGpp Synthetase from Clostridium difficile

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

在体外生物膜的形成以及8商会幻灯片

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. ...

科研

免疫与感染

Measurement of Factor V Activity in Human Plasma Using a Microplate Coagulation Assay

测量人体血浆中的凝血因子V活性，用酶联凝固分析

 In response to injury, blood coagulation is activated and results in generation of the clotting protease, thrombin. Thrombin cleaves fibrinogen to fibrin ...

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

唾液，唾液腺，淋巴收集肩突硬蜱蜱

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

Culturing and Maintaining Clostridium difficile in an Anaerobic Environment

Culturing and Maintaining Clostridium difficile in an Anaerobic Environment

培养和维护<em&gt;难辨梭状芽孢杆菌</em&gt;在厌氧环境

Clostridium  difficile is a Gram-positive, anaerobic, sporogenic bacterium  that is primarily responsible for antibiotic associated diarrhea (AAD) and is ...

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

体外 共生分析评估病原体诱导中性粒细胞跨上皮迁移

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

分离，鉴定和小鼠胸腺上皮细胞的分离纯化

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

RNA纯化在细胞内生长<em&gt;李斯特菌</em&gt;巨噬细胞

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

人全血中NK细胞杀伤活性的流式细胞仪分析

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Cefoperazone-treated Mouse Model of Clinically-relevant Clostridium difficile Strain R20291

Cefoperazone-treated Mouse Model of Clinically-relevant Clostridium difficile Strain R20291

头孢哌酮治疗小鼠模型的临床相关的<em&gt;艰难梭菌</em&gt;应变R20291

Clostridium difficile is an anaerobic, gram-positive, spore-forming enteric pathogen that is associated with increasing morbidity and mortality and ...

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

表征形态变化的议定书<em&gt;艰难梭菌</em&gt;应对抗生素治疗

Assessment of antibiotic action with new drug development directed towards anaerobic bacteria is difficult and technically demanding. To gain insight into ...